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    啤酒酵母Ⅲ號(hào)染色體ARS305附近核小體的定位

    2014-08-08 11:16吳亞坤杜志強(qiáng)王建英
    湖北農(nóng)業(yè)科學(xué) 2014年8期
    關(guān)鍵詞:啤酒酵母單核小體

    吳亞坤+杜志強(qiáng)+王建英

    摘要:以微球菌核酸酶法分離的啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)染色體單核小體DNA為模板進(jìn)行PCR,根據(jù)不同靶序列PCR產(chǎn)物拷貝數(shù)的不同定位核小體位置。結(jié)果表明,啤酒酵母Ⅲ號(hào)染色體ARS305附近核小體位置大約在39107位到39269位、39318位到39470位及39540位到39694位之間,理論計(jì)算結(jié)果與試驗(yàn)結(jié)果基本一致。

    關(guān)鍵詞:啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae);核小體;定位;Ⅲ號(hào)染色體;自主復(fù)制序列305

    中圖分類號(hào):Q34;Q949.326.1文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A文章編號(hào):0439-8114(2014)08-1928-02

    Location of Nucleosome around ARS305 on Chromosome III of Saccharomyces cerevisiae

    WU Ya-kun,DU Zhi-qiang,WANG Jian-ying

    (The Institute of Bioengineering and Technology,Inner Mongolia University of Science and Technology,Baotou 014010,Inner Mongolia,China)

    Abstract: Using the variation pattern of copy number of PCR product as a function of PCR target sequence, position to the nucleosome locations was determined when isolated mono-nucleosome DNA of Saccharomyces cerevisiae by micrococcal nuclease was used as the PCR template. The results showed that there were three nucleosomes around ARS305 of chromosome Ⅲ located at 39107- 39269 bp, 39318-39470 bp, and 39540- 39694 bp. Computational calculation was in agreement with the experimental data.

    Key words: Saccharomyces cerevisiae; nucleosome; location; chromosome III; ARS305

    真核生物的染色質(zhì)以組蛋白八聚體和緊密纏繞其上147 bp的DNA片段為基本組成結(jié)構(gòu)單元,由于核小體在DNA分子上的可移動(dòng)性,相鄰核小體之間的自由DNA片段長(zhǎng)度從10 bp至100 bp不等[1]。在研究啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)DNA分子復(fù)制過(guò)程中,發(fā)現(xiàn)許多具有自主復(fù)制活性的序列。試驗(yàn)研究表明,在自主復(fù)制序列(Autonomous replicating sequence,ARS)附近通常為核小體缺乏區(qū)域,而啤酒酵母Ⅲ號(hào)染色體具有強(qiáng)復(fù)制起始活性的ARS305及其附近區(qū)域卻有相對(duì)穩(wěn)定的核小體占據(jù)信號(hào)[2]。本研究從理論預(yù)測(cè)和試驗(yàn)驗(yàn)證兩方面來(lái)研究ARS305附近的核小體占據(jù)情況,為后續(xù)研究奠定基礎(chǔ)。

    1材料與方法

    1.1材料

    啤酒酵母由內(nèi)蒙古科技大學(xué)生物工程與技術(shù)研究所分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室低溫保存。

    1.2方法

    1.2.1引物設(shè)計(jì)從SGD網(wǎng)站獲取啤酒酵母染色體ⅢARS305的基因序列(39159-39706),并依前后延伸后序列(39032-39761)設(shè)計(jì)15對(duì)PCR引物。

    1.2.2單核小體DNA提?、贀u菌。挑取單菌落接種于2 mL YPD培養(yǎng)基中,30 ℃、200 r/min過(guò)夜振蕩培養(yǎng)。②擴(kuò)大培養(yǎng)。取過(guò)夜培養(yǎng)物按1∶50(V/V)擴(kuò)大培養(yǎng)至OD600 nm為0.9。③收集菌體。加入2%的甲醛交聯(lián)細(xì)胞作用30 min,然后用125 mmol/L的甘氨酸使反應(yīng)猝熄, 4 ℃、4 000 r/min離心10 min收集細(xì)胞,并用20 mL 0.01 mol/L的PBS緩沖液清洗菌體1次。④原生質(zhì)體提取。將菌體重懸于6 mL A液(50 mmol/L Tris-HCl pH 7.4、1 mol/L D-山梨醇、10 mmol/L β-巰基乙醇)中,加入終濃度為0.25 mg/mL的酵母裂解酶裂解細(xì)胞[3],4 ℃ 4 000 r/min離心10 min收集細(xì)胞后,重懸于2 mL B液(1 mol/L D-山梨醇、50 mmol/L NaCl、10 mmol/L Tris-HCl pH 7.4、5 mmol/L MgCl2、1 mmol/L CaCl2、0.075% Nonidet P40、1 mmol/L β-巰基乙醇和500 μmol/L亞精胺)中。⑤單核小體提取。將上述原生質(zhì)體溶液分裝為每份200 μL,用微球菌核酸酶充分消化后,加入新配制的C液(5% SDS、50 mmol/L EDTA )終止反應(yīng)。然后用蛋白酶K法提取DNA,瓊脂糖凝膠電泳切膠回收單核小體DNA混合物。

    1.2.3PCR定位核小體以單核小體DNA混合物為模板,用15對(duì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,擴(kuò)增條件為:95 ℃預(yù)變性5 min;95 ℃變性30 s,56 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,30個(gè)循環(huán);72 ℃延伸10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物以2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),試驗(yàn)結(jié)果同Kaplan等[4]的試驗(yàn)數(shù)據(jù)和理論預(yù)測(cè)結(jié)果[5]對(duì)比。

