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    AMPK/PPARα/SCAD信號途徑對心肌肥大的調(diào)控研究*

    2014-08-08 09:02:22黃金賢羅佳妮劉培慶陳少銳黃秋菊潘雪刁臧林泉周四桂
    中國病理生理雜志 2014年5期
    關(guān)鍵詞:非諾貝特游離

    黃金賢, 羅佳妮, 劉培慶, 陳少銳, 黃秋菊, 潘雪刁, 臧林泉, 周四桂△

    (1廣東藥學院臨床藥學系,廣東 廣州 510006; 2中山大學藥學院藥理與毒理學實驗室,廣東 廣州 510006)

    我們采用定量蛋白質(zhì)組學技術(shù)比較了16周齡自發(fā)性高血壓大鼠和血壓正常大鼠的心肌蛋白質(zhì)組,首次發(fā)現(xiàn)短鏈酰基輔酶A脫氫酶(short-chain acyl-coenzyme A dehydrogenase,SCAD)在自發(fā)性高血壓大鼠肥大心肌中的表達顯著降低[1]。SCAD是脂肪酸β氧化的限速酶,對脂肪酸β氧化起著關(guān)鍵作用。我們的研究進一步證實,SCAD的蛋白表達及酶活性的顯著下調(diào),可能是導致自發(fā)性高血壓大鼠肥厚心肌能量代謝“胚胎型再演”的分子基礎[2];體外苯腎上腺素(phenylephrine,PE)刺激誘導的心肌細胞肥大模型中,SCAD在蛋白及mRNA水平均顯著下調(diào);采用siRNA干擾SCAD后,心肌細胞肥大指標明顯上升,表明SCAD參與了心肌肥大的調(diào)控[3]。然而,SCAD調(diào)控心肌肥大的分子機制尚不清楚。

    過氧化物酶體增殖物激活受體α(peroxisome proliferator-activated receptor α,PPARα)是核受體超家族成員,也是脂肪酸氧化酶基因的主要轉(zhuǎn)錄調(diào)控子。研究證實,與野生型小鼠相比,PPARα-/-小鼠心肌中SCAD蛋白表達顯著下調(diào),且心肌對脂肪酸攝取、氧化能力下降,表明SCAD基因的表達受PPARα調(diào)控。已有大量的研究證明,心肌肥大過程伴隨著PPARα的表達下調(diào)[4-6]。我們的研究發(fā)現(xiàn),PPARα受體激動劑非諾貝特可能通過上調(diào)SCAD的表達抑制大鼠心肌肥大,改善心肌能量代謝障礙[7-8]。

    腺苷酸活化蛋白激酶(adenosine monophosphate-activated protein kinase, AMPK)是一種絲/蘇氨酸蛋白激酶,參與不同的生理及病理過程中細胞能量代謝的調(diào)控。研究表明,AMPK可通過激活PPARα信號通路,從而抑制心肌肥大[9]。因此,探討AMPK/PPARα/SCAD信號途徑是否對心肌肥大具有一定的調(diào)控作用,對于進一步闡明心肌肥大的分子機制具有重要的意義。

    材 料 和 方 法

    1 材料

    單克隆兔抗p-AMPKα和AMPKα購于Cell Signaling Technology;單克隆鼠抗PPARα、單克隆兔抗SCAD、單克隆鼠抗α-tubulin、非諾貝特、5-bromo-2’-deoxyuridine(BrdU)、PE和5-氨基咪唑-4-甲酰胺核糖核苷酸(5-aminoimidazole-4-carboxamide ribonu-cleotide,AICAR)購于Sigma;BCA蛋白定量試劑盒和Western blotting發(fā)光液購于Thermo;游離脂肪酸含量測定試劑盒購于南京建成;RT-PCR測定試劑盒和TRIzol購于TaKaRa。

    2 方法

    2.1乳鼠心肌細胞培養(yǎng) 采用乳鼠心肌細胞改良法分離并培養(yǎng)心肌細胞,取2~3 d SD乳鼠(廣州中醫(yī)藥大學實驗動物中心)心臟用0.8%胰蛋白酶(Sigma)冰上消化20 min后,37 ℃水浴4 min,1次消化將乳鼠心臟消化成為單細胞懸液,在差速貼壁分離1 h后,調(diào)節(jié)細胞密度接種于培養(yǎng)皿中,置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),并加入BrdU (0.1 mmol/L)抑制成纖維細胞生長48 h。無血清培養(yǎng)24 h后,心肌細胞預先給予非諾貝特(10 μmol/L)或AICAR (0.5 mmol/L)30 min,再加入PE(20 μmol/L)刺激心肌細胞24 h,建立心肌細胞肥大模型。

