穩(wěn)定表達狂犬病毒糖蛋白的重組新城疫病毒對人肺腺癌A549細胞荷瘤鼠瘤體生長的影響

賈麗娟，劉洋，張金，梁冰，張杰，嚴玉蘭

（1.江蘇大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，江蘇鎮(zhèn)江212001；2.江蘇大學(xué)附屬人民醫(yī)院呼吸科，江蘇鎮(zhèn)江212002）

穩(wěn)定表達狂犬病毒糖蛋白的重組新城疫病毒對人肺腺癌A549細胞荷瘤鼠瘤體生長的影響

賈麗娟1，2，劉洋2，張金2，梁冰1，張杰1，嚴玉蘭2

（1.江蘇大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，江蘇鎮(zhèn)江212001；2.江蘇大學(xué)附屬人民醫(yī)院呼吸科，江蘇鎮(zhèn)江212002）

目的：探討重組穩(wěn)定表達狂犬病毒糖蛋白的新城疫病毒疫苗（recombinant avirulent newcastle disease virus LaSota strain expressing the rabies virus glycoprotein，rl-RVG）對人肺腺癌A549細胞荷瘤鼠的生長抑制作用及其可能的免疫機制。方法：建立A549荷瘤鼠模型并隨機分為rl-RVG組、新城疫病毒（NDV）組和對照組，每組10只，分別于瘤體注射rl-RVG，NDV和PBS，每周2次，共3周。測量3組瘤體體積；免疫組織化學(xué)法測NDV及狂犬病毒糖蛋白（rabies virus glycoprotein，RVG）的表達；HE染色觀察荷瘤小鼠的瘤體、脾、肺等組織病理改變；流式細胞術(shù)檢測荷瘤小鼠脾臟NK細胞數(shù)。結(jié)果：與對照組相比，rl-RVG組及NDV組荷瘤鼠瘤體增長緩慢；NDV在rl-RVG組和NDV組中均有表達，而RVG僅在rl-RVG組中表達；rl-RVG組及NDV組瘤體出現(xiàn)大量凋亡壞死組織、脾臟多核巨細胞明顯增多、肺組織炎癥反應(yīng)明顯；rl-RVG組和NDV組NK細胞數(shù)明顯增多，且rl-RVG組明顯高于NDV組。結(jié)論：rl-RVG成功轉(zhuǎn)染至A549荷瘤鼠，對其瘤體生長有著明顯的抑制作用，可能與rl-RVG激活機體的免疫反應(yīng)相關(guān)。

重組新城疫病毒；肺癌；免疫反應(yīng)

溶瘤治療是一種集基因、免疫治療于一體的新的癌癥治療方法。近年來，研究發(fā)現(xiàn)多種病毒具有溶瘤作用，其中新城疫病毒（newcastle disease virus，NDV）的抗腫瘤作用已應(yīng)用于臨床試驗研究；結(jié)果顯示，NDV對結(jié)腸癌、骨肉瘤、膠質(zhì)瘤、人卵巢癌、急性單核細胞白血病及乳腺癌等腫瘤細胞的生長，有明顯的抑制作用［1－3］，但關(guān)于其對肺癌的研究尚少。研究顯示，對于人和動物而言，NDV是一個很有應(yīng)用價值的疫苗載體，通過對其重組，可以更有效地作用于腫瘤細胞［4－6］。

狂犬病毒的基因組為不分節(jié)段的單股負鏈RNA，11 923～11 928核苷酸［7］從3′到5′的方向有5個結(jié)構(gòu)基因，依次是核蛋白、磷酸蛋白、間質(zhì)蛋白、糖蛋白和轉(zhuǎn)錄大蛋白［8］。其中，狂犬病毒糖蛋白（rabies virus glycoprotein，RVG）是有效的保護性抗原，可以誘導(dǎo)產(chǎn)生抗體及細胞免疫。因此，不少研究者將其克隆到其他病毒載體以構(gòu)建重組活病毒疫苗。

本研究擬觀察穩(wěn)定表達狂犬病毒糖蛋白的重組新城疫病毒疫苗（recombinant avirulent NDV LaSota strain expressing the rabies virus glycoprotein，rl-RVG）對人肺腺癌A549細胞荷瘤鼠的生長抑制作用，并探討其可能機制。

