造影劑腎病發(fā)病機制中炎癥反應的探討*

王金艷， 陳 紅， 丁文飛， 鐘愛民

(江西省人民醫(yī)院腎內科，江西 南昌 330006)

雖然臨床上使用的造影劑不斷改良，但隨著醫(yī)學影像學和介入診療技術的發(fā)展，因診療需要造影劑的使用日益增多，造影劑腎病(contrast-induced nephropathy，CIN)已成為臨床工作中不可忽視的問題，尤其有心腦血管疾患的高齡患者或有慢性腎臟病(chronic kidney disease，CKD)基礎的患者，CIN的發(fā)生率更高，除了延長患者住院時間、增加醫(yī)療費用外，部分患者會出現(xiàn)不可逆的腎功能丟失，致使患者進入透析期和死亡風險顯著增加[1]。近年來大多數(shù)研究主要是針對造影劑導致腎臟內局灶缺血為主的血流動力學改變、氧自由基清除、造影劑本身對腎小管細胞的毒性作用等方面進行了機制方面的研究。CIN的發(fā)病中是否存在炎癥反應機制，國內尚無報導，國外這方面的研究新近才見少量報道[2]。本研究著眼于炎癥反應的啟動因子腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-alpha,TNF-α)與核因子κB(nuclear factor-kappa B, NF-κB)在CIN模型動物腎組織中的表達，觀察TNF-α、NF-κB與腎損傷分子1(kidney injury molecule-1,KIM-1)之間的關系，旨在探討CIN發(fā)病中是否存在炎癥反應。

材 料 和 方 法

1 動物

SD雄性大鼠96只，體重約為250～350 g，由南昌大學醫(yī)學院醫(yī)學動物實驗中心提供。

2 主要試劑

兔抗大鼠NF-κB抗體、KIM-1抗體和TNF-α抗體(武漢博士德生物工程有限公司)，免疫組化SP系列試劑盒(北京中杉金橋生物技術有限公司)：RT-PCR試劑盒(北京全式金生物技術有限公司)，76%復方泛影葡胺注射液(上海旭東海普藥業(yè)有限公司)。

3 主要方法

3.1實驗動物分組 96只雄性SD大鼠，適應性喂養(yǎng)1周后隨機分成2組：對照組(n=48)和模型組(n=48)，分別從尾靜脈注射76%復方泛影葡胺注射液(模型組)和生理鹽水(對照組)10 mL/kg，注射前12 h禁水、禁食。

3.2標本采集 造膜前尾靜脈采血2 mL，分別于造模后6 h、12 h、24 h、48 h、72 h、5 d、10 d和15 d予10%的水合氯醛麻醉大鼠各6只，打開腹腔，留取腹主動脈血液5 mL做生化檢測，后取下雙腎，一側腎臟縱行切開，置于10%甲醛液浸泡固定，待用于病理和免疫組化檢測，另一側腎組織在剪碎以后置于樣本保存液中，置于-80 ℃冰箱中冷凍保存，留做RT-PCR用。

3.3腎小管間質損傷病理評分(HE染色) 取腎組織行常規(guī)脫水和石蠟包埋，制作成3 μm切片，常規(guī)HE染色，觀察腎間質充血、出血，腎小管腫脹、變性、壞死、萎縮，間質炎癥細胞的情況，進行腎臟病理評分。評分標準：腎小管：0分為無腎小管損傷；1分為腎小管損傷范圍<25%；2分為腎小管損傷范圍25%～50%；3分為腎小管損傷范圍51%～75%；4分為腎小管損傷范圍>76%；腎間質：0分為無間質充血、炎癥細胞浸潤；1分為有間質充血；1分為有炎癥細胞浸潤；1分為有纖維化形成。取其均值作為該標本的統(tǒng)計數(shù)值。

3.4免疫組化染色 取腎組織行常規(guī)脫水和石蠟包埋，制作成3 μm切片，免疫組化SP法檢測KIM-1、TNF-α和NF-κB的表達，嚴格按免疫組化SP系列試劑盒說明書操作，光鏡下(×400)觀察組織的陽性表達；并采用Image-Pro Plus 6.0病理圖像分析軟件分析陽性目標平均光密度進行半定量分析，取均值做統(tǒng)計比較。

3.5RT-PCR檢測 KIM-1、NF-κB、TNF-α以及內參照引物合成見表1。(1)采用Trizol一步法提取腎臟組織的RNA；(2)RT-PCR反應：按照RT試劑盒說明書操作，所得的cDNA置于-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆茫?3)PCR反應按照試劑盒說明書操作，以所得的cDNA產物2 μL為模板進行聚合酶鏈式反應。反應條件：94 ℃預變性5 min，94 ℃ 變性30 s，55 ℃ (KIM-1)、58 ℃(NF-κB)或53 ℃ (TNF-α)退火30 s,72 ℃延伸30 s(35、35或30個循環(huán)),最后72 ℃ 10 min；(4)反應結束后，取5 μL的PCR產物經2%瓊脂糖凝膠電泳，用凝膠成像分析系統(tǒng)及Quantity One凝膠分析系統(tǒng)進行半定量分析，通過計算目的基因PCR產物積分吸光度與β-actin積分吸光度的比值來反映該目的基因mRNA的相對表達量，取均值做統(tǒng)計比較。

