Bcl-6基因3′UTR雙熒光素酶報告質粒的構建及其與miR-346靶向關系的驗證

陳娟，袁靖，吳晶晶，田潔，湯新逸，芮棵，田新宇，張悅，劉海冰，耿麗娜，楊珺，許化溪，王勝軍

（江蘇大學檢驗醫(yī)學研究所，江蘇鎮(zhèn)江212013）

Bcl-6基因3′UTR雙熒光素酶報告質粒的構建及其與miR-346靶向關系的驗證

陳娟，袁靖，吳晶晶，田潔，湯新逸，芮棵，田新宇，張悅，劉海冰，耿麗娜，楊珺，許化溪，王勝軍

（江蘇大學檢驗醫(yī)學研究所，江蘇鎮(zhèn)江212013）

目的：構建Bcl-6基因3′非編碼區(qū)（3′untranslated region，3′UTR）熒光素酶報告質粒，分析miR-346對Bcl-6的調控作用。方法：通過PicTar數(shù)據(jù)庫和miRanda數(shù)據(jù)庫預測可能與Bcl-6基因3′UTR作用的miRNA；將人工合成的Bcl-6基因3′UTR區(qū)序列克隆至熒光素酶報告質粒psiCHECK-2；將重組熒光素酶報告質粒和miRNAmimics共轉染293T細胞，用雙熒光素酶檢測試劑盒測定熒光素酶活性。結果：PicTar數(shù)據(jù)庫和miRanda數(shù)據(jù)庫預測交叉結果顯示，miR-346與Bcl-6基因3′UTR存在互補結合位點；構建的熒光素酶報告質粒經(jīng)酶切及測序鑒定正確；重組質粒和miR-346 mimics共轉染293T細胞后，熒光素酶報告質粒表達的熒光素酶活性降低66%左右。結論：成功構建了Bcl-6基因3′UTR熒光素酶報告質粒，篩選出和Bcl-6表達相關的miRNA即miR-346。

Bcl-6基因；微小RNA；3′非編碼區(qū)；熒光素酶報告質粒

B細胞淋巴瘤因子-6（B cell lymphoma 6，Bcl-6）是一種轉錄抑制因子［1－3］，最初發(fā)現(xiàn)它是調節(jié)生發(fā)中心B細胞分化的主要因子［2］。Bcl-6通過調節(jié)細胞周期相關基因、DNA損傷反應相關基因以及抑制大量的信號通路，包括B細胞受體信號，來控制生發(fā)中心B細胞的分化［2－4］。近年來發(fā)現(xiàn)Bcl-6也可以調控濾泡輔助性T細胞（follicular helper T cells，Tfh）的分化發(fā)育。在體內，組成性的過表達Bcl-6可以促使Tfh細胞分化，已分化的Tfh細胞表達高水平的Bcl-6［1，5－6］。微小RNA（miRNA）參與生物體的生長、發(fā)育、凋亡等調控，其機制主要是根據(jù)核酸序列的互補性，miRNA結合到特定靶mRNA的3′非編碼區(qū)（3′untranslated region，3′UTR），通過調節(jié)靶mRNA的翻譯或者直接降解靶mRNA來調控目標基因蛋白水平的表達［7］。有關miRNA的異常表達與疾病發(fā)生發(fā)展的關系引起學者們的極大關注，最初miRNA的研究主要集中在腫瘤方面，近幾年，越來越多的研究發(fā)現(xiàn)miRNA與多種自身免疫性疾病的發(fā)展密切相關［8－9］。本研究通過生物信息學預測可能調控免疫相關分子Bcl-6表達的miRNA，并構建Bcl-6基因3′UTR熒光素酶報告載體，通過共轉染實驗檢測Bcl-6基因和miRNA的靶向關系。

1 材料與方法

1.1 材料

人腎胚293T細胞、感受態(tài)大腸埃希菌DH5α（本實驗室保存）。DMEM高糖培養(yǎng)基和胎牛血清（Gibco公司），無RNA酶離心管和槍頭（Axygen公司），miR-346 mimics及陰性對照購于廣州銳博生物技術有限公司，LipofectamineTM2000轉染試劑（Invitrogen公司），限制性內切酶NotⅠ及XhoⅠ（TaKaRa公司），熒光素酶報告質粒psiCHECK-2（Promega公司），DNA連接試劑盒（TaKaRa公司），質粒DNA小量提取試劑盒（Generay公司），雙熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)（Promega公司）。

倒置顯微鏡（奧林巴斯公司），超凈工作臺（蘇州尚田潔凈有限公司），低溫臺式高速離心機和移液器（Eppendorf公司），CO2恒溫細胞培養(yǎng)箱（Forma公司），化學發(fā)光分析儀（Berthold公司）。

