聯(lián)苯菊酯與腫瘤相關(guān)DNA相互作用的光譜研究*

卜曉陽，李 萍，何寶佳，楊小弟

(1.皖南醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)院，安徽 蕪湖241002；2.南京師范大學(xué) 化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院，江蘇 南京210097)

聯(lián)苯菊酯(Bifenthrin，結(jié)構(gòu)式見圖1)是一種典型的擬除蟲菊酯類農(nóng)藥，此類農(nóng)藥因具有高效、安全、廣譜等特點(diǎn)，被廣泛使用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和家庭生活中.擬除蟲菊酯農(nóng)藥作為一種神經(jīng)毒物，其作用機(jī)制一直是毒理學(xué)研究的熱點(diǎn).研究發(fā)現(xiàn)多種疾病的發(fā)生與擬除蟲菊酯農(nóng)藥的暴露有關(guān)，它具有一定的慢性毒性，是人類健康潛在的威脅物［1-2］.有些擬除蟲菊酯農(nóng)藥品種甚至有致癌、致畸、致基因突變作用［3-4］.腫瘤的發(fā)生大部分是與人體內(nèi)某些基因的異常表達(dá)有關(guān).p53 DNA是一種腫瘤抑制基因，人體中功能正常的p53 DNA能阻止多種腫瘤發(fā)生，而p53 DNA自身結(jié)構(gòu)的改變是導(dǎo)致其抑癌功能喪失的主要原因［5］.另外，C-myc DNA是一種癌基因，能促進(jìn)細(xì)胞分裂，研究表明多種腫瘤疾病中都發(fā)現(xiàn)有C-myc DNA的表達(dá)異常［6-7］.

圖1 聯(lián)苯菊酯的結(jié)構(gòu)式(BF)

本文主要利用光譜學(xué)手段探討聯(lián)苯菊酯與兩種腫瘤基因之間的作用機(jī)制，主要是研究兩者之間的作用模式和對DNA空間結(jié)構(gòu)的影響，以期從分子水平上了解聯(lián)苯菊酯對人類腫瘤相關(guān)基因的影響，為揭示農(nóng)藥生物毒理性和腫瘤疾病的預(yù)防和治療提供新的線索.

1 實(shí)驗部分

1.1 儀器與試劑

Cary-5000紫外光譜儀(美國Varian公司)；LS50B型熒光光譜儀(美國 Perkin Elmer公司)；SevenMulti pH離子綜合測試儀(瑞士Mettler Toledo公司)；HH-2數(shù)顯式恒溫水浴鍋(常州國華電器公司).實(shí)驗所用DNA(上海生工生物技術(shù)公司)序列為：p53 DNA ss1：5′-CCTCCTCCCCAACTCC-3′；ss2：3′-GGAGGAGGGGTTGAGG-5′；C-myc DNA：ss1：5 ′-GGGAGGGTGGGGAAGG-3 ′；ss2：3 ′-CCCTCCCACCCCTTCC-5.聯(lián)苯菊酯為標(biāo)準(zhǔn)品(德國Dr.Ehrenstorfer公司)；溴化乙啶(EB)(上海生工生物技術(shù)公司)；其它試劑均為分析純；水為娃哈哈純凈水.

1.2 雙鏈DNA的配置

用2條互補(bǔ)單鏈DNA(5×10-4mol/L)配置成雙鏈DNA的磷酸鹽緩沖液(0.5mol/L，pH=7.3)，在85℃下，退火12min，緩慢冷卻到25℃，得到雙鏈DNA溶液濃度為5×10-4mol/L.

1.3 實(shí)驗方法

紫外光譜實(shí)驗：用0.1mol/L磷酸鹽緩沖液(pH=7.3)配制聯(lián)苯菊酯溶液，得到聯(lián)苯菊酯溶液濃度為1.0×10-4mol/L和5.0×10-4mol/L，逐漸將不同體積的聯(lián)苯菊酯溶液滴加到500μL濃度為5.0×10-6mol/L DNA的磷酸鹽緩沖液(pH=7.3)中，使DNA與聯(lián)苯菊酯的摩爾比為4：1～1：4，測量DNA溶液在190～500nm處紫外吸收光譜的變化.參比溶液為0.1mol/L磷酸鹽緩沖液(pH=7.3).

變溫實(shí)驗：將5.0×10-6mol/L的DNA溶液和5.0×10-4mol/L的聯(lián)苯菊酯溶液等摩爾混合，在37℃下恒溫3h，然后進(jìn)行程序升溫.參比溶液為0.1mol/L磷酸鹽緩沖液.測定在25～90℃溫度范圍內(nèi)溶液在260nm處的吸光度(A260nm).升溫速率為2℃/min.