表1 引物序列

4 統(tǒng)計學處理

數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，組間均數(shù)比較采用單因素方差分析和LSD-t檢驗，相關關系采用Pearson相關分析，應用統(tǒng)計軟件SPSS 17.0分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 血清肌酐(serum creatinine,SCr)和血尿素氮(blood urea nitrogen,BUN)檢測

對照組SCr和BUN各時點變化不大(P> 0.05)；CIN模型組SCr和BUN水平造膜后12 h逐漸升高，峰值出現(xiàn)在72 h，顯示造膜成功。除15 d外，模型組SCr和BUN水平明顯高于對照組(P<0.05)，見表2。

表2 兩組大鼠各時點SCr和BUN的比較

2 腎小管損傷評分

對照組各時點大鼠腎臟的腎小管未見明顯損傷，病理評分無顯著差異(P> 0.05)。CIN模型組6 h即見腎小管損傷，24 h和48 h見腎小管上皮細胞刷狀緣脫落、細胞變性壞死及再生，部分腎小管結構受損，髓質區(qū)受損最嚴重，部分腎間質還可見少量炎癥細胞浸潤及纖維化形成，72 h以后腎小管開始逐漸出現(xiàn)修復，15 d基本恢復正常。CIN模型組的腎小管損傷評分顯著高于同一時點的對照組(P<0.05)，見圖1、表3。

Figure 1. Comparison of histopathologic examination in different groups(HE staining, ×400).A：control; B:CIN.

表3 兩組大鼠各時點腎小管間質損傷評分的比較

3 免疫組化染色

KIM-1在造膜后6 h后就開始大量表達，24 h達高峰。NF-κB及TNF-α亦在造膜后6 h后就開始表達，48 h達高峰。除15 d外，模型組KIM-1、NF-κB和TNF-α的表達與對照組對應時點比較均有顯著差異(P<0.05)，見圖2。

4 RT-PCR結果

建模后腎臟組織各時點KIM-1、NF-κB和TNF-α mRNA表達較對照組顯著升高(P<0.05)，分別在24 h、48 h和48 h達到高峰(P<0.05)，之后又逐漸下降恢復正常水平，見圖3。

5 Pearson相關分析

模型組腎小管損傷評分與腎組織NF-κB、TNF-α蛋白及NF-κB mRNA、TNF-α mRNA表達呈正相關(r=0.843、0.758、0.743和0.707，均P<0.05)；模型組腎組織KIM-1蛋白表達與NF-κB、TNF-α蛋白表達呈正相關(r=0.863和0.807,均P<0.05)；模型組腎組織KIM-1 mRNA表達與NF-κB mRNA、TNF-α mRNA表達呈正相關(r=0.839和0.855,均P<0.05)。

討 論

造影劑腎病是臨床不容忽視的問題，但CIN的發(fā)病機制尚未完全明了。目前認為CIN的可能發(fā)病機制主要有：(1)血流動力學改變導致腎臟缺氧性損傷；(2)造影劑的直接細胞毒性效應，包括造影劑能使尿酸、草酸鹽、Tamm-Horsfll 蛋白等排泄增加，加上脫水導致了腎小管的阻塞[3]；(3)促進細胞凋亡并增加氧自由基損傷等[4]。而對CIN是否存在炎癥機制的研究尚少。

Figure 2. Expression of KIM-1, NF-κB and TNF-α at different time points (immunohistochemical staining, ×200).

Figure 3. Expression of KIM-1, NF-κB and TNF-α mRNA at different time points.Mean±SD.n=6.*P<0.05 vs 0 h.

