Cdc25a在跨種屬肝癌組織中的表達(dá)及其意義*

盧曉旭， 曹 驥， 李 瑗， 孫 雯， 朱伶群， 楊 春， 蘇建家

(廣西壯族自治區(qū)腫瘤防治研究所，廣西 南寧 530021)

肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC; 以下簡(jiǎn)稱肝癌)是我國(guó)最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，其發(fā)生發(fā)展是一個(gè)涉及多因素、多階段、多基因變異積累的復(fù)雜演變過(guò)程，如何尋找共識(shí)的肝癌關(guān)鍵分子是目前早期診斷和靶向治療肝癌的基礎(chǔ)之一?？绶N屬篩選腫瘤基因策略[1]指通過(guò)探索比較某些腫瘤在不同種屬的基因表達(dá)譜中共同擁有的基因改變，篩選出該腫瘤發(fā)生發(fā)展中起關(guān)鍵作用的分子。本研究應(yīng)用跨種屬腫瘤基因篩選策略，結(jié)合前期研究[2-3]，通過(guò)基因富集及meta分析方法，從5套不同種屬的肝癌基因表達(dá)芯片中篩選出細(xì)胞周期通路中的細(xì)胞分裂周基蛋白25a(cell division cycle 25a protein,Cdc25a)等差異表達(dá)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的基因，通過(guò)采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR及Western blotting方法檢測(cè)其在人、嚙齒類動(dòng)物大鼠和低等靈長(zhǎng)類動(dòng)物樹(shù)鼩3個(gè)種屬的肝癌、癌旁及正常肝組織中的表達(dá)，以驗(yàn)證前期生物信息學(xué)分析的結(jié)果，并探討Cdc25a在肝癌發(fā)生發(fā)展中的可能作用及意義。

材 料 和 方 法

1 標(biāo)本收集

1.1人肝組織標(biāo)本 收集廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院2009年1月～2011年12月手術(shù)切除并經(jīng)病理證實(shí)的38例肝癌及對(duì)應(yīng)癌旁組織(距離腫瘤邊緣2 cm以外)和10例正常肝組織，正常肝組織來(lái)源于肝良性占位病變經(jīng)手術(shù)切除者。肝癌病人術(shù)前均無(wú)放療化療史，患者年齡在24～70歲，中位年齡47.5歲。術(shù)后隨訪1年期間，出現(xiàn)術(shù)后復(fù)發(fā)共20例。

1.2大鼠和樹(shù)鼩肝組織標(biāo)本 課題組前期項(xiàng)目已建立用黃曲霉毒素B1誘導(dǎo)肝癌的大鼠及樹(shù)鼩動(dòng)物模型。此次實(shí)驗(yàn)取大鼠肝癌及其相應(yīng)癌旁組織各15例、正常肝組織14例，以及樹(shù)鼩肝癌及其相應(yīng)癌旁組織10例、正常肝組織10例。所有組織均為手術(shù)切除后先經(jīng)液氮速凍然后轉(zhuǎn)移到-80 ℃；肝癌標(biāo)本均經(jīng)病理組織學(xué)檢查證實(shí)。

2 主要試劑與儀器

RNA提取試劑Trizol購(gòu)自Invitrogen，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自Fermentas，引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。PCR產(chǎn)物純化采用杭州博日公司的Biospin膠回收試劑盒，熒光定量試劑盒為TaKaRa寶生物工程(大連)有限公司的SYBR? Premix Ex TaqTM(Perfect Real Time) 試劑盒。Cdc25a Ⅰ抗購(gòu)自Abcam，GAPDH Ⅰ抗購(gòu)自北京中杉金橋公司，熒光紅外Ⅱ抗購(gòu)自LI-COR。實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀為ABI生產(chǎn)的ABI StepOneTM，Odyssey紅外熒光成像儀為L(zhǎng)I-COR產(chǎn)品。