    2.2SCADRNA干擾SCADsiRNA購于上海吉瑪生物制藥技術(shù)有限公司,序列見表1。采用35 mm皿,siRNA∶Lipofectamine 2000 為 20 pmol∶1 μL。實驗分組如下: (1) 空白對照組(control,Con): 不加任何轉(zhuǎn)染試劑,不加siRNA;(2) 陰性對照組(negative control,NC): 加轉(zhuǎn)染試劑和陰性對照siRNA;(3) siRNA-1186轉(zhuǎn)染組:加轉(zhuǎn)染試劑和siRNA-1186;(4) siRNA-744轉(zhuǎn)染組:加轉(zhuǎn)染試劑和siRNA-744;(5) siRNA-207轉(zhuǎn)染組:加轉(zhuǎn)染試劑和siRNA-207。轉(zhuǎn)染方法按照公司提供的轉(zhuǎn)染試劑說明書進行。

    表1 siRNA 序列

    2.3SCAD活性測定 按上海杰美基因醫(yī)藥科技有限公司提供的說明書進行實驗,心肌細胞以(1~5)×106細胞密度接種于60 mm皿中,細胞生長密度達到70%~80%時以無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)16~24 h 后,更換新的無血清培養(yǎng)基并且加入處理因素。

    古樹名木是一種自然資源,也是一種文化遺產(chǎn),具有重要的經(jīng)濟、生態(tài)、科研、歷史、紀念等價值。古樹名木作為森林資源,可涵養(yǎng)水源、保持水土、除塵抑菌,具有穩(wěn)固的生態(tài)功能[4];是珍貴的活文物,與城鎮(zhèn)和宗教文化發(fā)展息息相關(guān),具有深刻的歷史文化價值[5];是自然科學研究的活標本,具有重要的科學價值[6];具有獨特的觀賞價值,是自然景觀和文化景觀的結(jié)合,是絕佳的旅游資源[7]。對古樹名木的現(xiàn)狀進行調(diào)查分析,并探討相應的保護策略具有重大理論和現(xiàn)實意義。

    2.4心肌細胞表面積測定 PE刺激24 h后,用Zeiss(AX10)倒置熒光顯微鏡(×200)進行拍照,各處理組隨機選取10個視野,測量100個細胞的表面積,重復3次以上實驗,用ImageJ圖像分析系統(tǒng)進行數(shù)據(jù)分析。

    2.5心肌細胞游離脂肪酸的含量測定 PE刺激24 h后,提取心肌細胞的總蛋白,采用BCA試劑盒進行蛋白定量,按照試劑盒說明書進行游離脂肪酸濃度的測定,根據(jù)吸光率計算心肌細胞中游離脂肪酸的含量。

    2.6Real-time PCR檢測PPARα、SCAD、心房利鈉因子(atrial natriuretic factor,ANF)和腦利鈉肽(brain natriuretic peptide,BNP) mRNA的表達 按照TRIzol說明書步驟提取細胞總RNA,采用紫外分光光度計檢測RNA樣品的A260/A280比值在1.8~2.0之間,以確定RNA純度,并計算出RNA的濃度。參照RT-PCR試劑盒說明書進行逆轉(zhuǎn)錄反應,將反應管放置于PCR儀中進行逆轉(zhuǎn)錄反應,逆轉(zhuǎn)錄反應參數(shù):95 ℃ 30 s (1個循環(huán)), 95 ℃ 5 s,60 ℃ 30 s(40個循環(huán))。

    RT-PCR擴增的引物序列見表2。兩步法進行PCR擴增反應,按照說明書加入SYBR熒光染料、引物序列(上海生工生物工程股份有限公司)和RT產(chǎn)物后在real-time PCR儀中進行反應。反應參數(shù)如下:95 ℃ 10 s,90 ℃ 5 s,循環(huán)50次;95 ℃ 15 s,60 ℃ 1 h,65 ℃ 30 s,循環(huán)61次。每組樣品設置3個復孔,以保證實驗結(jié)果的有效性和重復性。

