柔肝化纖顆粒對CCl4誘導的肝纖維化大鼠肝臟 MMP-2、TIMP-2的影響

王振常，楊刪，黃晶晶，呂健林

論著·基礎

柔肝化纖顆粒對CCl4誘導的肝纖維化大鼠肝臟 MMP-2、TIMP-2的影響

王振常，楊刪，黃晶晶，呂健林

柔肝化纖顆粒；肝纖維化；基質金屬蛋白酶-2；基質金屬蛋白酶-2抑制劑；大鼠

細胞外基質(extracelluar matrix,ECM)降解減少、沉積過多是肝纖維化重要的形成機制之一，基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)具有可降解大部分ECM成分的作用，MMP與其抑制劑(tissue inhibitor of matrix metalloproteinase，TIMP)的表達在調控ECM的合成與降解中起著關鍵作用，MMP與TIMP失衡會引起ECM在肝內的代謝異常而導致肝纖維化形成[1]，從調節(jié)ECM合成與降解平衡方面進行肝纖維化的防治可獲得較好療效。柔肝化纖顆粒是在已故全國名老中醫(yī)林沛湘教授治療慢性肝炎、肝炎肝硬化有效驗方組方(壯肝逐瘀煎)基礎上經模糊數(shù)學優(yōu)化而成，經過多年臨床實踐其有效性毋庸置疑[2]?，F(xiàn)觀察柔肝化纖顆粒對肝纖維化大鼠肝臟MMP-2和TIMP-2蛋白分布及表達的影響，為闡明其抗肝纖維化作用的機制提供實驗依據。

1 材料與方法

1.3 觀測項目 各組于用藥治療后5周、10周，禁食12 h，隨機選取8只大鼠稱體質量，經1%戊巴比妥麻醉，股靜脈采血(血清于-70℃冰箱內保存?zhèn)錂z測)，而后處死剖取肝臟，取肝臟右葉相同部位組織1塊置入10%甲醛中，作常規(guī)石蠟切片，將余下肝臟于液氮中速凍，-196℃保存，以備肝組織勻漿測Hyp(羥脯氨酸)、提取mRNA及RT-PCR分析用。肝組織切片免疫組織化學染色及計算機圖像分析技術檢測IV膠原、MMP-2及TIMP-2。采用半定量RT-PCR法分析肝組織MMP-2、TIMP-2 mRNA的表達差異。取PCR產物和PCR Markers各10μl，加緩沖液，瓊脂糖凝膠電泳，溴乙錠染色，紫外透射反射分析儀下觀察并攝像，圖像分析軟件分析電泳條帶的面積和光密度，以平均值代表相應基因的表達量，并除以相應β-actin的mRNA平均值，即為MMP-2及TIMP-2的相對表達量。肝組織病理學觀察及肝纖維化程度半定量檢測參照文獻[3]進行。

2 結 果

2.1 肝組織炎性反應活動度和肝纖維化變化 實驗結束時處死大鼠為有效動物，B組大鼠肝組織炎性反應活動度計分、肝纖維化程度計分均較A組升高(P<0.05)；與B組比較，治療后C、D、E組大鼠肝組織炎性反應活動度、肝纖維化程度計分均明顯降低(P<0.05)；與C組比較，D、E組2指標升高(P<0.05)；D、E組間比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 各組大鼠各時間段肝組織炎性反應活動度及肝纖維化程度計分

注：與A組比較，*P<0.05；與B組比較，#P<0.05；與C組比較，△P<0.05

2.2 肝組織內MMP-2、TIMP-2變化 與A組比較，B組MMP-2、TIMP-2、 MMP-2/TIMP-2水平明顯升高(P<0.05)；與B組比較，治療后C、D、E組上述3項指標降低(P<0.05)；與C組比較，D、E組上述3項指標增高(P<0.05)，而D、E組間比較，差異無統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 各組大鼠各時間段肝組織內MMP-2、TIMP-2表達水平變化

注：與A組比較，*P<0.05；與B組比較，#P<0.05；與C組比較，△P<0.05

3 討 論

總之，柔肝化纖顆粒能明顯降低CCl4誘導的肝纖維化大鼠肝臟MMP-2、TIMP-2的表達，維持MMP-2/TIMP-2之間的平衡，一方面降低MMP-2有助于減少基底膜破壞、維持肝臟組織正常結構和功能，另一方面TIMP-2表達減少有利于減少對MMP的抑制，從而促進ECM降解、防治肝纖維化。此外，我們的前期研究還發(fā)現(xiàn)其具有減少肝組織激活素A(ACTA)表達、提高血清卵泡抑素(FS)水平[15，16]的作用，從而減少肝細胞凋亡、促進肝細胞再生，說明柔肝化纖顆?？垢卫w維化的作用機制可能是多方面的，這為其臨床應用提供了有力的理論依據。

1 Roy SC,Ghosh J.Dynamic in vivo changes in the activities of gelatinases,matrix metalloproteinases(MMPs),andtissue inhibitor of metalloproteinases(TIMPs) in buffalo(Bubalus bubalis)uterine luminal fluidduring estrous cycle andearly pregnancy[J].Mol ReprodDev,2010,77(11):944-953.

2 楊刪，王婷，王振常.柔肝化纖顆粒對肝纖維化大鼠FS表達的影響[J].廣西中醫(yī)藥，2011,34(4)：55-57.

