重組慢病毒載體介導KSHV分子開關(guān)蛋白Rta在BCBL-1細胞中的表達及其功能鑒定

陳菲，嚴沁，盧春

（南京醫(yī)科大學微生物與免疫學系，江蘇南京210029）

重組慢病毒載體介導KSHV分子開關(guān)蛋白Rta在BCBL-1細胞中的表達及其功能鑒定

陳菲，嚴沁，盧春

（南京醫(yī)科大學微生物與免疫學系，江蘇南京210029）

目的：構(gòu)建含卡波氏肉瘤病毒（Kaposi′s sarcoma-associated herpesvirus，KSHV）分子開關(guān)蛋白，即復制和轉(zhuǎn)錄激活蛋白（replication and transcriptional activator，Rta）基因的重組慢病毒載體。方法：從真核表達質(zhì)粒pcDNA3.1-Rta中擴增出Rta基因，插入pHAGE-CMV-MCS-IzsGreen中，構(gòu)建重組慢病毒載體pHAGE-Rta。將重組慢病毒骨架質(zhì)粒pHAGE-Rta與包裝質(zhì)粒psPAX2和包膜質(zhì)粒pMD2.G共轉(zhuǎn)染293 T細胞，通過熒光顯微鏡觀察表達綠色熒光蛋白的293 T細胞占總數(shù)的百分比。收集病毒懸液，采用梯度稀釋法測定病毒滴度。以不同感染復數(shù)（MOI）的Lentivirus-Rta病毒量感染BCBL-1細胞，72 h后檢測Rta基因的表達，同時通過蛋白質(zhì)印跡和病毒顆粒釋放實驗檢測KSHV裂解期蛋白病毒白細胞介素-6（vIL-6）的表達及子代病毒顆粒的產(chǎn)出。結(jié)果：從真核表達質(zhì)粒pcDNA3.1-Rta中擴增出Rta基因，插入pHAGE-CMV-MCS-IzsGreen后，酶切鑒定和核酸序列測定證實重組慢病毒骨架質(zhì)粒pHAGE-Rta構(gòu)建成功。通過慢病毒包裝3質(zhì)粒表達系統(tǒng)獲得了表達Rta基因的重組慢病毒，滴度約為2×107efu／mL。以不同MOI的重組慢病毒感染BCBL-1細胞，72 h后可檢測到外源基因編碼Rta蛋白的表達，且其表達能夠上調(diào)KSHV vIL-6的表達水平及促進子代病毒顆粒的釋放。結(jié)論：成功構(gòu)建了含Rta基因的慢病毒表達載體，獲得的重組病毒能夠有效地感染BCBL-1細胞，并發(fā)揮激活KSHV裂解期復制的生物學功能。

慢病毒；復制和轉(zhuǎn)錄激活蛋白；卡波氏肉瘤病毒；病毒復制

人類皰疹病毒8型又稱為卡波氏肉瘤病毒（Kaposi′s sarcoma-associated herpesvirus，KSHV），是一種與卡波氏肉瘤（Kaposi′s sarcoma，KS），多中心卡斯特萊曼病和原發(fā)性滲出性淋巴瘤（primary effusion lymphoma，PEL），即體腔滲出性淋巴瘤（body cavitybased lymphoma，BCBL）的發(fā)生高度相關(guān)的病毒［1］。KSHV從屬于皰疹病毒家族，最初在獲得性免疫缺陷綜合征患者的KS組織中發(fā)現(xiàn)［2］，主要侵嗜人淋巴細胞和內(nèi)皮細胞。

