負(fù)向調(diào)控miR-9抑制鼻咽癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲*

鄭朝攀, 韓 靈, 侯偉堅(jiān), 文譯輝, 傅 然, 文衛(wèi)平

(中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院耳鼻咽喉科醫(yī)院，中山大學(xué)耳鼻咽喉科學(xué)研究所，廣東 廣州 510080)

鼻咽癌是我國華南地區(qū)高發(fā)病率惡性腫瘤；雖然早期鼻咽癌放射治療效果良好，但鼻咽癌的復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移以及對放化療抵抗等問題降低了生存率[1]。既往研究中，miR-9參與了多種腫瘤的惡性生物過程和惡性特質(zhì)[2]。我們也在鼻咽癌的相關(guān)研究中發(fā)現(xiàn)負(fù)向調(diào)控miR-9能夠促進(jìn)腫瘤細(xì)胞對紫外線介導(dǎo)的活性氧損傷[3]；但是和鼻咽癌預(yù)后密切相關(guān)的增殖和轉(zhuǎn)移等相關(guān)研究有待完善。本實(shí)驗(yàn)通過轉(zhuǎn)染miR-9抑制劑下調(diào)鼻咽癌腫瘤細(xì)胞中miR-9表達(dá)，觀察了腫瘤增殖、遷移以及侵襲的變化，并初步探討其相關(guān)作用機(jī)制。

材 料 和 方 法

1 材料

人鼻咽癌細(xì)胞系CNE2(低分化腫瘤細(xì)胞)和CNE1(高分化腫瘤細(xì)胞)為研究對象。腫瘤細(xì)胞通過應(yīng)用LipofectamineTM2000進(jìn)行轉(zhuǎn)染處理，并按照miR-9抑制組和miR-9抑制對照組進(jìn)行分組。miR-9抑制劑與抑制對照劑均由上海吉瑪公司合成。LipofectamineTM2000 (Invitrogen)。miR-9抑制劑序列為5’- ucauacagcuagauaaccaaaga-3’；抑制對照劑序列為5’- caguacuuuuguguaguacaa -3’。RPMI-1640培養(yǎng)基和胎牛血清(HyClone)；CCK-8 檢測試劑(同仁生物化工有限公司)；PI周期試劑盒(凱基生物有限公司)；Transwell侵襲小室(Corning)。上皮性鈣黏附蛋白(E-cadherin)、β-連環(huán)蛋白(β-catenin)和GAPDH抗體分別為Boster和Santa Cruze產(chǎn)品。其它試劑為國產(chǎn)試劑。

2 方法

2.1細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染 細(xì)胞均置于37 ℃含5%CO2濕飽和的培養(yǎng)箱中，應(yīng)用10%FBS RPMI-1640培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)；當(dāng)細(xì)胞濃度達(dá)到70%～80%時給予消化傳代。在細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染過程中，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到30%～50%時，應(yīng)用脂質(zhì)體LipofectamineTM2000進(jìn)行轉(zhuǎn)染，分為抑制組和對照組(按照使用說明，轉(zhuǎn)染濃度為25 nmol/L進(jìn)行轉(zhuǎn)染)。轉(zhuǎn)染后4 h后更換新培養(yǎng)液,繼續(xù)培養(yǎng)以用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2CCK-8檢測細(xì)胞增殖 腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)染4 h后，重懸細(xì)胞。取96孔板，設(shè)6個復(fù)孔，調(diào)整每孔細(xì)胞的濃度為1×108cells/L，連續(xù)培養(yǎng)72 h；分別在轉(zhuǎn)染培養(yǎng)24 h、48 h、72 h后，更換培養(yǎng)液，每孔10 μL CCK-8 與 90 μL含10%FBS的RPMI-1640培養(yǎng)液；培養(yǎng)箱內(nèi)孵育 1 h，用多功能酶標(biāo)儀測定在 450 nm波長的吸光度(A)。

2.3流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期 腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后，收集轉(zhuǎn)染腫瘤細(xì)胞，70%乙醇固定1 h，RNA酶消化0.5 h后給予碘化丙啶染色，流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期變化。