    表2 RT-PCR擴增的引物序列

    2.7Western blotting檢測p-AMPKα、PPARα和SCAD蛋白的表達 提取各組心肌細胞總蛋白,BCA試劑盒檢測細胞蛋白含量后調(diào)整上樣量,分裝、變性,配置10% SDS分離膠和5%濃縮膠進行電泳,電泳結(jié)束后轉(zhuǎn)移至PVDF膜,室溫封閉2 h后加入Ⅰ抗(SCAD為1∶1 000; PPARα為1∶500; p-AMPKα為1∶1 000; AMPKα為1∶1 000;α-tubulin為1∶5 000),過夜。漂洗后加入Ⅱ抗,室溫孵育1 h,化學發(fā)光試劑增強反應,X光壓片曝光、顯影、定影,結(jié)果采用ImageJ圖像分析系統(tǒng)對條帶進行分析。

    3 統(tǒng)計學處理

    數(shù)據(jù)均以數(shù)±標準差(mean±SD)表示,采用SPSS 13.0 統(tǒng)計軟件處理,組間比較應用單因素方差分析,以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

    結(jié) 果

    1 siRNA的篩選結(jié)果

    采用Western blotting、RT-PCR和SCAD活性測定比較3條干擾序列對SCAD的干擾效果,從圖1可見,與空白對照和陰性對照組相比較,siRNA-1186、siRNA-744和siRNA-207均可以不同的程度降低SCAD蛋白、mRNA表達和酶活性,其中以siRNA-1186在蛋白、mRNA和酶活性水平上的降低程度最明顯。因此選擇siRNA-1186進行后續(xù)實驗。

    Figure 1. Selection of the siRNA sequences in cardiomyocytes.A: Western blotting results;B: RT-PCR results;C: SCAD activity.Mean±SD.n=5.*P<0.05,**P<0.01 vs Con.

    2 siRNA-1186敲低SCAD基因?qū)π募〖毎砻娣e及脂質(zhì)代謝的影響

    由圖2可見,siRNA-1186通過瞬時轉(zhuǎn)染對SCAD基因表達進行干擾后,心肌細胞表面積明顯增加,心肌細胞出現(xiàn)了明顯肥大,其程度與刺激因素PE誘導的心肌肥大趨勢一致。此外,心肌細胞對脂肪酸的氧化能力明顯降低,心肌細胞內(nèi)游離脂肪酸含量顯著增多,SCAD下調(diào)對心肌細胞脂質(zhì)代謝的影響與PE誘導心肌細胞肥大導致的脂質(zhì)變化一致。這表明SCAD的表達下調(diào)可能導致了心肌細胞脂肪酸β氧化能力下降,從而引起心肌細胞的游離脂肪酸含量增加,導致心肌細胞肥大發(fā)生。

    3 siRNA-1186敲低SCAD基因?qū)π募〖毎康幕虮磉_與SCAD酶活性的影響

    由圖3可見,siRNA-1186敲低SCAD基因和PE刺激均引起SCAD mRNA、蛋白表達及酶活性水平顯著下降。此外,心肌肥厚標志因子ANF和BNP mRNA表達均有明顯的上升,表明二者均引起心肌細胞出現(xiàn)了明顯肥大,SCAD在心肌肥大過程中具有重要作用,其表達量的降低可能是造成心肌肥大的一個重要因素。

    4 非諾貝特對1186敲低SCAD基因的心肌細胞保護作用

    從圖4可以看出,siRNA-1186通過瞬時轉(zhuǎn)染對SCAD基因表達進行干擾后,SCAD mRNA、蛋白及酶活性均明顯降低,心肌細胞表面積明顯增加,心肌肥厚標志因子ANF和BNP mRNA表達明顯上升,心肌細胞內(nèi)游離脂肪酸含量明顯增加。與siRNA-1186干擾SCAD后的心肌細胞相比,非諾貝特預處理作用于敲低SCAD的心肌細胞后,心肌細胞表面積明顯變小,細胞內(nèi)游離脂肪酸含量顯著減少,肥厚標志因子ANF和BNP mRNA表達有明顯的下降,SCAD mRNA水平明顯升高,相對應的蛋白表達量及SCAD酶活性也顯著增高,見圖4、5。這表明心肌肥大過程中PPARα對SCAD有直接的調(diào)控作用。

    Figure 2. The changes of surface area (A,B) and content of free fatty acids (C) in the cardiomyocytes treated with phenylephrine (PE, 20 μmol/L) or siRNA-1186.Mean±SD.n=5. **P<0.01 vs Con.