EB-DNA熒光猝滅實(shí)驗：將DNA與EB溶液混合得到EB-DNA混合體系，再分別加入不同劑量的聯(lián)苯菊酯溶液，使聯(lián)苯菊酯與DNA的摩爾比為1：1 ～8：1，測定聯(lián)苯菊酯加入后對 EB-DNA 體系的熒光影響情況.熒光激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度均為5nm.

離子強(qiáng)度影響實(shí)驗：將DNA與EB、NaCl三種溶液混合，得到NaCl-EB-DNA的三元溶液體系，滴加不同體積的聯(lián)苯菊酯溶液，使聯(lián)苯菊酯與DNA摩爾比為1：1～8：1，測其對該三元溶液體系的熒光影響.與EB-DNA體系的猝滅效應(yīng)作比較.熒光激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度均為5nm.

2 結(jié)果與討論

2.1 聯(lián)苯菊酯與DNA相互作用的紫外滴定實(shí)驗

將不同體積的聯(lián)苯菊酯逐漸滴加至DNA溶液中，DNA溶液的紫外吸收光譜變化如圖2所示.由圖可見，隨著DNA與聯(lián)苯菊酯的濃度比從4：1遞減至1：4，DNA在260nm處的特征吸收峰呈減色效應(yīng)，但吸收峰的位置無明顯位移，一般來說，對于典型的嵌插，由于DNA的π電子和小分子的π電子會發(fā)生堆積作用，可出現(xiàn)紫外減色效應(yīng)和紅移現(xiàn)象，如果是靜電或溝槽作用就會表現(xiàn)為吸收峰小幅紅移但強(qiáng)度無明顯改變.圖中，聯(lián)苯菊酯加入后，DNA的紫外吸收峰呈有規(guī)律的減色但無紅移現(xiàn)象，這說明聯(lián)苯菊酯和兩種DNA之間均存在相互作用，但并非完全的嵌插作用，可能為較弱的部分嵌插.

圖2 DNA與聯(lián)苯菊酯按4：1～1：4濃度比混合后溶液的紫外吸收光譜A：p53 DNA；B：C-myc DNA

2.2 聯(lián)苯菊酯與DNA相互作用的紫外升溫實(shí)驗

DNA熔點(diǎn)溫度(Tm)的變化可以用來判斷其雙螺旋結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性.小分子與DNA結(jié)合模式會影響DNA的Tm.典型的嵌插作用能提高DNA雙螺旋穩(wěn)定性，會使其Tm值升高7～8℃；本實(shí)驗中，在25～90℃范圍內(nèi)，通過紫外光譜儀的程序升溫，測定聯(lián)苯菊酯加入前后DNA在260nm處紫外吸收峰強(qiáng)度的變化，并利用Boltzmann函數(shù)擬合計算出DNA的解鏈溫度Tm，結(jié)果如表1所示.由表1看出，聯(lián)苯菊酯的加入使p53 DNA的Tm升高3.6℃；使C-myc DNA的Tm升高1.9℃，這可能由于聯(lián)苯菊酯以弱的嵌插作用與兩種DNA作用，一定程度上增強(qiáng)了DNA結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性.并且p53 DNA的Tm變化較C-myc DNA的更大，說明聯(lián)苯菊酯與p53 DNA的結(jié)合能力更強(qiáng).

表1 加入有機(jī)氯農(nóng)藥分子前后的DNA的Tm值

2.3 聯(lián)苯菊酯與DNA相互作用的EB-DNA熒光猝滅實(shí)驗

溴化乙錠(EB)是一種熒光染料，它能典型地嵌入雙螺旋DNA的堿基對中使其熒光顯著增強(qiáng).本實(shí)驗利用EB作為p53 DNA和C-myc DNA的熒光探針，向EB-DNA溶液中逐步加入聯(lián)苯菊酯，根據(jù)EB-DNA體系是否發(fā)生熒光猝滅來判斷聯(lián)苯菊酯能否競爭置換出EB，從而與DNA發(fā)生嵌插作用.聯(lián)苯菊酯與EB-DNA體系的熒光猝滅圖譜見圖3.