采用以下兩種預測軟件：miRanda（http：／／www.microrna.org），PicTar（http：／／pictar.mdc-berlin.de）

1.2 方法

1.2.1 靶基因預測 采用miRanda和PicTar兩個數(shù)據(jù)庫檢索Bcl-6，預測可能靶向作用于Bcl-6的miRNA，預測結果取交集，評分高者優(yōu)先，并結合文獻中報道的與自身免疫病相關的miRNA作為進一步篩選的條件。

1.2.2 熒光素酶報告載體的構建 從基因庫中獲得Bcl-6基因3′UTR序列（基因號NM＿001706），設計并合成位于Bcl-6基因3′UTR區(qū)涵蓋miR-346兩個作用位點的一段序列，分別在5′加上XhoⅠ內切酶，3′加NotⅠ內切酶。由上海生工生物有限公司合成，長152 bp，連接于pUC57載體上。具體序列：5′-CTCGAGGAATCTACCCAAAGGATACTGTAACACTTTACAGCTCGATTTTGTATCTGCAGGCAGACACGGATCTGAGAATCTTTATTGAGAAAGAGCACTTAAGAGTGCACCATCCCTTTTTGAAGTGTAGGCAGACACAGGGACGCGGCCGC-3′。雙酶切連有目的片段的pUC57質粒和psiCHECK-2空載，回收152 bp目的片段和psiCHECK-2載體片段，T4DNA連接酶16℃連接過夜。將連接產(chǎn)物轉化至感受態(tài)大腸埃希菌DH5α中，挑選陽性單菌落搖菌，提取質粒，進行雙酶切（XhoⅠ／NotⅠ）鑒定。鑒定正確后的質粒命名psiCHECK-3′UTR，并送上海英駿生物技術公司測序。

1.2.3 細胞培養(yǎng) 人腎胚293T細胞加入到含10%胎牛血清（FBS）的DMEM，置于37℃恒溫、5% CO2的飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.4 瞬時轉染 miRNA mimics及陰性對照凍干粉離心后分別根據(jù)miRNA產(chǎn)品使用說明書要求，用相應量的DEPC水溶解。使用24孔培養(yǎng)板，于轉染前1天接種適當數(shù)目的293T細胞至板中，每孔中加入不含抗生素的培養(yǎng)基，使轉染時的細胞密度能夠達到30%～50%。參照Lipofectamine 2000轉染試劑說明書進行轉染。實驗共分4組，分別為psi-CHECK-2空載與陰性對照，psiCHECK-2空載與miR-346 mimic，psiCHECK-3′UTR與陰性對照，psi-CHECK-3′UTR與miR-346 mimic。每組設3個平行孔，以psiCHECK-2空載與陰性對照組作為陰性對照，實驗重復3次。轉染后48 h時裂解細胞，檢測熒光素酶活性。

1.2.5 熒光素酶活性測定 除去細胞中的培養(yǎng)基，用PBS緩沖液洗滌細胞1次。將1×PLB 100μL加入到24孔培養(yǎng)板中，室溫輕緩晃動培養(yǎng)板15 min，將裂解液轉移到檢測試管中。事先在檢測管中加入100μL LARⅡ，設置熒光發(fā)光儀程序。轉移20μL PLB裂解液到檢測管中，混合，檢測螢火蟲熒光素酶的活性，向檢測管中加入100μL Stop＆Glo?試劑，檢測海腎熒光素酶活性。

2 結果

2.1 靶向關系預測

以Bcl-6為目的基因，經(jīng)過miRanda和PicTar兩個數(shù)據(jù)庫預測交叉結果顯示，miR-346在兩個數(shù)據(jù)庫中均評分最高，靶向作用于Bcl-6的可能性最大。因此，選miR-346做進一步的研究。圖1為數(shù)據(jù)庫預測出的miR-346與Bcl-6 3′UTR作用的位點。

圖1 m iR-346與Bcl-6 3′UTR作用的位點

2.2 熒光素酶報告質粒的構建與鑒定

設計并合成位于Bcl-6基因3′UTR區(qū)涵蓋miR-346兩個作用位點的一段序列，分別在5′加上XhoⅠ內切酶，3′加上NotⅠ內切酶，將目的基因與psi-CHECK-2載體連接后，轉化大腸埃希菌得到重組質粒，雙酶切法鑒定陽性克隆，可觀察到與目的片段152 bp相符的條帶（圖2），由上海英駿生物技術公司測序后證實與設計合成的序列完全吻合。