    Figure 3. The expression and activity of SCAD in cardiomyocytes treated with phenylephrine (PE, 20 μmol/L) or siRNA-1186. A: Western blotting results; B: RT-PCR results; C: SCAD activity.Mean±SD.n=5.##P<0.01 vs NC;**P<0.01 vs Con.

    Figure 4. The effect of fenofibrate (Feno) on the surface area (A) and content of free fatty acids (B) in the cardiomyocytes treated with siRNA-1186.Mean±SD.n=5. **P<0.01 vs Con; #P<0.05, ##P<0.01 vs siRNA-1186.

    Figure 5. The effect of fenofibrate (Feno) on the expression and the activity of SCAD in cardiomyocytes treated with siRNA-1186. A: Western blotting results; B: RT-PCR results; C: SCAD activity.Mean±SD.n=5.**P<0.01 vs Con; #P<0.05, ##P<0.01 vs riRNA-1186.

    5 非諾貝特對PE處理的心肌細胞表面積及游離脂肪酸含量的影響

    圖6顯示,PE刺激24 h后,心肌細胞表面積明顯增大,出現(xiàn)了心肌細胞肥大,而用非諾貝特能明顯預防心肌細胞肥大,心肌細胞表面積明顯減少。心肌細胞內(nèi)的游離脂肪酸含量明顯增多,而非諾貝特能顯著降低心肌細胞的游離脂肪酸含量。

    Figure 6. The effect of fenofibrate (Feno) on the surface area (A) and content of free fatty acids (B) in cardiomyocyte treated with phenylephrine (PE). Mean±SD.n=5.**P<0.01 vs Con; #P<0.05 vs PE.

    6 非諾貝特對PE處理的心肌細胞PPARα和SCAD蛋白及mRNA表達的影響

    由圖7可見,PE刺激24 h后,心肌細胞內(nèi)肥大標志物ANF和BNP mRNA表達量均顯著上升,說明心肌細胞肥大模型建立成功。而SCAD和PPARα蛋白及mRNA表達水平均顯著下調(diào),表明心肌細胞肥大模型中,SCAD的表達下調(diào),可能導致了心肌細胞的脂肪酸β氧化能力下降,從而引起心肌細胞的游離脂肪酸含量增加。非諾貝特能使PPARα和SCAD蛋白及mRNA水平顯著上調(diào),表明非諾貝特可能通過增加SCAD的表達,從而導致心肌細胞脂肪酸β氧化能力增強,引起心肌細胞的游離脂肪酸含量下降,預防心肌細胞肥大。

    Figure 7. The effect of fenofibrate (Feno) on the expression of PPARα and SCAD at mRNA and protein levels in the cardiomyocytes treated with phenylephrine (PE).A: Western blotting results; B: RT-PCR results; C: SCAD activity.Mean±SD.n=5. **P<0.01 vs Con; #P<0.05,##P<0.01 vs PE.

    7 AICAR對PE處理的心肌細胞表面積及游離脂肪酸含量的影響

    由圖8可見,PE刺激24 h后,心肌細胞表面積明顯增大,而AICAR能顯著逆轉(zhuǎn)心肌細胞肥大;心肌細胞內(nèi)的游離脂肪酸含量明顯增多,而AICAR能顯著降低心肌細胞的游離脂肪酸含量,這一變化趨勢與非諾貝特預處理相一致。

    Figure 8. The effect of 5-aminoimidazole-4-carboxamide ribonucleotide (AICAR) on the surface area (A) and content of free fatty acids (B) in the cardiomyocytes treated with phenylephrine (PE).Mean±SD.n=5. **P<0.01 vs Con; #P<0.05 vs PE.