1 材料與方法

1.1 材料

rl-RVG與NDV由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所獸醫(yī)生物技術(shù)國家重點實驗室惠贈；實驗小鼠購自揚州大學(xué)；人肺腺癌A549細胞為本室保存；DMEM及胎牛血清購自維森特公司；小鼠抗狂犬病毒ERA株G蛋白一抗購自美國Santa Cruz公司，雞抗LaSota株NDV一抗由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所獸醫(yī)生物技術(shù)國家重點實驗室惠贈，山羊抗鼠二抗購自北京康維世紀有限公司，兔抗雞二抗購自Earthox公司，小鼠淋巴細胞分離液購自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司，Anti-mouse CD3e PE購自美國eBioscience公司；FITC anti-mouse CD49b購自美國biolegend公司。

1.2 方法

1.2.1 A549荷瘤鼠的建立 取30只4周齡裸鼠，體質(zhì)量18～22 g。人肺腺癌A549細胞復(fù)蘇后移入含有10%胎牛血清和雙抗的DMEM中，37℃，5% CO2培養(yǎng)。待細胞生長至指數(shù)期，胰酶消化后收集，PBS配制成5×108／mL濃度。每只小鼠腋下皮下注射0.3 mL A549懸液，經(jīng)10 d左右，每只小鼠皮下均長成直徑為5～20 mm的瘤體。

1.2.2 實驗分組 將成瘤的裸鼠隨機均分為3組，每組10只，分別為rl-RVG組，NDV組及對照組，分別于瘤體注射rl-RVG 6.3×108pfu，NDV 6×107pfu，PBS液300μL。每周2次，持續(xù)3周。第21天時處死小鼠，鈍性剝離瘤體，取肺及脾等，一部分用4%低聚甲醛固定，另一部分于－80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 腫瘤生長曲線及抑瘤率 自第1次注射日（0 d）開始，每7天1次用游標(biāo)卡尺測量瘤體短徑（a）及長徑（b）（包括皮膚厚度在內(nèi)），計算瘤體體積（V）：V＝a2×b×0.52，并繪制腫瘤生長曲線。根據(jù)末次腫瘤體積計算抑瘤率，抑瘤率＝（對照組平均腫瘤體積－實驗組平均腫瘤體積）／對照組平均腫瘤體積×100%。

1.2.4 免疫組織化學(xué)法測NDV及RVG的表達取小鼠瘤體組織，4%甲醛固定24 h，石蠟包埋，5 μm連續(xù)切片，二甲苯透明10 min，梯度乙醇（100%，95%，80%）脫蠟，各5 min。3%H2O2室溫孵育5～10 min，蒸餾水洗，PBS浸泡5 min，5%～10%正常山羊血清（PBS稀釋）封閉，室溫孵育10 min。棄血清，分別滴加鼠抗RVG（1∶200），雞抗NDV（1∶200），37℃孵育2 h。PBS沖洗，分別滴加兔抗雞IgG-HRP（1∶1 000）、羊抗鼠IgG-HRP（1∶1 000）工作液，室溫孵育30 min。PBS沖洗，DAB染色，避光孵育4～5 min。自來水沖洗，蒸餾水洗1次，蘇木素復(fù)染45 s至1min，脫水，中性樹膠封片，倒置顯微鏡下觀察。

1.2.5 HE染色觀察組織病理改變 取小鼠瘤體、脾、肺組織，4%甲醛固定，石蠟包埋，5μm連續(xù)切片，脫蠟，HE染色，脫水，透明，封固后，于溫箱中烤干后鏡下觀察。

1.2.6 流式細胞術(shù)檢測rl-RVG轉(zhuǎn)染后脾NK細胞（CD3－CD49b＋）數(shù)量 取脾臟研磨成脾細胞懸液，用0.83%TrisNH4Cl破壞紅細胞，PBS（pH＝7.4）洗滌3次，染色緩沖液調(diào)整細胞密度為1×106／mL備用。取試管加入100μL脾細胞懸液，0.5μL CD49b FITC，2.5μLCD3e PE，振蕩混勻，避光孵育30 min。加PBS 1.5mL洗1次，1 500 r／min離心5～10min，棄上清，加300μL PBS振蕩重懸細胞，上流式細胞儀檢測。每組均設(shè)同種型對照，Cellquest軟件獲取數(shù)據(jù)，WinMDI 2.9軟件分析數(shù)據(jù)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組數(shù)據(jù)經(jīng)正態(tài)性檢驗和方差齊性檢驗后行單因素方差分析，進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 A549荷瘤鼠模型的建立