圖3 聯(lián)苯菊酯與EB-DNA熒光猝滅圖譜

由圖可見，聯(lián)苯菊酯加入后，EB-DNA體系的熒光逐漸減弱，當(dāng)DNA與聯(lián)苯菊酯的摩爾比從1：1減小到1：8時，EB-p53體系發(fā)生25.43%的猝滅，EB-C-myc體系發(fā)生22.89% 的猝滅，當(dāng)聯(lián)苯菊酯濃度繼續(xù)增大后，EB-DNA體系熒光無明顯減小，這說明聯(lián)苯菊酯對EB的競爭作用已達(dá)飽和，聯(lián)苯菊酯無法完全競爭出嵌插進(jìn)DNA中的EB，只能發(fā)生部分嵌插作用.

由 Stern-Volmer方程(F0/F=1+Kq·τ0［Q］，F(xiàn)0為EB-DNA系的初始熒光強(qiáng)度，F(xiàn)為EB-DNA體系加入聯(lián)苯菊酯溶液后的最終熒光強(qiáng)度，Kq為猝滅速率，［Q］為猝滅劑濃度，τ0為生物分子的熒光壽命，約為10ns)計算相關(guān)常數(shù)(Ksv：猝滅常數(shù)；Kq：猝滅速率；n：結(jié)合位點(diǎn)數(shù))，結(jié)果見表2.表中聯(lián)苯菊酯與EB-DNA體系結(jié)合位點(diǎn)均小于1，猝滅常數(shù)較小等數(shù)據(jù)進(jìn)一步證實(shí)聯(lián)苯菊酯與DNA為弱的部分嵌插結(jié)合.

表2 聯(lián)苯菊酯與EB-DNA體系作用的相關(guān)常數(shù)

2.4 聯(lián)苯菊酯與DNA相互作用的離子強(qiáng)度影響實(shí)驗

紫外滴定實(shí)驗和EB-DNA競爭實(shí)驗的結(jié)果表明聯(lián)苯菊酯與DNA之間存在著嵌插作用，而小分子與DNA的相互作用有可能受多種作用的共同影響.當(dāng)小分子與DNA之間是以靜電作用時，改變離子強(qiáng)度，引入的帶電正離子可以中和DNA磷酸骨架上的負(fù)電荷，競爭了小分子與DNA的嵌插作用，從而減弱熒光猝滅程度.因此可以在熒光實(shí)驗中改變?nèi)芤旱碾x子強(qiáng)度，以此來判斷小分子與DNA分子之間是否有靜電作用.本實(shí)驗利用強(qiáng)電解質(zhì)NaCl來控制聯(lián)苯菊酯與DNA體系的離子強(qiáng)度，實(shí)驗結(jié)果如表3所示.表中猝滅率(Quenching rate)=(F0-F)/F0×100%，其中F0為NaCl-EB-DNA的初始熒光強(qiáng)度，F(xiàn)為NaCl-EB-DNA體系加入聯(lián)苯菊酯溶液后的最終熒光強(qiáng)度.

表3 NaCl對聯(lián)苯菊酯與EB-DNA體系作用的影響

結(jié)果表明，加入NaCl以后，兩種DNA體系均增大了3%左右，說明加入NaCl增強(qiáng)了聯(lián)苯菊酯對EB-DNA體系的猝滅行為.這說明離子強(qiáng)度沒有競爭影響聯(lián)苯菊酯與DNA間的結(jié)合作用，它們之間不存在靜電作用，可能由于加大離子強(qiáng)度為聯(lián)苯菊酯提供了更好的疏水環(huán)境，這樣有利于聯(lián)苯菊酯與DNA雙螺旋之間的嵌插作用，導(dǎo)致了熒光猝滅現(xiàn)象輕微的加強(qiáng).

3 結(jié)論

運(yùn)用紫外和熒光光譜法探討聯(lián)苯菊酯與兩種腫瘤相關(guān)DNA之間的相互作用，紫外滴定實(shí)驗結(jié)果出現(xiàn)減色現(xiàn)象和無明顯紅移，表明聯(lián)苯菊酯和DNA之間可能是非完全的嵌插作用.紫外變溫實(shí)驗表明，聯(lián)苯菊酯的結(jié)合能引起DNA熔點(diǎn)溫度升高，增強(qiáng)了DNA分子的熱穩(wěn)定性.EB競爭實(shí)驗進(jìn)一步證明DNA與聯(lián)苯菊酯是部分嵌插結(jié)合；離子強(qiáng)度實(shí)驗說明聯(lián)苯菊酯與DNA之間不存在靜電作用.綜上所述，聯(lián)苯菊酯與兩種腫瘤相關(guān)DNA均以弱的嵌插作用結(jié)合，且與p53 DNA的結(jié)合能力稍強(qiáng)于與C-myc DNA的結(jié)合能力.

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