水稻白葉枯病拮抗菌的篩選、鑒定及發(fā)酵液穩(wěn)定性分析*

張艷軍， 張萍華

(浙江師范大學 化學與生命科學學院,浙江 金華 321004)

水稻白葉枯病是由水稻黃單胞菌致病變種(Xanthomonasoryzaepv.oryzae，Xoo)所引起的一種世界性的細菌病害，與稻瘟病、紋枯病一起被稱為水稻的“三大病害”.水稻遭受白葉枯病后，一般減產(chǎn)20%～30%，嚴重的可減產(chǎn)50%，甚至絕收，嚴重威脅全球農(nóng)業(yè)和糧食安全[1-3].目前，培育抗性品種是控制白葉枯病最經(jīng)濟有效的方法[4].但由于致病菌株不斷發(fā)生變異，使得抗性水稻品種逐漸表現(xiàn)出感病癥狀，因此化學防治仍是防治水稻白葉枯病不可缺少的重要手段.目前常用的化學合成藥劑主要有噻枯唑、克菌壯、葉枯唑及其復(fù)配劑和噻森銅等.這些化學合成藥劑的缺點顯而易見，包括：1)對水稻白葉枯病的防治效果較差，一般只有60%左右[5]；2)長期使用易產(chǎn)生抗藥性[6]；3)產(chǎn)生農(nóng)藥殘留，污染環(huán)境，甚至影響人類健康[4].

近年來，生物防治以其生態(tài)環(huán)境友好、成本低、無污染的特點逐漸為人們所重視，篩選和利用拮抗菌劑防治水稻白葉枯病已成為十分活躍的研究領(lǐng)域，并取得了顯著的進展.但是由于水稻白葉枯病菌致病小種會發(fā)生變異，從而對抗病藥劑產(chǎn)生抗性，因此，從自然環(huán)境中尋找防治水稻白葉枯病的新藥劑是一項長期的工作.本研究從稻田土壤、水稻植株、昆蟲腸道等環(huán)境中分離純化菌株，并以水稻白葉枯病菌生理小種P6菌株為指示菌，通過瓊脂塊法和牛津杯法，篩選出一株對水稻白葉枯病具有拮抗作用的菌株，并對其進行了分類鑒定；在此基礎(chǔ)上，對該拮抗菌發(fā)酵液的抑菌穩(wěn)定性，即熱穩(wěn)定性、酸堿穩(wěn)定性、光穩(wěn)定性等進行了系統(tǒng)研究，獲得了該菌抑菌活性成分對不同環(huán)境因素耐受能力的相關(guān)數(shù)據(jù)，為抑菌活性物質(zhì)的分離純化提供了一定的理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 菌種

水稻白葉枯病菌生理小種P6菌株，保存于-80 ℃冰箱中.

供試拮抗菌：從稻田土壤、昆蟲腸道、水稻植株中分離獲得.

1.2 培養(yǎng)基

PDA固體培養(yǎng)基(1 L)：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g,瓊脂15 g，pH自然.

PD液體培養(yǎng)基(1 L)：馬鈴薯200 g,葡萄糖15 g，pH自然.

改良PDA固體培養(yǎng)基(1 L)：馬鈴薯300 g,蔗糖15 g,Ca(NO3)254H2O 0.5 g,Na2HPO4·12H2O 2.0 g,胰蛋白胨5.0 g,瓊脂15 g，pH自然.

改良PDA液體培養(yǎng)基(1 L)：馬鈴薯300 g,蔗糖15 g,Ca(NO3)2·4H2O 0.5 g,Na2HPO4·12H2O 2.0 g,胰蛋白胨5.0 g，pH自然.

高氏Ⅰ號培養(yǎng)基(1 L)：可溶性淀粉20 g,KNO31 g,K2HPO40.5 g,MgSO4·7H2O 0.5 g,NaCl 0.5 g,FeSO4·7H2O 0.01 g,瓊脂20 g，pH 7.4～7.6.

孟加拉紅培養(yǎng)基(1 L)：蛋白胨5 g,葡萄糖10 g,KH2PO41 g,瓊脂20 g,MgSO4·7H2O 0.5 g,1/3 000孟加拉紅溶液100 mL,氯霉素0.1 g.

牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基(1 L)：牛肉膏3 g,蛋白胨10 g,NaCl 5 g,瓊脂15 g，pH 7.0.