2.4細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)和侵襲實(shí)驗(yàn) 劃痕實(shí)驗(yàn)為在腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h、培養(yǎng)細(xì)胞單層長滿達(dá)90%后，10 μL槍頭劃線，更換無血清RPMI-1640培養(yǎng)液孵育24 h，并分別在0 h、24 h觀察照相；然后根據(jù)劃痕間垂直直線距離，隨機(jī)取10組數(shù)據(jù)，進(jìn)行分析。侵襲實(shí)驗(yàn)用無血清RPMI-1640培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，接種于martrigel包被的Transwell小室內(nèi)，外槽加入含5%血清培養(yǎng)基。12 h后，棉簽蘸去上層的細(xì)胞，用DAPI染核；熒光顯微鏡檢測細(xì)胞，隨機(jī)選取10×20鏡下5個視野，并計(jì)數(shù)。

2.5免疫印跡實(shí)驗(yàn)和免疫熒光實(shí)驗(yàn) 腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后，提取總蛋白；常規(guī)電泳，半干轉(zhuǎn)膜，封閉，給予E-cadherin、β-catenin和GAPDH抗體4 ℃孵育過夜，加入對應(yīng)的辣根過氧化物酶標(biāo)記的Ⅱ抗常溫孵育1 h后，滴加ECL發(fā)光液，膠片顯影，定影。ImageJ軟件分析各蛋白條帶的灰度值。以GAPDH蛋白表達(dá)為內(nèi)參照，以目的蛋白和GAPDH條帶灰度值的比值表示目的蛋白的相對含量，進(jìn)行分析。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，組間比較采用t檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 負(fù)向調(diào)控miR-9抑制鼻咽癌細(xì)胞的增殖

CNE1細(xì)胞轉(zhuǎn)染72 h后， 轉(zhuǎn)染抑制組與對照組細(xì)胞比較，A值存在顯著差異(P<0.05)；而CNE2細(xì)胞在轉(zhuǎn)染48 h和72 h后2組均存在A值顯著差異(P<0.01；P<0.05)，見圖1。結(jié)果表明負(fù)向調(diào)控miR-9表達(dá)抑制了不同分化鼻咽癌細(xì)胞的增殖。

Figure 1. Changes of cell proliferation were tested with CCK-8 after miR-9 expression was inhibited.A: CNE2 cells; B: CNE1 cells. Mean±SD. n=3. *P<0.05, **P<0.01 vs control.

2 負(fù)向調(diào)控miR-9阻滯鼻咽癌細(xì)胞在G0/G1期分布

經(jīng)PI染色法流式細(xì)胞術(shù)檢測，在鼻咽癌CNE2細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后，miR-9抑制組中G0/G1期細(xì)胞比例為(57.96±1.39)%，比對照組細(xì)胞[(47.93±1.76)%]明顯增加(P<0.05)；而S期和G2期細(xì)胞比例[S期: (31.27±3.56)%；G2期: (20.79±3.85)%]與對照組[S期: (32.72±1.17)%；G2期: (16.70±4.19)%]無顯著差異。CNE1細(xì)胞中，miR-9抑制組腫瘤細(xì)胞中處于G0/G1期的細(xì)胞數(shù)較對照組亦增多[(51.24±0.88)%vs(48.29±0.39)%，P<0.05]，S期和G2期細(xì)胞比例與對照組比較無顯著差異，見圖2。抑制不同分化鼻咽癌細(xì)胞miR-9表達(dá)，可阻滯腫瘤細(xì)胞于G0/G1期，抑制了腫瘤細(xì)胞的增殖。

Figure 2. Changes of cell cycle after miR-9 expression was inhibited.Mean±SD. n=3. *P<0.05 vs CNE2-control;#P<0.05 vs CNE1-control.

3 負(fù)向調(diào)控miR-9對鼻咽癌細(xì)胞遷移和侵襲作用

劃痕實(shí)驗(yàn)提示，抑制鼻咽癌細(xì)胞miR-9表達(dá)后，miR-9抑制組較對照組遷移距離明顯縮短。CNE2細(xì)胞：抑制組細(xì)胞遷移距離為(186.50±7.94)μm,對照組為(247.56±15.56)μm, 差異顯著(P<0.05)；CNE1細(xì)胞：抑制組和對照組分別為(139.06±16.73)μm和(230.66±14.27)μm, 差異顯著(P<0.01)；見圖3A。Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)中， CNE2細(xì)胞抑制miR-9表達(dá)組較對照組降解基質(zhì)和侵襲的細(xì)胞數(shù)明顯減少(43.00±3.17vs65.80±5.20,P<0.01)；而CNE1細(xì)胞抑制miR-9表達(dá)后，雖然抑制組較對照組侵襲細(xì)胞數(shù)降低，但兩者無明顯差異(54.60±2.60vs63.00±3.53,P>0.05),見圖3B。

4 負(fù)向調(diào)控miR-9對β-catenin和E-cadherin表達(dá)的影響

免疫印跡實(shí)驗(yàn)表明抑制CNE2細(xì)胞miR-9表達(dá)后， E-cadherin水平增加，并伴有β-catenin含量降低；CNE1細(xì)胞抑制組E-cadherin水平與對照組比無明顯差異，但β-catenin水平降低，差異顯著，見圖4。

Figure 3. Changes of the abilities of migration (A) and invasion (B) after miR-9 expression was inhibited. Mean±SD. n=10. *P<0.05, **P<0.01 vs control.