3 方法

3.1實(shí)時(shí)熒光定量PCR 采用Trizol試劑提取組織總RNA；經(jīng)微量核酸測(cè)定儀檢測(cè)，A260/A280在1.8～2.0之間為合格；以1.0%瓊脂糖電泳和凝膠成像系統(tǒng)檢測(cè)所提取的總RNA的完整性；取檢驗(yàn)合格的RNA，按Fermentas公司逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行cDNA合成，產(chǎn)物于-20 ℃保存。根據(jù)熒光定量PCR引物設(shè)計(jì)原則，應(yīng)用Primer Premier 5.0和DNAMAN軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì)。Cdc25a上、下游引物序列分別為5′-CCAAAGGAACCATTGAGAAC-3′和5′-CAGATGCCATAATTTCTGGAG-3′，產(chǎn)物長(zhǎng)度為138 bp；內(nèi)參照基因GAPDH上、下游引物序列分別為5′-AAGAAGGTGGTGAAGCAGGC-3′和5′-ACCACCCTGTTGCTGTAGCC-3′， 產(chǎn)物長(zhǎng)度為200 bp。

根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)，采用20 μL反應(yīng)體系分別以Cdc25a和GAPDH引物進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)體系含：SYBR? Premix Ex Taq (2×)10 μL，PCR引物(10 μmol/L)各0.4 μL，ROX reference dye(50×)0.4 μL，滅菌去離子水6.8 μL，cDNA模板2 μL。反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性30 s; 95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，40個(gè)循環(huán)。同時(shí)，分別構(gòu)建Cdc25a和GAPDH的標(biāo)準(zhǔn)曲線，并設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品的梯度稀釋拷貝數(shù)。PCR擴(kuò)增結(jié)束后，分析儀即顯示標(biāo)準(zhǔn)曲線、擴(kuò)增曲線和熔解曲線，根據(jù)各自標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出待測(cè)樣本中初始mRNA相對(duì)表達(dá)量。計(jì)算各組Cdc25a與對(duì)應(yīng)內(nèi)參照基因GAPDH相對(duì)mRNA表達(dá)量的比值，得到肝癌組、癌旁組和正常組3組數(shù)據(jù)作為Cdc25a mRNA的相對(duì)表達(dá)量。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送北京諾賽基因組研究中心有限公司測(cè)序，并將測(cè)序結(jié)果在NCBI的BLAST中進(jìn)行比對(duì)。

3.2Western blotting檢測(cè)Cdc25a蛋白 分別取各例組織樣本50～100 mg, 常規(guī)方法提取總蛋白，加入上樣緩沖液煮沸變性，加樣進(jìn)行SDS-PAGE，轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉2 h，洗膜；加Ⅰ抗(Cdc25a工作液濃度 1∶100，GAPDH工作液濃度1∶1 000)，過(guò)夜孵育，洗膜；加熒光Ⅱ抗(工作液濃度1∶10 000)，室溫避光孵育1 h，洗膜；以O(shè)dyssey紅外熒光成像儀掃描圖像。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件處理。數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示；多組間均數(shù)的比較采用單因素方差分析(One-way ANOVA)；以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 總RNA質(zhì)量及基因測(cè)序

所有樣本總RNA的A260/A280比值在1.8～2.0之間，瓊脂糖凝膠電泳后成像顯示28S、18S和5S條帶清晰，提示總RNA質(zhì)量較好。PCR產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果良好，所得序列經(jīng)BLAST比對(duì)顯示各序列的同源性一致，即擴(kuò)增產(chǎn)物序列與設(shè)計(jì)序列一致。

2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)

Cdc25a和GAPDH的標(biāo)準(zhǔn)曲線決定系數(shù)(R2)分別為0.999和0.997，提示直線擬合度良好；斜率(slope)分別為-3.423和-3.614，提示其可在較寬廣的范圍內(nèi)進(jìn)行定量分析。擴(kuò)增曲線均呈S型，有明顯的指數(shù)擴(kuò)增期和平臺(tái)期，曲線走行光滑，顯示擴(kuò)增結(jié)果理想。熔解曲線峰形窄而尖，峰單一無(wú)雜峰，說(shuō)明擴(kuò)增產(chǎn)物特異性良好，見(jiàn)圖1。

Figure 1. Real-time fluorescence quantitative PCR melting curves of Cdc25a and GAPDH.