3 王泰齡，劉霞，周元平，等.慢性肝炎炎癥活動度及肝纖維化程度計分方案[J].中華肝臟病雜志，1998，6(4)：195-197.

4 章培軍，邢雁霞，劉斌鈺，等.枸杞多糖對實驗性肝損傷保護作用的研究[J].中國藥物與臨床，2011,11(11)：1286-1287.

5 李超彥，周媛媛，王福青，等.黃精多糖對順鉑致肝損害大鼠肝功能的保護及抗氧化指標的影響[J].中國實驗方劑學，2013,19(16)：229-231.

6 時代音，王銳利，劉曉丹.黃芪湯對大鼠酒精性肝纖維化的保護作用[J].陜西中醫(yī)，2011,32(5)：623-624.

7 肖鳳霞，張旭倩，鄧少東，等.毛橘紅總黃酮對酒精性肝損傷大鼠肝組織病理的影響[J].中藥新藥及臨床藥理，2012,23(6)：615-619.

8 鮑紅月,陳子越,楊波，等.虎杖提取物對小鼠急性肝損傷的保護作用[J].海峽藥學，2011,23(7)：40-42.

9 楊勇進, 張翠萍, 張民生,等.牡蠣提取物對酒精性肝損傷大鼠IL-17與TNF-α的影響[J].世界華人消化雜志，2011,19(2)：177-180.

10 王振常,黃晶晶,夏蘭,等.柔肝化纖顆粒聯(lián)合普萘洛爾對肝硬化門脈高壓患者血流動力學的影響[J].時珍國醫(yī)國藥,2013,24(3):726-727.

11 王金周，程傳浩.疏肝健脾湯對肝纖維化大鼠基質金屬2、TIMP-2影響的研究[J].中醫(yī)學報，2010，25(4)：684-686.

12 劉云霞，姚立，姚勇偉，等.益氣補腎方對SGC-7901細胞MMP-2和TIMP-2基因表達的影響[J].中華中醫(yī)藥學刊，2011,29(7)：1639-1642.

13 陳江，章榮華，吳蕙嶺，等.實驗性肝纖維化形成和逆轉過程中MMP-2及其抑制物TIMP-2表達的動態(tài)研究[J].中國衛(wèi)生檢驗雜志，2010,20(10)：2401-2406.

14 張京紅，盧振，方哲平.肝臟B超形態(tài)學變化、MMP-2及TIMP-2水平與肝纖維化分期的關系[J].中國現(xiàn)代醫(yī)生,2013,51(17)：58-60.

15 王振常,朱智德,楊刪,等.柔肝化纖顆粒對肝纖維化大鼠ACTA表達的影響[J].時珍國醫(yī)國藥,2012,23(11):2705-2707.

16 楊刪,王婷,王振常.柔肝化纖顆粒對肝纖維化大鼠FS表達的影響[J].廣西中醫(yī)藥,2011,34(4):55-57.

EffectsofRouganhuaxianparticleonMMP-2andTIMP-2inratsmodelofliverfibrosisinducedbyCCl4

WANGZhenchang*,YANGShan,HUANGJingjing,LVJianlin.

*LiverCenter,theFirstAffiliatedHospitalofGuangxiMedicalUniversity,Guangxi,Nanning530023,China

ObjectiveTo investigate the effects ofRouganhuaxianparticle on MMP-2 andTIMP-2 in rats model of liver fibrosis inducedby CCl4.MethodsSelect healthy andclean SPF level rats (n=78), they were randomly dividedinto normal control group (A group), pathological model group (B group),Rouganhuaxianparticle group (C group),Dahuangzhechongpill group (dgroup) andcolchicine control group (E group), the latter four groups were establishedCCl4-inducedliver fibrosis in rats, andthen were given saline,Rouganhuaxianparticles,Dahuangzhechongpills, colchicine gavage for 5 weeks and10weeks, respectively, after taking rat liver tissue, using immunohistochemical staining andcomputer image analysis to detect MMP-2 andTIMP-2.ResultsTreatment for 5 weeks, 10weeks comparedwith group A,B group liver inflammation activity meter points, liver fibrosis scores were significantly higher (P<0.05), C, D, E group was significantly lower than group B(P<0.05), where C group was significantly decreasedcomparedwith D, E group(P<0.05), while no statistically significant difference between the groups D, E (P>0.05);andcomparedwith A group, B group MMP-2, TIMP-2, MMP-2/TIMP-2 were significantly higher(P<0.05); comparedwith group B,group C, D, E MMP-2, TIMP-2 expression andMMP-2/TIMP-2 significantly decreased(P<0.05), C group decreasedmore obvious comparedwith D, E groups (P<0.05), while no statistically significant difference between the groups D, E (P>0.05).ConclusionRouganhuaxianparticle can prevent andcure liver fibrosis through regulate the ratio of MMP-2/TIMP-2.

Rouganhuaxianparticle; Liver fibrosis; MMP-2; TIMP-2；Rats

廣西自然科學基金項目(No.2010GXNSFA013211)

530023 南寧，廣西中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院肝病中心(王振常、黃晶晶、呂健林)，530007 廣西中醫(yī)醫(yī)藥大學(楊刪)

10.3969 / j.issn.1671-6450.2014.01.026

2013-09-18)