鑒定培養(yǎng)基為固體淀粉培養(yǎng)基、糖發(fā)酵實驗培養(yǎng)基、葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基、蛋白胨水培養(yǎng)基、Simons氏檸檬酸鹽培養(yǎng)基、明膠培養(yǎng)基等[7].

1.3 菌種的采集

1.3.1 土壤中菌種的分離純化

用鏟子從田間種植的水稻根際區(qū)域表層5～10 cm處取土樣約200 g，用滅菌袋將土壤帶回實驗室，共采集8份.采用梯度稀釋法制備土壤懸液，分別吸取10-5,10-6和10-7土壤稀釋液0.1 mL涂布于牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基平板上，室溫靜置10 min后倒置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；分別吸取10-3,10-4和10-5土壤稀釋液0.1 mL涂布于高氏Ⅰ號培養(yǎng)基平板上，室溫靜置10 min后倒置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；分別吸取10-1,10-2和10-3土壤稀釋液0.1 mL涂布于孟加拉紅培養(yǎng)基平板上，室溫靜置10 min后倒置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng).每處理重復(fù)3次.培養(yǎng)2～3 d后挑取單菌落，接種于PDA培養(yǎng)基上保藏并進行編號，用于下一步初篩實驗.

1.3.2 昆蟲內(nèi)生菌的分離純化

在水稻田附近共采集到蜻蜓、蝴蝶、豆娘及蝗蟲4份昆蟲樣本，將它們饑餓24 h，排空體內(nèi)食物殘渣供試.樣品先用蒸餾水沖洗干凈，再用75%乙醇溶液浸泡3 min，然后用無菌濾紙吸干，再用無菌生理鹽水沖洗3次，每次5 min.在無菌條件下解剖昆蟲，取出腸道置于無菌研缽中，加入1 mL無菌生理鹽水研磨，即得昆蟲腸道菌原液，再逐級稀釋獲得10-1和10-2稀釋液.取原液0.2 mL涂布于孟加拉紅培養(yǎng)基平板上，室溫靜置10 min后倒置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；取10-1菌液稀釋液0.2 mL涂布于高氏Ⅰ號培養(yǎng)基平板上，室溫靜置10 min后倒置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；取10-2菌液稀釋液0.2 mL涂布于牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基平板上，室溫靜置10 min后倒置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng).每處理重復(fù)3次.培養(yǎng)2～3 d后挑取單菌落，接種于PDA培養(yǎng)基上保藏并進行編號，用于下一步初篩實驗.

1.3.3 水稻內(nèi)生菌的分離純化

在水稻田采集有白葉枯病癥狀的整株水稻植株樣品，置于滅菌袋中帶回實驗室處理，共6份.將樣品洗凈，取水稻的根、莖、葉、穗、葉鞘等部位各1 g，用無菌水沖洗多次，再用無菌剪刀剪碎置于無菌研缽中，加入少量石英砂和10 mL無菌水充分研磨，即得水稻內(nèi)生菌原液，逐級稀釋獲得10-1和10-2稀釋液.分別吸取0.1 mL原液、10-1稀釋液和10-2稀釋液涂布于孟加拉紅培養(yǎng)基、牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、高氏Ⅰ號培養(yǎng)基平板上，靜置10 min后，牛肉膏蛋白胨平板倒置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，孟加拉紅平板和高氏Ⅰ號平板倒置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng).培養(yǎng)2～3 d后挑取單菌落，接種于PDA培養(yǎng)基上保藏并進行編號，用于下一步初篩實驗.

1.4 水稻白葉枯病拮抗菌的篩選

1.4.1 初篩

將采集到的菌株分別劃線接種于PDA培養(yǎng)基平板上，28 ℃恒溫培養(yǎng)活化備用；將-80 ℃冰箱中保藏的水稻白葉枯病菌菌株接種至改良PD液體培養(yǎng)基中，于180 r/min和28 ℃搖床上進行活化培養(yǎng)，當菌體溶液的A600達到0.6時，取100 μL菌液均勻涂布于改良PDA固體培養(yǎng)基平板上，備用.用直徑0.6 cm的無菌打孔器打孔得供試菌菌餅，放置于上述改良PDA固體培養(yǎng)基平板上，28 ℃恒溫培養(yǎng)36～48 h，根據(jù)抑菌圈大小初步篩選有拮抗能力的菌株，并將其進行試管斜面和甘油管保藏.