圖2 psiCHECK-3′UTR重組質粒雙酶切鑒定

2.3 轉染重組質粒的細胞熒光素酶的表達

將miR-346 mimics與psiCHECK-3′UTR重組質粒共轉染入293T細胞中，以psiCHECK-2空載體和陰性對照組作為陰性對照，測定各組細胞熒光素酶活性，所有實驗均重復2次。如果miRNA與對應的靶基因相互作用，則表現(xiàn)為細胞熒光素酶活性下降。圖3顯示，miR-346對psiCHECK-3′UTR重組質粒的熒光素酶表達有比較明顯的抑制作用，熒光素酶活性降低66%左右。說明miR-346通過與Bcl-6的3′UTR相互作用，抑制Bcl-6蛋白水平的表達。

圖3 各組轉染后細胞的熒光素酶表達情況

3 討論

Bcl-6基因最初是研究非霍奇金淋巴瘤免疫基因圖譜時發(fā)現(xiàn)的一種原癌基因［10］，屬于轉錄抑制蛋白，能結合到靶基因DNA序列上抑制含有識別位點的靶基因的轉錄。Bcl-6主要表達于生發(fā)中心的B細胞和CD4＋T細胞，參與淋巴細胞分化、控制生發(fā)中心形成和調節(jié)T細胞依賴的抗原反應。受Bcl-6調控的基因包括blimp-1、CD44、細胞周期蛋白D2、IP-10等［11－12］。研究發(fā)現(xiàn)，Bcl-6過表達會使生發(fā)中心內的B細胞不能按正常途徑發(fā)育成熟，最終導致腫瘤發(fā)生。

miRNA是近年來發(fā)現(xiàn)的一種小分子非編碼RNA，廣泛存在于病毒、植物以及動物體內，參與生物體的生長、發(fā)育、凋亡等調控。成熟miRNA通過識別靶mRNA的3′UTR區(qū)，降解靶基因或抑制其翻譯，從而抑制蛋白質的合成，達到調控基因表達的目的［7］。生物信息學預測，約1／3的mRNA受miRNA調控。一個miRNA可作用于多個靶基因，多個miRNA也可以共同調控同一個靶基因。目前，已發(fā)現(xiàn)的人miRNA有700多個，免疫細胞中表達100多種miRNA，這些miRNA在固有免疫及適應性免疫中均發(fā)揮著重要作用［8－9］。

本實驗首先采用miRanda和PicTar兩個數(shù)據(jù)庫預測了可能與免疫相關分子Bcl-6相互作用的miRNA，篩選出miR-346作為進一步研究對象。然后通過構建Bcl-6 3′UTR雙熒光素酶報告質粒以及與miR-346 mimics共轉染293T細胞，檢測熒光素酶活性的變化，證實miR-346可以靶向作用于Bcl-6基因，調控其蛋白水平表達。

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Construction of Bcl-6 gene 3′UTR dual luciferase reporter vector and targeting verification between Bcl-6 and m iR-346

CHEN Juan，YUAN Jing，WU Jing-jing，TIAN Jie，TANG Xin-yi，RUIKe，TIAN Xin-yu，ZHANG Yue，LIU Hai-bing，GENG Li-na，YANG Jun，XU Hua-xi，WANG Sheng-jun
（Institution of Laboratory Medicine，Jiangsu University，Zhenjiang Jiangsu 212013，China）

Objective：To construct a luciferase reporter vector containing the 3′untranslated region（3′UTR）of Bcl-6 gene andmeasure the correlation between Bcl-6 andmiR-346.M ethods：ThemiRNA targeting Bcl-6 3′UTR was predicted bymiRanda and PicTar.The synthetic 3′UTR fragmentof Bcl-6 was cloned into PsiCHECK-2 reporter vector.The luciferase reporter vector and miRNA mimics were transfected into 293T cells.The relative luciferase activity was detected.Results：PicTar andmiRanda database shared the results thatmiR-346 have the complementary binding siteswith 3′UTR of Bcl-6.Results of double enzyme digestion and DNA sequencing showed that sequence of luciferase reporter vector was correct.The luciferase activity of reporter vector treatingmiR-346 was decreased observably about66%.Conclusion：The luciferase reporter vector containing the 3′UTR of Bcl-6 was constructed successfully.

Bcl-6；microRNA；3′untranslated region；luciferase reporter vector

R561.4

A

1671－7783（2014）02－0122－04

10.13312／j.issn.1671-7783.y130121

國家自然科學基金資助項目（81072453，31170849，30972748）；江蘇省自然科學基金資助項目（BK2011472）；江蘇省普通高校研究生科研創(chuàng)新計劃項目（CXLX11＿0608）；江蘇省衛(wèi)生廳醫(yī)學科研基金資助項目（Z201313）；江蘇省“青藍工程”項目（蘇教師［2010］27號）

陳娟（1988—），女，碩士研究生；王勝軍（通訊作者），教授，博士生導師，E-mail：sjwjs＠m(xù)ail.ujs.edu.cn

2013－06－04 ［編輯］陳海林