    8 AICAR對PE處理的心肌細胞p-AMPKα、PPARα及SCAD表達的影響

    由圖9可見,PE刺激24 h后,心肌細胞ANF和BNP mRNA表達量均顯著上升,而SCAD和PPARα mRNA表達則有所下調(diào)。與mRNA的變化趨勢一致的是,PE刺激24 h后,SCAD、PPARα和p-AMPKα蛋白水平亦顯著下調(diào)。AICAR能顯著激活AMPK,使p-AMPKα表達下調(diào)。同時, PPARα和SCAD蛋白和mRNA水平均顯著上調(diào),表明AICAR可能通過激活AMPK增加PPARα的表達,從而上調(diào)下游基因SCAD,導致心肌細胞的脂肪酸β氧化能力增強,引起心肌細胞的游離脂肪酸含量下降,預防心肌細胞肥大。

    Figure 9. The effect of 5-aminoimidazole-4-carboxamide ribonucleotide (AICAR) on the protein and mRNA expression of p-AMPKα, PPARα and SCAD in the cardiomyocytes treated with phenylephrine (PE).A: Western blotting results; B: RT-PCR results; C: SCAD activity. Mean±SD.n=5.**P<0.01 vs Con; #P<0.05,##P<0.01 vs PE.

    討 論

    心肌肥大是心肌細胞對高血壓、瓣膜病、急性心肌梗死及先天性心臟病等常見臨床疾病的一種基本應答。心肌肥大的病理轉(zhuǎn)變過程可分為肥大進展、肥大代償和肥大失代償期3個階段。引起心肌肥大的發(fā)生機制極其復雜,至今仍未完全明了[10]。

    心肌肥大是肥大刺激誘導核內(nèi)基因異常表達的結(jié)果,細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導通路是肥大刺激與核內(nèi)基因轉(zhuǎn)錄活化的偶聯(lián)環(huán)節(jié)。然而,不同刺激誘導的心肌肥大可能具有不同的“分子表型”,這主要取決于它們啟動的信號轉(zhuǎn)導通路。對心肌肥大信號轉(zhuǎn)導通路的深入認識,不僅有助于闡明心肌肥大的分子機制,而且可為藥物干預防治心肌肥大提供新思路[11]。

    研究證實,胚胎時期哺乳動物心肌處于相對缺氧的環(huán)境,以葡萄糖及丙酮酸作為主要的能源物質(zhì),出生后則轉(zhuǎn)為依賴脂肪酸氧化[12]。大量證據(jù)表明:當病理因素導致心肌肥大時,心肌能源供給由脂肪酸β氧化轉(zhuǎn)變?yōu)橐云咸烟堑慕徒鉃橹?,即心肌能量代謝的“胚胎型再演”[13]。而與脂肪酸β氧化密切相關(guān)的SCAD是高度保守的?;o酶A脫氫酶家族成員之一,是脂肪酸β氧化第一步反應的限速酶。SCAD蛋白表達隨年齡變化逐漸增加,且血清和心肌游離脂肪酸含量逐漸減少,可能與大鼠心肌對能量代謝底物的利用轉(zhuǎn)變有關(guān)[2]。因此,SCAD作為脂肪酸β氧化的關(guān)鍵酶,其表達變化與心臟生長發(fā)育密切相關(guān)的同時,對心臟的能量代謝也起到重要的作用,進一步研究SCAD在心肌肥大能量代謝中的機制有著重要的意義。

    本研究進一步采用RNA干擾技術(shù)敲低SCAD的表達,觀察SCAD與心肌細胞肥大的關(guān)系,并與PE誘導的心肌細胞肥大模型相比較。我們觀察到,敲低SCAD的表達后,心肌細胞表面積明顯增大,心肌肥大標志因子ANF和BNP mRNA水平均顯著上升,與PE誘導的心肌肥大趨勢一致,SCAD的表達下調(diào)直接導致了心肌細胞的肥大發(fā)生,表明SCAD在心肌肥大的發(fā)生中具有重要作用。