1.4.2 復(fù)篩

將試管斜面保藏的拮抗菌接種至新鮮PDA平板中，于28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d.用直徑0.6 cm無菌打孔器在長有拮抗菌的平板上打孔取菌塊，再用無菌水洗下菌體，接種至裝有100 mL PD液體培養(yǎng)液的500 mL三角瓶中，于180 r/min和28 ℃搖床培養(yǎng)，每隔24 h取樣.所取拮抗菌發(fā)酵液12 000 r/min冷凍離心10 min，所得上清液經(jīng)0.22 μm無菌微孔濾膜過濾后檢測其抑菌效果.

取水稻白葉枯病菌懸液100 μL均勻涂布于改良PDA固體培養(yǎng)基上，再取200 μL微濾后的發(fā)酵液，以牛津杯法檢測其對白葉枯病原菌的抑菌作用，并根據(jù)抑菌圈大小篩選抑菌效果明顯的拮抗菌株.每處理重復(fù)3次.

1.5 水稻白葉枯病菌拮抗菌株的鑒定

1.5.1 拮抗菌菌落特征及菌絲形態(tài)觀察

利用梯度稀釋法獲得拮抗菌稀釋液，分別吸取10-4，10-5和10-6稀釋液0.1 mL涂布于PDA培養(yǎng)基平板上，室溫靜置10 min后倒置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，并定期觀察菌落形態(tài)特征，同時采用印片染色法觀察菌絲形態(tài)特征.

1.5.2 拮抗菌生理生化性狀測定

參照文獻[7]對拮抗菌進行甲基紅實驗、伏普實驗、淀粉水解實驗、吲哚實驗、檸檬酸鹽實驗、碳源利用實驗等.根據(jù)實驗結(jié)果，初步鑒定拮抗菌種類.

1.5.3 拮抗菌分子生物學鑒定

使用生工生物工程(上海)股份有限公司的細菌基因組DNA抽提試劑盒(SK1201)提取拮抗菌株基因組DNA，并以此為模板，采用通用引物[8](27F:5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；1541R:5′-AAGGAGGTGATCCAGCGCA-3′)進行16S rDNA的PCR擴增，條件為：98 ℃預(yù)變性3 min，98 ℃變性25 s，55 ℃復(fù)性25 s，72 ℃延伸1 min，30個循環(huán)，72 ℃最終延伸10 min.PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳純化回收后送至生工生物工程(上海)股份有限公司測序.將獲得的菌株16S rDNA序列提交至NCBI 數(shù)據(jù)庫，并進行BLAST比對檢索,調(diào)取同源性較高菌株的16S rDNA序列，用ClustalX 2.1軟件進行多序列對比,并進行人工校正，然后用軟件MEGA 5.05按照Neighbour-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，確定未知菌種的分類地位.

納米材料科學并不是一門具有完整體系和基礎(chǔ)理論的成熟學科,直到1990年7月在巴爾的摩召開的第一屆納米科學技術(shù)學術(shù)會議,才正式把納米材料作為材料科學的一個新分支公布于世。納米材料是一門前瞻性、創(chuàng)新性、專業(yè)性和實踐性很強的課程,涉及物理、化學、生物、能源、材料等多學科交叉和前沿領(lǐng)域,其教學內(nèi)容主要直接面向科研實踐的工作,需要考慮納米材料科學的以下幾個特點。

1.6 拮抗菌株發(fā)酵液抑菌穩(wěn)定性的測定

1.6.1 拮抗菌株無菌發(fā)酵濾液制備

將拮抗菌接種至100 mL PD液體發(fā)酵培養(yǎng)液中，于轉(zhuǎn)速180 r/min、溫度28 ℃搖床中培養(yǎng)5 d，然后將拮抗菌發(fā)酵液12 000 r/min冷凍離心10 min，上清液經(jīng)0.22 μm無菌微孔濾膜過濾,即獲得拮抗菌株無菌發(fā)酵濾液.

1.6.2 拮抗菌株發(fā)酵液拮抗能力測定

制備水稻白葉枯病菌懸液，取100 μL菌液均勻涂布于改良PDA培養(yǎng)基平板上，再取200 μL拮抗菌株無菌發(fā)酵濾液，以牛津杯法檢測其對白葉枯病原菌的抑菌作用.每處理重復(fù)3次.

1.6.3 拮抗菌株發(fā)酵液抑菌穩(wěn)定性測定

1)熱穩(wěn)定性

制備拮抗菌株發(fā)酵上清液，分裝于5支小試管中，每管5 mL樣品，分別在30，50,70,90和121 ℃中保溫處理20 min，冷卻后用0.22 μm無菌微孔濾膜過濾，并檢測濾液的抗菌活性，以原始無菌發(fā)酵濾液作為對照.每處理重復(fù)3次.