3 Cdc25a mRNA在人、大鼠和樹(shù)鼩的肝癌、癌旁和正常肝組織中的表達(dá)

實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示，人肝癌組織Cdc25a mRNA表達(dá)量為0.00425±0.00241，高于其對(duì)應(yīng)的癌旁組織(0.00086±0.00081)及正常肝組織(0.00038±0.00032)，差別均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；癌旁組織與正常組的差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。Cdc25a mRNA表達(dá)量在大鼠肝癌組織為0.00281±0.00278，高于其對(duì)應(yīng)的癌旁組織(0.00044±0.00035)及正常肝組織(0.00051±0.00022)，差別均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；癌旁組織與正常組織的差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。Cdc25a mRNA表達(dá)量在樹(shù)鼩肝癌組織為0.00043±0.00021，高于正常肝組織(0.00022±0.00010)，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；癌旁組織(0.00028±0.00017)與對(duì)應(yīng)的肝癌組織及正常肝組織比較，差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)圖2。

4 HCC組織中Cdc25a mRNA表達(dá)與臨床參數(shù)的關(guān)系

由表1可見(jiàn)，Cdc25a在人肝癌組織中的檢出率與臨床分期、門靜脈癌栓及肝外轉(zhuǎn)移明顯相關(guān)，而與術(shù)后復(fù)發(fā)、腫瘤直徑、腫瘤數(shù)目、血清甲胎蛋白水平及腫瘤分化程度無(wú)明顯關(guān)系。

5 Cdc25a蛋白在肝癌組織、癌旁組織和正常肝組織中的表達(dá)

在預(yù)染色蛋白約36 kD及59 kD處分別可見(jiàn)內(nèi)參照GAPDH及Cdc25a特異性蛋白條帶，但目的蛋白Cdc25a在人正常肝組織、大鼠癌旁及正常肝組織和樹(shù)鼩癌旁及正常肝組織處未掃描到條帶。Cdc25a在人肝癌組織中的平均表達(dá)量(0.339±0.239)明顯高于其在對(duì)應(yīng)癌旁組織中的平均相對(duì)表達(dá)量(0.0609±0.0498)，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；在人、大鼠和樹(shù)鼩的肝癌組織中，Cdc25a的條帶明顯強(qiáng)于癌旁及正常肝組織，與Cdc25a mRNA在肝癌組織的高表達(dá)一致，見(jiàn)圖3。

Figure 2. The mRNA expression of Cdc25a in the HCC tissues, HCC-adjacent liver tissues and normal liver tissues of humans, rats and tree shrews.Mean±SD.*P<0.05 vs HCC tissues.

Figure 3. Western blotting analysis of Cdc25a protein levels in human (A), rat (B) and tree shew (C) hepatocellular carcinoma tissues. 1, 3: HCC tissues; 2, 4: adjacent liver tissues of HCC; 5, 6: normal liver tissues.

討 論

幾乎所有的癌癥都表現(xiàn)為細(xì)胞周期的紊亂和不規(guī)則，例如調(diào)控細(xì)胞周期分子的缺失、過(guò)表達(dá)及突變[4]。細(xì)胞周期活性的控制機(jī)制主要通過(guò)周期蛋白依賴性蛋白激酶(cyclin-dependent kinases, CDKs)、周期蛋白(cyclins)及周期蛋白依賴性蛋白激酶抑制因子(CDK inhibitors, CKIs)蛋白調(diào)控。Cdc25磷酸酶在CDKs去磷酸化激活中起重要作用。Cdc25a作用于cyclin A/CDK2和cyclin E/CDK2，促進(jìn)細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期[5]。Cdc25a作為可活化在細(xì)胞周期調(diào)控中起核心作用的CDK/cyclin復(fù)合體的因子，其過(guò)表達(dá)可導(dǎo)致細(xì)胞周期調(diào)控紊亂及對(duì)DNA損傷不應(yīng)答引起細(xì)胞異常增殖，甚至腫瘤的發(fā)生。