KSHV具備皰疹病毒典型的生命周期特征。原發(fā)感染后，KSHV即可在宿主體內(nèi)建立潛伏性感染。處于潛伏期的病毒基因組以附加體形式附著于細胞染色體上，其基因的表達受到嚴格的限制，僅有少數(shù)幾種潛伏期基因表達［3－4］。在宿主免疫力降低或其他因素刺激下，KSHV被激活從潛伏期進入裂解期。研究證實，KSHV進入裂解性周期復制后最先表達立即早期基因ORF50，隨后大量裂解期基因獲得序貫性表達，最終釋放出具有感染性的病毒顆粒，完成裂解性周期復制［5］。因此，ORF50是KSHV由潛伏期進入裂解期的“分子開關(guān)”基因［6］，而由其編碼的復制和轉(zhuǎn)錄激活蛋白（replication and transcriptional activator，Rta）是KSHV進入裂解性周期復制和產(chǎn)生子代病毒所必需的關(guān)鍵蛋白，故又將其稱為“分子開關(guān)”蛋白。因此，任何可以誘導Rta表達的因素均可能影響KSHV的感染狀態(tài)。

鑒于Rta是唯一能使KSHV從潛伏感染轉(zhuǎn)換為增殖感染的“分子開關(guān)”蛋白，本研究通過構(gòu)建含KSHV Rta基因的重組慢病毒表達載體，包裝Rta慢病毒以感染PEL細胞系BCBL-1細胞，從而激活KSHV進入裂解性周期復制，旨在為今后研究KSHV的生命周期和致病特性提供良好的分子工具。

1 材料和方法

1.1 質(zhì)粒、慢病毒與細胞

慢病毒包裝3質(zhì)粒表達系統(tǒng)由慢病毒載體pHAGE-CMV-MCS-IzsGreen、包膜質(zhì)粒pMD2.G以及包裝質(zhì)粒psPAX2共同組成［7］。含有Rta基因的真核表達質(zhì)粒pcDNA3.1-Rta由本實驗室保存。實驗所用的細胞均培養(yǎng)于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中，包括BCBL-1細胞（從PEL中分離出的KSHV陽性，Epstein-Barr病毒陰性的細胞系）和293 T細胞（人胚腎上皮細胞）。以上2種細胞分別培養(yǎng)于含有10%滅活胎牛血清（美國Thermo公司）、慶大霉素（100 U／mL）、鏈霉素（100μg／mL）和青霉素（100 U／mL）的RPMI 1640和DMEM中。

1.2 主要試劑

預染蛋白標準參照物與核酸標準分子量參照物（λDNA／Hin dⅢ＋Eco RⅠ）（美國Thermo公司）、凝膠純化試劑盒（美國Omega公司）、去內(nèi)毒素質(zhì)粒大量提取試劑盒（德國Qiagen公司）、質(zhì)粒轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM2000（美國Invitrogen公司）、鼠抗人α-微管蛋白單克隆抗體、辣根過氧化物酶標記的羊抗兔或羊抗鼠IgG（美國Santa cruz公司）、His-tag單克隆抗體與增強化學發(fā)光試劑（美國Cell Signaling公司）以及病毒核酸純化試劑盒（美國Roche公司）。KSHV Rta和病毒白細胞介素6（viral interleukin-6，vIL-6）多克隆抗體為本實驗室自行制備。用于實時熒光定量聚合酶鏈式反應（real-time quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR）的SYBR?Premix Ex TaqTM（Tli RNaseH Plus）試劑盒購自日本TaKaRa公司。

1.3 重組慢病毒的包裝和鑒定

1.3.1 Rta基因的PCR擴增 利用Oligo 6軟件設(shè)計真核表達質(zhì)粒pcDNA3.1-Rta中Rta引物序列。Rta引物：上游5′-CCGGTCTGCAGCTAGCTCGAGATGGCGCAAGATGAC-3′（劃線部分為XhoⅠ識別序列）；下游5′-GTTAGGGGGGGGGGAGGGATCCTCAGT GGTGGTGGTGGTGGTGGT CTCGGAAGTAATTAC-3′（斜體部分為引入的His標簽蛋白編碼序列，劃線部分為Bam HⅠ識別序列）。PCR引物送至上海申能博彩生物有限公司合成。