將收集到的A549細胞懸液注入小鼠腋下皮下，經(jīng)10 d左右，每只小鼠皮下均長成直徑為5～20 mm的瘤體。見圖1。

圖1 A549細胞荷瘤裸鼠

2.2 腫瘤生長曲線及抑瘤率

21 d后，rl-RVG組，NDV組和對照組3組瘤裸鼠瘤體體積分別為（779.68±123.59）mm3，（1 073.57±111.82）mm3，（1 716.17±241.70）mm3（F＝36.289，P＜0.01）。rl-RVG組和NDV組腫瘤體積明顯小于對照組（t分別為－5.970，－4.814，P均＜0.05），表明其腫瘤生長緩慢，且rl-RVG組瘤體生長較NDV組慢（t＝－3.648，P＜0.05），見圖2。根據(jù)4次所測腫瘤體積繪制腫瘤生長曲線，rl-RVG組及NDV組生長曲線較對照組平緩。見圖3。

根據(jù)末次測量腫瘤體積及計算公式計算抑瘤率：rl-RVG的抑瘤率為54.5%，即rl-RVG組較對照組腫瘤生長抑制了54.5%；NDV的抑瘤率為37.5%，即NDV組較對照組腫瘤生長抑制了37.5%。

圖2 3周時各組荷瘤裸鼠瘤體體積

圖3 瘤體生長曲線

2.3 免疫組織化學(xué)檢測NDV及RVG的表達

結(jié)果顯示，NDV蛋白在rl-RVG組及NDV組中呈陽性表達，而在對照組中無表達。RVG蛋白在rl-RVG組中細胞的細胞質(zhì)中呈陽性表達，而在NDV組及對照組中幾乎無表達。見圖4。

圖4 新城疫病毒（NDV）及狂犬病毒糖蛋白（RVG）的表達（免疫組化染色，×200）

2.4 rl-RVG轉(zhuǎn)染后組織的病理改變

rl-RVG組及NDV組皮下瘤體中間剖開后呈囊樣變，而對照組為實體瘤改變。HE染色結(jié)果顯示，rl-RVG組及NDV組皮下瘤體較對照組壞死明顯增多，細胞體積變小，結(jié)構(gòu)消失，核濃縮，胞質(zhì)較少或消失，腫瘤細胞大片死亡，且rl-RVG組死亡細胞較NDV組多；rl-RVG組及NDV組脾臟組織較對照組明顯增大，鏡下脾多核巨細胞增多；rl-RVG組及NDV組肺組織充血、炎癥反應(yīng)較對照組明顯，淋巴細胞明顯增多，部分出現(xiàn)肺水腫表現(xiàn)，且rl-RVG組較NDV組更明顯。見圖5。

2.5 rl-RVG轉(zhuǎn)染后脾NK細胞數(shù)量變化

流式細胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，rl-RVG組、NDV組和對照組NK（CD3－CD49b＋）細胞數(shù)分別為（34.00± 4.47）%，（25.60±4.33）%，（14.60±3.85）%（F＝26.489，P＜0.01）；其中，rl-RVG組和NDV組明顯高于對照組（t分別為6.147，3.751，P均＜0.05），且rl-RVG組明顯高于NDV組（t＝7.203，P＜0.05）。見圖6。

圖5 rl-RVG轉(zhuǎn)染后組織的病理改變（HE染色，×200）

圖6 rl-RVG轉(zhuǎn)染后各組NK細胞數(shù)

3 討論

溶瘤治療的原理是通過對自然界存在的一些致病力較弱的病毒進行基因改造制成特殊的溶瘤病毒，利用靶細胞中抑癌基因的失活或缺陷從而選擇性地感染腫瘤細胞，在其內(nèi)大量復(fù)制并最終摧毀腫瘤細胞。

NDV是一個很有潛力的溶瘤病毒［1］，為一種雞瘟病毒，以感染禽類為主。NDV基因組全長15 186個核苷酸，有6個獨立轉(zhuǎn)錄單元，分別編碼核蛋白、磷蛋白、基質(zhì)蛋白、融合蛋白、血凝集素神經(jīng)氨酸酶蛋白（HN）和大聚合酶蛋白［9］。

NDV選擇性地復(fù)制并殺死腫瘤細胞，同時保留正常的細胞，由此可以用于抗腫瘤的治療［10－13］。NDV還可作為免疫療法應(yīng)用于神經(jīng)母細胞瘤［14］，黑色素瘤［15］及其他惡性腫瘤。目前對NDV殺傷的腫瘤機制仍不明確，主要認為有以下幾個方面：NDV能夠直接并且特異性地殺傷腫瘤細胞；NDV能夠激發(fā)機體的細胞及體液免疫反應(yīng)［16］；NDV能夠刺激各種細胞因子的釋放以增強機體的免疫功能［17］。同時在病毒表面的糖蛋白HN與唾液酸相互作用，可以激活NK細胞，進而產(chǎn)生IL-2、IFN-γ及TNF-α等細胞因子，更進一步影響和激活其他免疫細胞的功能，對于腫瘤細胞更具有溶細胞作用［17］。