2)酸堿穩(wěn)定性

制備拮抗菌株發(fā)酵上清液，分裝于9支小試管中，每管5 mL樣品，用1 mol/L NaOH溶液或1 mol/L HCl溶液將發(fā)酵濾液pH值調(diào)為2～11，處理2 h后用0.22 μm無菌微孔濾膜過濾，并檢測濾液的抗菌活性，以原始無菌發(fā)酵濾液作為對照.每處理重復(fù)3次.

制備拮抗菌株發(fā)酵上清液，在室溫條件下向培養(yǎng)皿內(nèi)加入等量的拮抗菌株發(fā)酵上清液，于紫外燈(40 W)下分別照射1,2,4 h和自然光下分別照射3,6,9 h.處理后樣品用0.22 μm無菌微孔濾膜過濾，并檢測濾液的抗菌活性，以原始無菌發(fā)酵濾液作為對照.每處理重復(fù)3次.

2 結(jié)果與分析

2.1 水稻白葉枯病菌拮抗菌株的篩選

從采集的8份水稻根際稻田土壤、6份水稻植株和4份昆蟲(蜻蜓、蝴蝶、豆娘及蝗蟲)腸道樣品中共分離純化得到31株霉菌、29株細菌和28株放線菌，以水稻白葉枯病菌生理小種P6菌株為指示菌，通過瓊脂塊法和牛津杯法,篩選得到1株對水稻白葉枯病菌具有良好拮抗作用的菌株——12號拮抗菌株(來源于水稻根際土壤)，其抑菌圈直徑達6.09 cm.

2.2 12號拮抗菌株的鑒定

2.2.1 12號拮抗菌株的菌落特征及菌絲形態(tài)

如圖1所示，12號拮抗菌株在PDA培養(yǎng)基上菌落較大，呈圓形、微隆起、干燥、邊緣不規(guī)則且不透明.菌落正面初期為白色，5 d后呈現(xiàn)灰色;菌落背面呈微黃色.菌落質(zhì)地硬而且致密，與培養(yǎng)基連接緊密，難以挑取，具有典型的放線菌特征.如圖2所示:顯微鏡下12號拮抗菌株菌絲發(fā)達，且有大量分枝；孢子絲呈螺旋狀，成熟后斷裂成孢子，孢子(spore)呈圓形.

圖1 12號拮抗菌菌落形態(tài)

圖2 12號拮抗菌菌絲和孢子形態(tài)

2.2.2 12號拮抗菌株的生理生化特性

如表1所示：12號拮抗菌株的糖(葡萄糖和乳糖)發(fā)酵實驗、甲基紅反應(yīng)、V-P實驗和檸檬酸鹽實驗結(jié)果均為陰性；淀粉水解實驗現(xiàn)象明顯，呈陽性；吲哚實驗和檸檬酸鹽實驗結(jié)果均呈陽性.結(jié)合其菌落形態(tài)和菌絲形態(tài)特征，參考文獻[9]，將12號拮抗菌株初步鑒定為鏈霉菌屬.

表1 12號拮抗菌株的生理生化實驗結(jié)果

注：+代表陽性;-代表陰性.

2.2.3 12號拮抗菌株的分子生物學鑒定

通過克隆、測序，獲得了12號拮抗菌株的16S rDNA基因序列，長度為1 459 bp.該序列在EzTaxon數(shù)據(jù)庫進行BLAST相似性分析，根據(jù)序列同源性從高到低的原則，選取相近的12個菌株16S rDNA序列，按照N-J法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果見圖3.12號拮抗菌株與StreptomycesgramineusJR-43處于同一進化分支，兩者序列相似性達98%，而且其形態(tài)特征和生理生化特征基本一致.因此，確定該菌株為Streptomycesgramineus.

圖3 基于12號菌株及12個系統(tǒng)發(fā)育密切相關(guān)鏈霉菌屬代表菌株16S rDNA序列構(gòu)建的鄰接系統(tǒng)發(fā)育樹

2.3 12號拮抗菌株發(fā)酵液穩(wěn)定性的研究

2.3.1 熱穩(wěn)定性

由圖4可知，12號拮抗菌株發(fā)酵液的抑菌活性隨溫度升高略有降低，但在121 ℃處理后發(fā)酵液的抑菌圈直徑仍高達4.95 cm，僅比對照降低了1.14 cm，表明12號拮抗菌株發(fā)酵液具有很好的熱穩(wěn)定性.