以pcDNA3.1-Rta質(zhì)粒為模板，PCR擴增Rta基因。通過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，切膠純化后回收備用。

1.3.2 重組質(zhì)粒pHAGE-Rta的構(gòu)建及鑒定 以限制性內(nèi)切酶XhoⅠ、Bam HⅠ雙酶切慢病毒載體和Rta PCR回收產(chǎn)物，酶切產(chǎn)物純化后連接過夜。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細胞大腸埃希菌TOP10，隨機挑選單個菌落并大量擴增。提取重組質(zhì)粒后進行雙酶切鑒定、基因測序和DNAssist比對，經(jīng)鑒定正確后將其命名為pHAGE-Rta。

1.3.3 重組慢病毒的包裝 利用質(zhì)粒轉(zhuǎn)染試劑將慢病毒包裝3質(zhì)粒表達系統(tǒng)按一定比例共轉(zhuǎn)染293 T細胞，同時設(shè)慢病毒空載體pHAGE-Vec作為陰性對照。轉(zhuǎn)染36 h后于熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）的表達情況，并收集含有病毒顆粒（分別命名為Lentivirus-Rta以及Lentivirus-Vec）的細胞培養(yǎng)上清。24 h后再次收集細胞培養(yǎng)上清。將兩次收集的細胞培養(yǎng)上清混合后以2 500 r／min離心，并經(jīng)0.45μm濾器過濾后分裝，－70℃保存。

根據(jù)本實驗室測定病毒滴度的常規(guī)方法檢測Lentivirus-Rta和Lentivirus-Vec的病毒滴度［8］。病毒滴度［（efu）／mL］＝（綠色熒光細胞數(shù)／視野）×（視野數(shù)／孔數(shù)）×病毒稀釋倍數(shù)÷病毒體積。

1.3.4 Rta基因在293 T細胞中的表達 感染前16 h將293 T細胞接種于6孔板中，然后以相同感染復數(shù)（multiplicity of infection，MOI）的Lentivirus-Rta或陰性對照Lentivirus-Vec分別感染293 T細胞。感染48 h后提取293 T細胞總蛋白進行蛋白質(zhì)印跡，分別以抗-Rta多克隆抗體或抗-His單克隆抗體檢測Rta蛋白在293 T細胞中的表達。

1.4 Rta對KSHV復制周期的影響

1.4.1 重組慢病毒感染BCBL-1細胞 按1.5× 106／mL的密度將BCBL-1細胞接種于6孔板中，分別以MOI為1.0，5.0及10.0的Lentivirus-Rta感染72 h。同時設(shè)MOI為1.0的Lentivirus-Vec感染作為陰性對照。分別以不同MOI的病毒量感染，同時添加可以促進病毒吸附的聚凝胺（終濃度為1μg／mL）。感染72 h后提取BCBL-1細胞總蛋白進行蛋白質(zhì)印跡，檢測Lentivirus-Rta感染后的BCBL-1細胞中Rta蛋白的表達情況。

1.4.2 重組慢病毒介導的Rta蛋白對KSHV裂解性周期復制的影響 將MOI分別為1.0，5.0及10.0的重組慢病毒感染BCBL-1細胞，72 h后提取細胞總蛋白，檢測病毒裂解期早期蛋白vIL-6的表達情況。

1.4.3 KSHV病毒顆粒釋放實驗 按“1.4.1”中所述方法感染BCBL-1細胞。感染72 h后收集含有KSHV顆粒的BCBL-1細胞培養(yǎng)上清，同時經(jīng)0.45 μm濾器過濾上清以除去細胞碎片及雜質(zhì)，即獲得病毒上清。