Ge等［18］成功構(gòu)建rl-RVG，且rl-RVG轉(zhuǎn)染后能穩(wěn)定表達RVG，其表達可以增加NDV在細胞之間的擴散；RVG可以整合到NDV微粒的表面上，但不改變NDV在哺乳動物細胞之間的胰酶依賴的感染；RVG的表達不會明顯影響NDV引起的機體細胞產(chǎn)生的免疫反應(yīng)［18］，RVG的表達不會增加NDV對禽類和老鼠的毒性［19］。RVG還可以調(diào)節(jié)受體的結(jié)合和滲透［20］。RVG的表達進一步地增加了rl-RVG對腫瘤細胞的殺傷作用，使得rl-RVG更有效地作用于腫瘤細胞。

本實驗免疫組化結(jié)果顯示，RVG蛋白在rl-RVG組瘤體組織中表達，NDV蛋白在rl-RVG組及NDV組瘤體組織中表達，說明rl-RVG及NDV成功轉(zhuǎn)染至A549荷瘤鼠內(nèi)。rl-RVG組及NDV組的腫瘤體積生長速度明顯慢于對照組，且腫瘤體積明顯小于對照組，說明rl-RVG及NDV對肺腺癌有著明顯的抑制作用，且rl-RVG的作用較NDV更加顯著。本實驗結(jié)果顯示，與對照組比較，rl-RVG組及NDV組脾臟明顯增大，多核巨細胞和NK細胞明顯增多，且rl-RVG組較NDV組增多更加明顯，說明rl-RVG及NDV激活了機體的免疫反應(yīng)，使得患瘤機體脾臟增生、增大，功能亢進，NK細胞明顯增生，增加機體對腫瘤細胞的殺傷作用，rl-RVG的作用較NDV更加明顯。

綜上所述，本實驗明確了重組新城疫病毒rl-RVG對A549荷瘤鼠能夠成功轉(zhuǎn)染，且對肺腺癌的荷瘤鼠的腫瘤生長有著明顯的抑制作用，其機制可能與rl-RVG自身溶瘤作用及其導(dǎo)致的免疫系統(tǒng)的激活有著密切的關(guān)系。

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Tumor grow th influence of rl-RVG on lung adenocarcinoma A549 transfected in vivo

JIA Li-juan1，2，LIU Yang2，ZHANG Jin2，LIANG Bing1，ZHANG Jie1，YAN Yu-lan2
（1.School of Clinical Medicine，Jiangsu University，Zhenjiang Jiangsu 212001；2.Department of Respiratory Medicine，Affiliated People′s Hospital of Jiangsu University，Zhenjiang Jiangsu 212002，China）

Objective：To explore the effects of recombinant avirulent newcastle disease virus LaSota strain expressing the rabies virus glycoprotein（rl-RVG）on the proliferation of A549 lung adenocarcinoma tumor-bearingmice and potential immunemechanism.M ethods：A tumormodel of human A549 into nude mice was constructed and divided randomly into rl-RVG group，newcastle disease virus（NDV）group and control group.The mice in each group

rl-RVG，NDV and PBS injection，respectively，twice a week，for 3 weeks.The growth of tumor were recorded，and the expression of NDV and rabies virus glycoprotein（RVG）were assayed by immunohistochemistry.The pathological change of the tissues were observed by HE staining.The number of NK（CD3－CD49＋）cellswere detected by flow cytometry.Results：Compared with the control group，the growth of tumor in rl-RVG group and NDV group were inhibitedmore effectively.The subcutaneous tumor necrosisweremore evident and there weremuch moremultinucleated giant cells in the spleen tissue of themice in rl-RVG group and NDV group.Immunohistochemical analysis showed that RVG protein was expressed in rl-RVG group and NDV protein was expressed in both rl-RVG group and NDV group.The number of NK cells was significantly higher in rl-RVG group and NDV group than that in the control group，and in rl-RVG group itwasmore higher than that in NDV group.Conclu-sion：Recombinant rl-RVG transfected successfully，and effectively inhibited the growth of A549 lung adenocarcinoma bymechanism which activating cell immune response.

rl-RVG；lung cancer；immune response

R734

A

1671－7783（2014）02－0105－05

10.13312／j.issn.1671-7783.y130261

鎮(zhèn)江市社會發(fā)展基金資助項目（2013041）

賈麗娟（1987—），女，碩士研究生；嚴玉蘭（通訊作者），主任醫(yī)師，博士，碩士生導(dǎo)師，E-mail：ylyan2005＠126.com

2013－11－25 ［編輯］ 劉星星