圖4 溫度對12號菌株發(fā)酵液穩(wěn)定性的影響

2.3.2 酸堿穩(wěn)定性

12號拮抗菌株發(fā)酵液的原始pH值為6.05，分別調(diào)至2.07,3.07,4.19,5.21,6.05,8.64,9.39和10.13.由圖5可知：12號拮抗菌株發(fā)酵液的抑菌活性在pH 4.19時最低，但抑菌圈直徑仍有5 cm；隨著酸/堿性的增加，12號拮抗菌株發(fā)酵液的抑菌活性呈逐步上升趨勢，甚至在pH 2.07和pH 9.39時抑菌圈直徑達到了6.60和7.10 cm，高于對照樣品.因此，12號拮抗菌株發(fā)酵液具有較好的酸堿穩(wěn)定性，甚至在過酸或過堿條件下其抑菌活性較對照有所增加.

圖5 pH對12號菌株發(fā)酵液穩(wěn)定性的影響

2.3.3 光穩(wěn)定性

由圖6和圖7可知，與對照樣品相比，12號拮抗菌株發(fā)酵液經(jīng)自然光或紫外光照射后，抑菌活性均略有降低，但抑菌圈直徑隨著照射時間的增加并無明顯降低.因此，12號拮抗菌株發(fā)酵液具有較好的光穩(wěn)定性.

3 討 論

自20世紀80年代以來，篩選和利用拮抗細菌防治水稻白葉枯病在世界范圍內(nèi)已成為十分活躍的研究領(lǐng)域.Velusamy等[10]從水稻根際土壤中分離得到一株熒光假單胞菌PDY7，在平板中對白葉枯病菌的抑菌直徑可達3.8 cm，在溫室和大田實驗的防治效果分別為58.8%和51.9%.葛米紅[11]從健康水稻植株中分離得到了內(nèi)生細菌MB-1-6-6，在室外條件下對水稻白葉枯病的防治效果達69.3%.魏蘭芳等[12]篩選得到了抗生素溶桿菌13-1，含菌發(fā)酵液對水稻白葉枯病的防治效果達69.7%.周定中等[13]從昆蟲黑水虻腸道中分離得到一株對水稻黃單胞菌有很強抑菌活性的枯草芽胞桿菌BSF-CL，通過活性物質(zhì)的分子克隆鑒定初步推測其活性物質(zhì)可能為脂肽Iturin和Surfactin.本研究以水稻白葉枯病菌生理小種P6菌株為指示菌，從水稻根際土壤中篩選得到1株對其具有明顯拮抗作用的菌株，其抑菌圈直徑高達6.09 cm，經(jīng)查閱相關(guān)文獻得知，該值為現(xiàn)有文獻報道的最高值.根據(jù)12號拮抗菌株的菌落形態(tài)和菌絲形態(tài)特征、生理生化特征和16S rDNA序列分析結(jié)果，鑒定該菌株為Streptomycesgramineus.

圖6 自然光對12號菌株發(fā)酵液穩(wěn)定性的影響

圖7 紫外光對12號菌株發(fā)酵液穩(wěn)定性的影響

生物活性物質(zhì)能否有效地發(fā)揮作用也與自身的穩(wěn)定性有密切關(guān)系[14].即使篩選得到了抑菌效果良好的菌株，也可能因生物活性物質(zhì)的穩(wěn)定性差而無法在生產(chǎn)實踐中應(yīng)用.本文12號菌株發(fā)酵液抑菌穩(wěn)定性的研究結(jié)果表明：該拮抗菌株發(fā)酵液中的抗菌活性物質(zhì)具有較強的熱穩(wěn)定性、酸堿穩(wěn)定性和光穩(wěn)定性，將其作為生物農(nóng)藥具有一定的應(yīng)用價值和開發(fā)前景.但要將該抗菌活性物質(zhì)開發(fā)成新型生防制劑，充分發(fā)揮該拮抗菌的生防潛力，在理論和實踐上仍需要進行大量研究，如拮抗菌發(fā)酵條件優(yōu)化、抗菌活性物質(zhì)的分離純化、田間防治試驗等.目前本實驗室已著手對該抗菌活性物質(zhì)進行分離純化，并計劃對其結(jié)構(gòu)及抑菌機理做進一步的研究.

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