將收集的上清在低溫條件下以15 000 r／min離心30 min，所得沉淀即為子代病毒顆粒。用200μL PBS重懸，于95℃水浴15 min后加入蛋白酶K（終質(zhì)量濃度為10 mg／mL）。隨即于56℃水浴60 min以裂解病毒顆粒，再于95℃水浴15 min滅活蛋白酶K，獲得病毒裂解液。取之2μL作為模板進行RT-qPCR，檢測KSHV潛伏期基因LANA的表達。LANA引物序列：上游5′-CCGAGGACGAAATGGAAGTG-3′；下游5′-GGTGATGTTCTGAGTACATAGCGG-3′。

1.5 統(tǒng)計學分析

應用SPSS 19.0軟件包對數(shù)據(jù)進行標準差計算，不同MOI組與對照組的兩兩比較采用t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 Rta基因的PCR擴增

以表達載體pcDNA3.1-Rta為模板進行PCR擴增，產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，可見與預期相符的目的片段Rta基因，約2 076 bp（圖1）。

圖1 PCR擴增Rta基因

2.2 重組質(zhì)粒pHAGE-Rta的鑒定

重組質(zhì)粒pHAGE-Rta雙酶切后經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果顯示產(chǎn)生兩個片段，分別為7 742 bp和2 076 bp（圖2）。即慢病毒載體和Rta基因片段?；蛐蛄袦y定結(jié)果表明，全長為2 076 bp的外源基因已克隆至慢病毒載體中。DNAssist比對結(jié)果證實，插入的Rta基因片段與基因庫中的序列一致，引入的His序列也完全正確，表明重組質(zhì)粒pHAGERta構(gòu)建成功。

圖2 重組質(zhì)粒pHAGE-Rta的構(gòu)建與鑒定

2.3 慢病毒的包裝與鑒定

利用質(zhì)粒轉(zhuǎn)染試劑將慢病毒包裝3質(zhì)粒表達系統(tǒng)共轉(zhuǎn)染293 T細胞，36 h后通過熒光顯微鏡觀察，發(fā)現(xiàn)約70%的293 T細胞表達GFP（圖3）。以重組慢病毒Lentivirus-Rta感染293 T細胞，48 h后即可觀察到約90%的293 T細胞表達GFP（圖3）。提取慢病毒感染72 h后的293 T細胞總蛋白進行蛋白質(zhì)印跡，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在預期110 000處可檢測到特異性條帶（圖4），提示重組慢病毒Lentivirus-Rta及其對照Lentivirus-Vec包裝正確。

圖3 3種質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293 T細胞后的綠色熒光蛋白的表達（×100）

圖4 293 T細胞中重組慢病毒Rta蛋白的表達

用經(jīng)不同倍數(shù)稀釋的原病毒液感染293 T細胞，48 h后于熒光顯微鏡下計數(shù)，以綠色熒光代表被感染的細胞數(shù)（圖5）。由公式測得，Lentivirus-Rta滴度約為2×107efu／mL，陰性對照Lentivirus-Vec滴度約為3×107efu／mL。

2.4 BCBL-1細胞中Rta蛋白的表達

Lentivirus-Rta感染72 h后，蛋白質(zhì)印跡結(jié)果顯示，當以MOI為1.0的Lentivirus-Rta感染時，BCBL-1細胞中即可檢測到外源基因Rta的表達，同時其表達量隨著MOI的提高而逐漸增加，并且不會影響細胞的生長狀態(tài)（圖6）。此外，當以MOI為1.0的Lentivirus-Rta感染時，BCBL-1細胞于感染48 h后開始表達GFP，感染效率超過80%。見圖7。

圖5 不同稀釋度重組慢病毒Rta感染293 T細胞48 h的綠色熒光蛋白表達（×100）

圖6 BCBL-1細胞中Rta蛋白的表達

圖7 BCBL-1細胞中綠色熒光蛋白的表達（×100）

2.5 Rta蛋白對KSHV裂解性周期復制的影響

如圖8所示，Lentivirus-Rta感染72 h后，BCBL-1細胞中有vIL-6蛋白表達，且表達水平隨著重組MOI的增加而升高，表明Lentivirus-Rta感染BCBL-1后能夠活化KSHV進入裂解性復制周期，促使下游包括vIL-6在內(nèi)的裂解期基因序貫性表達。