Figure 4. Changes of the expression of β-catenin and E-cadherin after miR-9 expression was inhibited.A: expression of β-catenin and E-cadherin in CNE2 cells; B: expression of β-catenin and E-cadherin in CNE1 cells; C:relative intensity of expression of β-catenin and E-cadherin in different cells. Mean±SD. n=3.*P<0.05, **P<0.01 vs control.

討 論

通過研究miRNA相關(guān)機(jī)制揭示腫瘤惡性生物特征以及各種治療抵抗等是研究腫瘤的熱點(diǎn)；在鼻咽癌細(xì)胞中，通過觀察腫瘤細(xì)胞放療后miRNA的差異表達(dá)可以作為研究鼻咽癌放療抵抗的切入點(diǎn)[3-4]。miR-9在不同的腫瘤細(xì)胞中異常表達(dá)決定了其和腫瘤關(guān)系密切。在霍奇金淋巴瘤、乳腺癌細(xì)胞、神經(jīng)源性腫瘤等細(xì)胞中，miR-9促進(jìn)腫瘤增殖；但在卵巢癌、黑色素瘤等腫瘤細(xì)胞中，miR-9則抑制了細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移[2,5-6]。雖然我們既往發(fā)現(xiàn)miR-9能夠調(diào)節(jié)鼻咽癌細(xì)胞對紫外線介導(dǎo)的活性氧損傷，但是其對增殖和轉(zhuǎn)移等相關(guān)研究有待深入。

在鼻咽癌的相關(guān)研究中，Wang等[7]和Song等[8]指出β-catenin可以作為鼻咽癌細(xì)胞治療與預(yù)后的一個重要指標(biāo)。miR-200a、let-7和miR-26等均可通過不同的作用靶基因發(fā)揮調(diào)節(jié)鼻咽癌細(xì)胞增殖的作用[9-11]。Xia等[10]在miR-200a研究中指出，miR-200a對CNE1細(xì)胞增殖的抑制作用主要通過對β-catenin的抑制而發(fā)揮作用，但是在C666細(xì)胞中卻發(fā)揮截然相反的作用。Lu等[9]則通過過表達(dá)miR-26延長G1期細(xì)胞比例，抑制了腫瘤細(xì)胞的增殖與克隆形成。本實(shí)驗(yàn)中，抑制miR-9表達(dá)后，不同分化程度的鼻咽癌細(xì)胞均阻滯腫瘤細(xì)胞于G0/G1期，并抑制了腫瘤細(xì)胞增殖。雖然負(fù)向調(diào)控miR-9后β-catenin表達(dá)變化機(jī)制未能明確，miR-9調(diào)節(jié)E-cadherin表達(dá)后相關(guān)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程以及β-catenin的相應(yīng)變化可能是重要因素[12]。結(jié)果表明抑制miR-9表達(dá)后，鼻咽癌細(xì)胞中β-catenin水平顯著降低其與抑制腫瘤細(xì)胞的增殖變化密切相關(guān)。

鼻咽癌侵襲和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移是影響預(yù)后的重要因素。作為重要的黏附蛋白，E-cadherin與多種腫瘤的轉(zhuǎn)移、放療以及預(yù)后關(guān)系密切[13-14]；同時通過抑制其表達(dá)可促進(jìn)鼻咽癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力[15]。鼻咽癌細(xì)胞中，miR-200a通過調(diào)控E-cadherin的轉(zhuǎn)錄抑制因子鋅指E盒結(jié)合同源盒蛋白2(zinc-finger E-box binding homeobox 2，ZEB2)，促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞侵襲和遷移[10]。Ma等[12]指出miR-9直接抑制E-cadherin表達(dá)明顯促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和侵襲能力。實(shí)驗(yàn)中，CNE2細(xì)胞中抑制miR-9表達(dá)促進(jìn)E-cadherin含量增加，而CNE1細(xì)胞中E-cadherin表達(dá)變化對于miR-9負(fù)向調(diào)控后無明顯變化；因此對應(yīng)的腫瘤細(xì)胞中侵襲細(xì)胞數(shù)出現(xiàn)變化，但遷移能力均明顯受到抑制。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，E-cadherin的變化是miR-9調(diào)節(jié)鼻咽癌腫瘤細(xì)胞侵襲和遷移能力的關(guān)鍵蛋白。