Cdc25a在多種惡性腫瘤[6-8]中呈現(xiàn)高表達(dá)，且許多實(shí)驗(yàn)證實(shí)了其與腫瘤的惡性程度和預(yù)后差有關(guān)，但是Cdc25a在肝癌組織的表達(dá)和臨床意義在國(guó)內(nèi)還鮮有報(bào)道。2003年Xu等[9]用RT-PCR、免疫組化及Western blotting等方法在mRNA及蛋白水平上檢測(cè)了肝癌組織中Cdc25a的高表達(dá)情況，分別為：69%(9/13)、56%(33/59)及78%(46/59)，并且在免疫組化方法檢測(cè)時(shí)，發(fā)現(xiàn)Cdc25a蛋白的高表達(dá)與腫瘤低分化、門脈癌栓轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)。本研究利用熒光定量PCR和Western blotting檢測(cè)方法發(fā)現(xiàn)Cdc25a在人肝癌組織中轉(zhuǎn)錄和翻譯水平上均呈高表達(dá)，與之前Xu等[9]的研究結(jié)果相符合。本研究利用Western blotting檢測(cè)Cdc25a蛋白水平時(shí)，發(fā)現(xiàn)其在癌旁組織及正常肝組織條帶幾乎無(wú)法辨認(rèn)，此現(xiàn)象可能與其在應(yīng)激反應(yīng)時(shí)和正常細(xì)胞時(shí)相間期被水解有關(guān)；Cdc25a正常情況下使cylin E/CDK2和cyclin A/CDK2在起始點(diǎn)激活，促進(jìn)細(xì)胞增殖。Cdc25a蛋白在肝癌組織中高表達(dá)，可能與其在肝癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中使癌細(xì)胞無(wú)限增殖有關(guān)[10]。

本研究亦發(fā)現(xiàn)Cdc25a在黃曲霉毒素B1誘發(fā)的大鼠、樹(shù)鼩肝癌組織中也呈過(guò)表達(dá)，一致的表達(dá)差異趨勢(shì)與我們前期已報(bào)道的跨種屬分析基因芯片數(shù)據(jù)結(jié)果[2]及本實(shí)驗(yàn)室之前用cDNA陣列技術(shù)研究黃曲霉毒素B1誘發(fā)樹(shù)鼩肝癌形成過(guò)程中基因變化發(fā)現(xiàn)的結(jié)果[11]相符合。跨種屬表達(dá)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)說(shuō)明Cdc25a在肝癌發(fā)生發(fā)展中起重要作用。進(jìn)一步研究Cdc25a mRNA在人肝癌組織中的表達(dá)水平與臨床參數(shù)的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)Cdc25a在人肝癌組織中的表達(dá)與臨床分期、門靜脈癌栓及肝外轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)，這表明Cdc25a與肝癌患者的病程進(jìn)展有關(guān)，有可能作為評(píng)估病情嚴(yán)重程度的參考指標(biāo)?？紤]到樣本例數(shù)的差異、轉(zhuǎn)錄與翻譯水平的差異、實(shí)驗(yàn)方法的差異等，本研究結(jié)果與前面所述Xu等[9]結(jié)果不完全相同可能與此有關(guān)。

Xu等[12]嘗試抑制Cdc25a在肝癌細(xì)胞系的活性來(lái)闡述其作為抗腫瘤靶點(diǎn)的可能性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Cdc25a反義寡核苷酸在48 h內(nèi)導(dǎo)致25%～50%細(xì)胞生長(zhǎng)被抑制，停滯在G0/G1期，有效抑制了肝癌腫瘤細(xì)胞的增殖，再次表明Cdc25a在治療腫瘤方面是一個(gè)可行的靶點(diǎn)。Liu等[13]研究Rock2在信號(hào)通路的作用及對(duì)肝癌影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，Rock2降低后可激活泛素-蛋白酶體通路，進(jìn)而促進(jìn)Cdc25a泛素化，最終使得Cdc25a降解；并且降低Rock2表達(dá)可增強(qiáng)DNA損傷時(shí)肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用。總之Cdc25a有望成為抗肝癌細(xì)胞的治療新靶點(diǎn)。

本研究結(jié)果中Cdc25a在人、大鼠和樹(shù)鼩3個(gè)種屬的肝癌組織中mRNA及蛋白表達(dá)水平均上調(diào)，提示其表達(dá)水平的改變可能在肝癌發(fā)生發(fā)展中起重要作用。同時(shí)，本研究結(jié)果也證實(shí)了跨種屬篩選腫瘤相關(guān)基因的可行性，為更全面了解肝癌及其它腫瘤的關(guān)鍵基因改變提供一個(gè)新的思路。

[參 考 文 獻(xiàn)]

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