2.6 Rta蛋白對KSHV子代病毒顆粒釋放的影響

為了研究重組慢病毒Lentivirus-Rta是否也可以促進KSHV子代病毒顆粒的釋放，同時收集上述感染后的BCBL-1細胞上清。通過檢測發(fā)現(xiàn)，Lentivirus-Rta感染的BCBL-1細胞上清中，病毒基因組拷貝數(shù)提高了約800倍，并且所釋放的子代病毒顆粒隨著重組慢病毒感染量的提高而明顯增多（表1），提示Lentivirus-Rta感染BCBL-1后能夠激活KSHV產(chǎn)生大量子代病毒，完成病毒的擴增與擴散。

圖8 Lentivirus-Rta對裂解期蛋白vIL-6表達的影響

表1 Lentivirus-Rta對KSHV子代病毒顆粒釋放的影響

3 討論

皰疹病毒的典型特征是存在潛伏感染與裂解性復制兩種不同的生命周期。KSHV主要感染B淋巴細胞和內(nèi)皮細胞，并在其中建立起潛伏感染使之永生化。在機體免疫能力低下或其他因素刺激下，潛伏的KSHV可被激活進入裂解期。KSHV進入裂解期依賴于Rta的活化，Rta活化后可以轉(zhuǎn)錄調(diào)控下游大量裂解期基因，如K1、K3、K5、DNA聚合酶、vIL-6、K12、K15等［9－17］；除此之外，Rta還可以促進潛伏期基因LANA的表達［18］。因此，通過蛋白質(zhì)印跡和病毒顆粒釋放實驗證實，本研究中所構(gòu)建的含有Rta基因的重組慢病毒具有激活KSHV裂解性復制的生物學功能，能使下游的vIL-6基因獲得有效表達，并促進子代病毒顆粒的釋放。

雖然Rta在潛伏期的表達高度受限，但是其啟動子仍然保持了較高的基礎(chǔ)活性，表明表觀遺傳學改變和染色質(zhì)修飾可能參與調(diào)控Rta的表達。Chen等［19］發(fā)現(xiàn)Rta啟動子區(qū)域在潛伏期時處于高度甲基化狀態(tài)，當其去甲基化后則可以激活KSHV進入裂解期。此外，染色質(zhì)修飾（如組蛋白脫乙酰作用及染色質(zhì)結(jié)合蛋白改變等）可與DNA甲基化作用協(xié)同調(diào)節(jié)Rta基因的轉(zhuǎn)錄［20］。研究發(fā)現(xiàn)，潛伏期時Rta啟動子區(qū)域的甲基化可以促進轉(zhuǎn)錄抑制因子與組蛋白脫乙酰酶結(jié)合。目前研究常用化學試劑12-O-十四烷酰佛波醇-13-乙酯（12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate，TPA）和丁酸鈉誘導KSHV進入裂解期復制。其中，丁酸鈉是組蛋白脫乙酰酶的抑制劑，而TPA可以誘導組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶的表達。因此，丁酸鈉和TPA作為KSHV裂解性周期復制的化學誘導劑，均通過影響Rta啟動子區(qū)域的乙酰化水平和甲基化狀態(tài)，從而調(diào)控Rta的表達以及KSHV的感染狀態(tài)［21］。然而，化學誘導劑激活KSHV裂解性復制時，可能會對染色質(zhì)結(jié)構(gòu)以及信號通路轉(zhuǎn)導產(chǎn)生多種無法預計的附加效應［22］。鑒于化學誘導劑的多效性，以及Rta具有激活自身啟動子活性的重要特征［13，23－24］，通過過表達Rta的方式激活KSHV裂解性復制相對于常用的化學誘導劑而言更為直接高效［25］。因此，本研究的目的在于通過慢病毒表達載體介導Rta基因在BCBL-1細胞中的過表達來激活KSHV進入裂解期復制，從而避免常用化學誘導劑引發(fā)的多效性及附加效應。