本實(shí)驗(yàn)通過負(fù)向調(diào)控鼻咽癌細(xì)胞中miR-9表達(dá)抑制了腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移，提示miR-9可能與鼻咽癌細(xì)胞的增殖、惡性轉(zhuǎn)化和預(yù)后密切相關(guān)。結(jié)合miR-9對于放療相關(guān)的活性氧的調(diào)節(jié)作用，miR-9可能作為鼻咽癌治療研究的新靶點(diǎn)，需要我們進(jìn)一步關(guān)注和深入。

[參 考 文 獻(xiàn)]

[1] Wei WI, Sham JS. Nasopharyngeal carcinoma[J]. Lancet,2005,365(9476): 2041-2054.

[2] Yuva-Aydemir Y, Simkin A, Gascon E, et al. MicroRNA-9: Functional evolution of a conserved small regulatory RNA[J]. RNA Biol, 2011, 8(4)：557-564.

[3] Zheng CP, Han L, Hou WJ, et al. Inhibition of micro-RNA-9 expression promotes UV-induced ROS damage in nasopharyngeal carcinoma cells[J]. Zhong hua Er Bi Yan Hou Tou Jing Wai Ke Za Zhi, 2013, 48(8): 668-672.

[4] 王旭丹，楊惠玲，郭禹標(biāo)，等.不同輻射抗拒鼻咽癌細(xì)胞微小RNA差異表達(dá)的研究[J].中國病理生理雜志，2007, 23(6): 1045-1048.

[5] Rotkrua P, Akiyama Y, Hashimoto Y, et al. MiR-9 downregulates CDX2 expression in gastric cancer cells[J]. Int J Cancer, 2011,129(11):2611-2620.

[6] Guo LM, Pu Y, Han Z, et al. MicroRNA-9 inhibits ovarian cancer cell growth through regulation of NF-kappaB1[J]. FEBS J, 2009, 276(19): 5537-5546.

[7] Wang ZP, Chen YR, Zheng RL, et al. Effects of reactive oxygen species on lymphokine-activated killer cells in patients with bladder cancer[J]. Acta Pharmacol Sin, 2002, 23(3): 257-262.

[8] Song LB, Zeng MS, Liao WT, et al. Bmi-1 is a novel molecular marker of nasopharyngeal carcinoma progression and immortalizes primary human nasopharyngeal epithelial cells[J]. Cancer Res, 2006, 66(12): 6225-6232.

[9] Lu J, He ML, Wang L, et al. MiR-26a inhibits cell growth and tumorigenesis of nasopharyngeal carcinoma through repression of EZH2[J]. Cancer Res, 2011, 71(1): 225-233.

[10] Xia H, Ng SS, Jiang S, et al. miR-200a-mediated downregulation of ZEB2 and CTNNB1 differentially inhibits nasopharyngeal carcinoma cell growth, migration and invasion[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2010, 391(1): 535-541.

[11] Wong TS, Man OY, Tsang CM, et al. MicroRNA let-7 suppresses nasopharyngeal carcinoma cells proliferation through downregulating c-Myc expression[J]. J Cancer Res Clin Oncol, 2011, 137(3): 415-422.

[12] Ma L, Young J, Prabhala H, et al. miR-9, a MYC/MYCN-activated microRNA, regulates E-cadherin and cancer metastasis[J]. Nat Cell Biol, 2010, 12(3): 247-256.

[13] 唐克晶，饒 青，孟繼虹，等. E-cadherin表達(dá)缺失在白血病細(xì)胞行為中的作用[J].中國病理生理雜志，2009, 25(3): 489-492.

[14] Xie LQ, Bian LJ, Li Z, et al. Altered expression of E-cadherin by hepatocyte growth factor and effect on the prognosis of nasopharyngeal carcinoma[J]. Ann Surg Oncol, 2010, 17(7): 1927-1936.

[15] Huang GW, Mo WN, Kuang GQ, et al. Expression of p16, nm23-H1, E-cadherin, and CD44 gene products and their significance in nasopharyngeal carcinoma[J]. Laryngoscope, 2001, 111(8): 1465-1471.