1 造影劑對腎臟的損傷

本研究結果顯示，在靜脈注射造影劑后，腎臟病理評分和KIM-1的表達在24 h時為最高峰，而SCr和BUN水平的峰值遲后于腎臟損傷最嚴重時，且KIM-1的表達與腎臟損傷程度同步，考慮SCr和BUN并非腎臟損傷的早期敏感指標，與Vaidya等[5]、Huo等[6]的實驗結果相一致。正常情況下，在人及動物腎組織中幾乎不表達KIM-1，但在腎缺血及腎毒性損傷后的近端小管上皮細胞頂膜高表達[7]，而在腎小球、腎小管周間質細胞或內髓細胞呈低表達[8]。在CIN中，隨著造影劑在腎小管內濃度逐漸增加，造影劑逐漸對腎小管上皮細胞產生直接毒性作用，導致腎小管腫脹、變性、壞死，甚至出現(xiàn)顆粒和空泡變性，特別是腎髓質的髓袢和集合管尤為嚴重，KIM-1大量分泌[9-10]。CIN模型組KIM-1在建模6h后腎小管就開始顯著表達，表達部位位于胞漿，髓質區(qū)表達最強烈，在24 h達最高峰，之后逐漸降低恢復正常。實驗結果與上述文獻報告相一致。本研究沒有檢測大鼠尿中的KIM-1，實驗的主要目的在于探討CIN的發(fā)病機制，實驗中主要利用KIM-1這一較成熟的生物學標志來觀察和證實腎臟損傷程度，避免腎臟病理評分對腎損傷程度評價的偏差。

2 NF-κB 和TNF-α在CIN腎臟中的表達

NF-κB 廣泛存在于機體各種組織細胞中，參與多種細胞因子和炎癥介質的基因轉錄和級聯(lián)放大過程，是公認的啟動炎癥反應瀑布的關鍵因子[11]。通常情況下，在靜止細胞中，組成NF-κB的p50/p65二聚體通常與其抑制因子(IκBα)結合而穩(wěn)定存在于胞質中。潛伏形式的NF-κB可被多種誘導物如脂多糖、TNF-α等激活，誘導NF-κB活化并迅速進入細胞核，與具有相同序列的各種基因的啟動子/增強子結合，發(fā)揮其轉錄調節(jié)作用[12]。TNF-α為體內細胞因子調節(jié)網絡的啟動因子,是啟動炎癥反應的關鍵細胞因子，TNF-α可以誘導NF-κB激活，NF-κB活化后可增強TNF-α基因的轉錄，使TNF-α產生和釋放增多，進而再次激活NF-κB產生級聯(lián)瀑布效應[13]。張方等[14]的研究也表明NF-κB可正向調控TNF-α的分泌。

我們用免疫組化和RT-PCR實驗方法檢測了對照組和模型組NF-κB和TNF-α蛋白和mRNA的表達水平，提示模型組在造膜12 h后NF-κB和TNF-α表達就顯著增高，與對照組相比有顯著差異。免疫組化還提示在前期NF-κB的表達主要表達在胞漿中，之后逐漸由胞漿轉入細胞核，在48 h表達最強烈，提示NF-κB誘導特異性基因序列轉錄的能力增強。CIN可誘導IκBα磷酸化，促使NF-κB活化并進入細胞核。TNF-α在建膜12 h后皮質區(qū)就開始顯著表達，表達部位位于胞漿，之后陽性區(qū)域逐漸向髓質擴大，表達強度也逐漸增強，在48 h達高峰，而之后表達又逐漸降低，15 d少量表達。實驗結果表明，在CIN的發(fā)生、發(fā)展中，腎臟NF-κB、TNF-α蛋白和mRNA表達均上調。

3 CIN中炎癥反應機制探討

我們的實驗結果顯示，病理評分、KIM-1的表達與腎NF-κB、TNF-α的表達呈正相關，NF-κB、TNF-α的表達水平與腎損傷程度相一致。它們表達上調意味著炎癥反應的發(fā)生和存在。在實驗中，我們還觀察到造膜后24 h、48 h，腎臟病理可見少量的炎癥細胞浸潤及少量纖維化形成，也說明CIN發(fā)生與炎癥反應相關。Machado等[2]利用免疫印跡法在CIN大鼠模型中檢測到大量的NF-κB表達，并提出造影劑能誘導IκBα磷酸化作用增強，可加速NF-κB激活并迅速進入細胞核，其研究結果表明降低NF-κB的活性可以減輕CIN炎癥反應和氧化應激損傷。NF-κB和TNF-α在許多腎臟疾病，如狼瘡性腎炎[15]、IgA腎病[16]、 糖尿病腎病[17]、缺血-再灌注性腎損傷[18]、急性腎損傷[19]等的發(fā)生、發(fā)展過程中起著重要作用。也有研究[20-21]表明抑制TNF-α表達或調控NF-κB通路可以減輕局部或相應疾病的炎癥反應作用。本研究示NF-κB和TNF-α在CIN腎組織中表達上調，說明CIN發(fā)病中存在炎癥反應。

造影劑影響腎血流動力學和直接腎小管毒性是CIN的主要發(fā)病機制，氧化應激和ROS起了重要的鏈接作用。但炎癥反應在CIN發(fā)病中是如氧化應激和ROS一樣起鏈接作用？還是炎癥反應本身就是導致CIN發(fā)生的因素？炎癥反應在CIN發(fā)病中的作用如何？有效抑制炎癥反應能否阻止CIN的發(fā)生和發(fā)展？這些問題目前尚不明確，有待進一步研究。

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