關(guān)于過表達Rta的方式，研究者們也做了有益的探索。David等［26］將pcDNA3-ORF50過表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入KSHV潛伏感染的細胞，一定程度上可以誘導病毒進入增殖感染狀態(tài)，產(chǎn)生具有感染性的子代病毒顆粒；而敲除Rta的病毒突變體也能夠在細胞中建立潛伏感染，但無法進入裂解性復制周期。這些研究證實了Rta在病毒裂解性復制起始階段的關(guān)鍵作用，以及將其應用于激活KSHV裂解性復制的可行性［27］。外源基因難以導入潛伏有KSHV的PEL細胞系，利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染過表達質(zhì)粒時效率較低，并且對淋巴細胞具有一定的細胞毒性；但是，在基因轉(zhuǎn)移和治療中，高效的慢病毒載體因具有宿主范圍廣、安全性較好以及外源基因持續(xù)表達等優(yōu)點而被廣泛應用。因此，本研究應用重組慢病毒載體系統(tǒng)構(gòu)建了含有Rta基因的重組慢病毒，使之高效感染潛伏有KSHV的BCBL-1細胞，并能夠成功激活KSHV進入裂解性復制周期，產(chǎn)生大量子代病毒顆粒。

綜上所述，本研究中所構(gòu)建的含有Rta基因的重組慢病毒，在誘導KSHV裂解性復制方面具有化學誘導劑以及過表達質(zhì)粒所不具備的特異性和高效性，將為今后研究KSHV的生命周期和致病特性提供良好的分子工具。

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Construction and identification of the recombinant expression lentivirus vector carrying KSHV Rta gene

CHEN Fei，YAN Qin，LU Chun
（Department of Microbiology and Immunology，Nanjing Medical University，Nanjing Jiangsu 210029，China）

Objective：To construct the recombinant lentivirus carrying Kaposi′s sarcoma-associated herpesvirus（KSHV）replication and transcriptional activator（Rta）gene.M ethods：The fragmentof Rta gene from expression vector pcDNA3.1-Rta was cloned into the lentivirus vector pHAGE-CMV-MCS-IzsGreen，then the recombinant vector pHAGE-Rta，packaging vector psPAX2 and envelope vector pMD2.G were cotransfected into the 293 T cells.Filtered culturemediawere harvested and the viral titerwas checked by observing the expression of green fluorescent protein（GFP）.BCBL-1 cellswere infected with the Lentivirus-Rta ofwhichmultiplicity of infection（MOI）was1.0，5.0 and 10.0，respectively，and Rta protein was detected by western blotting；meanwhile，the expression of KSHV lytic protein viral interleukin-6（vIL-6）and the production of KSHV virion were examined by western blotting and virion release assay，respectively.ResultsRecombinant lentiviruswith high titer and efficient infection were obtained by the lentivirus vectors system.BCBL-1 cells could be efficiently infected，and the expression of Rta protein in BCBL-1 cells infected with Lentivirus-Rtawas detectable.The expression of Rta could promote KSHV lytic replication，upregulate the expression of vIL-6 protein and the production of KSHV virion.Conclusion：The recombinant lenti-virus vector carrying Rta gene was constructed successfully；and the expression of Rta in BCBL-1 cells infected with Lentivirus-Rta could reactivate KSHV from latency successfully.

recombinant lentivirus；replication and transcriptional activator；Kaposi′s sarcoma-associated herpesvirus；lytic replication

R393；R373

A

1671－7783（2014）02－0093－06

10.13312／j.issn.1671-7783.y130238

國家自然科學基金資助項目（81371824）

陳菲（1989—），女，碩士研究生；盧春（通訊作者），教授，博士生導師，E-mail：clu＠njmu.edu.cn

2013－10－19 ［編輯］ 劉星星