    2結(jié)果與分析

    2.1單核小體DNA提取結(jié)果

    啤酒酵母菌染色質(zhì)用微球菌核酸酶處理后,瓊脂糖凝膠電泳顯示單核小體DNA中含有少量全基因組DNA(圖1),切膠回收單核小體DNA混合物(圖2)。

    2.2PCR擴(kuò)增定位核小體結(jié)果

    以單核小體DNA混合物為模板,用15對(duì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,結(jié)果如圖3所示。由圖3可以看出,泳道2、3、4、7、8、9、12、13、14電泳條帶明顯,可推測(cè)引物P2/P2和P4/P4之間,P7/P7和P9/P9之間以及P12/P12和P14/P14之間對(duì)應(yīng)的區(qū)域可能被核小體占據(jù),對(duì)應(yīng)于Ⅲ號(hào)染色體上的堿基位置為39107位到39269位以及39318位到39470位和39540位到39694位。Kaplan等[4]試驗(yàn)結(jié)果表明,在39089(67)位到39258(227)位之間以及39350(319)位到39518(487)位之間和39598(567)位到39750(719)位之間可能存在核小體。

    本研究中理論預(yù)測(cè)結(jié)果為在39096(65)位到39296(231)位之間以及39323(292)位到39481(456)位和39580(549)位到39744(713)位之間可能存在核小體。試驗(yàn)實(shí)際中檢測(cè)出的核小體與理論預(yù)測(cè)及Kaplan等[4]試驗(yàn)結(jié)果基本一致。

    3小結(jié)與討論

    核小體定位技術(shù)起源于20世紀(jì)80年代,隨著基因芯片技術(shù)的發(fā)展而不斷地完善。近年來(lái),隨著計(jì)算機(jī)技術(shù)在生物學(xué)的廣泛應(yīng)用,利用計(jì)算機(jī)編程,通過(guò)全基因組測(cè)序?qū)σ痪S堿基序列的分子結(jié)構(gòu)特性分析,從而從理論上預(yù)測(cè)核小體位置的方法得到了快速的發(fā)展,已經(jīng)逐漸形成了一套芯片檢測(cè)-理論預(yù)測(cè)-試驗(yàn)驗(yàn)證的成熟試驗(yàn)體系[6-8],為研究染色質(zhì)結(jié)構(gòu)特性與生物遺傳信息傳遞之間的耦聯(lián)關(guān)系開(kāi)辟了道路。本試驗(yàn)研究了啤酒酵母Ⅲ號(hào)染色體ARS305附近的核小體定位情況,進(jìn)一步確定了ARS305作為具有強(qiáng)起始活性的自主復(fù)制區(qū)域的特殊性。

    參考文獻(xiàn):

    [1]LEE W, TILLO D, BRAY N, et al. A high-resolution atlas of nucleosome occupancy in yeast[J]. Nature Genetics,2007,39(10): 1235-1244.

    [2]NEWLON C S, COLLINS I, DERSHOWITZ A, et al. Analysis of replication origin function of chromosome Ⅲ of Saccharomyces cerevisiae[J]. Cold Spring Harb Symp Quant Biol, 1993,18(5):415-423.

    [3]陳文輝. 對(duì)于核小體定位檢測(cè)方法的比較研究[J]. 江西科學(xué), 2012,30(1):50-52.

    [4]KAPLAN N, MOORE I K, FONDUFE-MITTENDORF Y, et al. The DNA-encoded nucleosome organization of a eukaryotic genome[J].Nature,2009,458(7236):362-366.

    [5]WANG J Y, WANG J, LIU G. Calculation of nucleosomal DNA deformation energy: Its implication for nucleosome positioning[J]. Chromosome Res,2012,20(7):889-902.

    [6]CHANG F, THEIS J F, MILLER J, et al. Analysis of chromosome III replicators reveals an unusual structure for the ARS318 silencer origin and a conserved WTW sequence within the origin recognition complex binding site[J]. Molecular and Cellular Biology,2008,28(16):5071-5081.

    [7]POLOUMIENKO A, DERSHOWITZ A, DE J, et al. Completion of replication map of Saccharomyces cerevisiae chromosome III[J]. Molecular Biology of the Cell,2001,12(11):3317-3327.

    [8]肖建平,豐繼華,盧英,等. 基于核小體位置預(yù)測(cè)的酵母進(jìn)化印跡研究[J]. 生物信息學(xué), 2013,11(2):150-152.

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    [4]KAPLAN N, MOORE I K, FONDUFE-MITTENDORF Y, et al. The DNA-encoded nucleosome organization of a eukaryotic genome[J].Nature,2009,458(7236):362-366.

    [5]WANG J Y, WANG J, LIU G. Calculation of nucleosomal DNA deformation energy: Its implication for nucleosome positioning[J]. Chromosome Res,2012,20(7):889-902.

    [6]CHANG F, THEIS J F, MILLER J, et al. Analysis of chromosome III replicators reveals an unusual structure for the ARS318 silencer origin and a conserved WTW sequence within the origin recognition complex binding site[J]. Molecular and Cellular Biology,2008,28(16):5071-5081.

    [7]POLOUMIENKO A, DERSHOWITZ A, DE J, et al. Completion of replication map of Saccharomyces cerevisiae chromosome III[J]. Molecular Biology of the Cell,2001,12(11):3317-3327.

    [8]肖建平,豐繼華,盧英,等. 基于核小體位置預(yù)測(cè)的酵母進(jìn)化印跡研究[J]. 生物信息學(xué), 2013,11(2):150-152.

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