    敲低SCAD的表達后,心肌細胞內(nèi)SCAD的蛋白表達和酶活性明顯降低,心肌細胞內(nèi)游離脂肪酸含量顯著升高,提示心肌細胞的能量代謝出現(xiàn)了明顯改變。SCAD下調(diào)對心肌細胞脂質(zhì)代謝的影響與PE誘導心肌細胞肥大導致的脂質(zhì)變化一致。此外,PE誘導的心肌肥大模型中,SCAD mRNA、蛋白表達及酶活性均顯著下降。因此,我們推測,SCAD的脂肪酸氧化作用顯著下降,可能導致了心肌細胞對脂肪酸的攝取和氧化能力明顯降低,從而引起心肌細胞游離脂肪酸含量不斷增多。

    PPARα是核受體超家族成員,主要分布在脂肪酸氧化效率高的組織,是生理條件下心肌脂質(zhì)和能量代謝的重要調(diào)控因子。然而,包括SCAD在內(nèi),依賴PPARα的脂肪酸代謝酶至少有7個。因此,心肌中高分布的PPARα與心肌能量代謝密切相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)PE刺激24 h后,心肌細胞明顯肥大,心肌細胞的游離脂肪酸含量明顯增加,并伴有PPARα和SCAD的表達下調(diào),呈現(xiàn)脂肪酸的利用減少和SCAD的表達下調(diào)相一致的趨勢,表明肥大心肌存在脂肪酸氧化酶基因表達水平的降低,從而引起脂肪酸利用受阻,最終導致心肌能量代謝障礙,可能與肥大心肌細胞中PPARα的表達水平降低,引起的SCAD表達減少有關(guān)。本研究采用PPARα受體激動劑,觀察到非諾貝特在激活PPARα和SCAD表達的同時,可明顯逆轉(zhuǎn)心肌細胞肥大,增強肥大心肌細胞對脂肪酸的代謝,降低心肌細胞中游離脂肪酸的含量。并在證實SCAD下調(diào)與心肌肥大脂質(zhì)代謝密切相關(guān)的基礎上,觀察到非諾貝特預處理可以上調(diào)SCAD mRNA、蛋白表達及增高酶的活性,減少心肌細胞表面積,降低肥厚標志因子ANF和BNP mRNA表達,減低心肌細胞內(nèi)游離脂肪酸的含量,直接預防敲低SCAD引起的心肌細胞肥大,表明心肌肥大中PPARα對SCAD具有直接的調(diào)控作用。綜上所述,非諾貝特可能通過激活心肌細胞PPARα,進而上調(diào)依賴PPARα的下游基因SCAD,使SCAD酶活性增強,從而增強心肌細胞脂肪酸的β氧化,改善心肌細胞的能量代謝,預防心肌細胞肥大。這表明PPARα/SCAD信號途徑對心肌肥大具有直接的調(diào)控作用。

    AMPK是一個表達在心血管系統(tǒng)的異源三聚體蛋白,能調(diào)節(jié)體內(nèi)能量代謝,在壓力超負荷的作用下,會增加細胞AMP/ATP的比率,導致ATP減少。AMPK失活與心肌功能障礙及其它代謝性疾病相關(guān)[14], AICAR為AMPK的激活劑,可通過激活AMPKα磷酸化位點Thr172,對PE誘導的心肌肥大有一定的保護作用[15]。本研究顯示,PE刺激24 h后,p-AMPK的表達顯著下調(diào),AICAR在激活AMPK的同時,可明顯逆轉(zhuǎn)心肌細胞肥大,顯著增強肥大心肌細胞的脂肪酸氧化,并伴隨著PPARα及SCAD的表達上調(diào),表明AICAR可能通過激活AMPK進而活化PPARα,上調(diào)脂肪酸氧化限速酶SCAD的表達,從而增強心肌細胞脂肪酸的β氧化,改善能量代謝,預防心肌細胞肥大。可見,AMPK/PPARα/SCAD信號途徑可能介導了心肌細胞肥大的發(fā)生。

    研究表明,體外激活AMPK抑制心肌肥大是通過FOXO1/MuRF1信號通路介導的[16]。而AICAR可通過激活ERK1/2信號途徑,從而提高PPARα活性,抑制心肌肥大[9]??梢姡せ預MPK/PPARα信號通路可能與AMPK/FOXO1/MuRF1信號通路有關(guān),ERK1/2信號途徑是否參與了AMPK/PPARα/SCAD信號通路對心肌肥大的調(diào)控,有待進一步研究。

    [參 考 文 獻]

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