長(zhǎng)鏈非編碼RNA HOTAIR在食管鱗癌中的表達(dá)及意義

張曌玥，尹越，牟笑，吳詩，毛朝明，陳德玉

（1.江蘇大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，江蘇鎮(zhèn)江212001；2.江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院核醫(yī)學(xué)科，江蘇鎮(zhèn)江212001；3.江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院放療科，江蘇鎮(zhèn)江212001）

長(zhǎng)鏈非編碼RNA HOTAIR在食管鱗癌中的表達(dá)及意義

張曌玥1，尹越1，牟笑1，吳詩1，毛朝明2，陳德玉3

（1.江蘇大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，江蘇鎮(zhèn)江212001；2.江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院核醫(yī)學(xué)科，江蘇鎮(zhèn)江212001；3.江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院放療科，江蘇鎮(zhèn)江212001）

目的：研究食管鱗癌患者長(zhǎng)鏈非編碼RNA HOTAIR（long non-coding RNA HOTAIR，lncRNA HOTAIR）的表達(dá)、臨床意義及其與轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1（TGF-β1）間的關(guān)系。方法：實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)57例食管鱗癌患者癌組織與癌旁組織中HOTAIR及TGF-β1mRNA的表達(dá)水平，分析HOTAIRmRNA表達(dá)與患者臨床病理特征的關(guān)系。結(jié)果：食管鱗癌組織中HOTAIR mRNA表達(dá)較癌旁組織明顯升高（Z＝－2.507，P＝0.012），TGF-β1mRNA表達(dá)明顯降低（Z＝－2.038，P＝0.042）。癌組織中HOTAIR mRNA表達(dá)與腫瘤分化程度及臨床分期有關(guān)，與TGF-β1mRNA表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（r＝－0.406，P＝0.002）。結(jié)論：lncRNA HOTAIR與食管鱗癌的發(fā)生發(fā)展及其惡性程度顯著相關(guān)，可能通過TGF-β1通路起作用。

HOTAIR；轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1；食管鱗癌

長(zhǎng)鏈非編碼RNA（long non-coding RNAs，lnc-RNAs）是一類轉(zhuǎn)錄本長(zhǎng)度超過200 bp的RNA分子，本身并不編碼蛋白質(zhì)，而是以RNA的形式在表觀遺傳調(diào)控、轉(zhuǎn)錄調(diào)控以及轉(zhuǎn)錄后調(diào)控等多種層面上調(diào)控基因的表達(dá)水平［1］?，F(xiàn)有的研究發(fā)現(xiàn)，lnc-RNAs在包括腫瘤在內(nèi)的多種疾病中存在異常表達(dá)，且可能與疾病的發(fā)生發(fā)展有著密切的聯(lián)系［2－5］。HOTAIR是lncRNAs的成員之一，轉(zhuǎn)錄本長(zhǎng)度為2.2 kb，定位在人類12q13.13上HOXC位點(diǎn)，不編碼任何蛋白質(zhì)［6］。有研究表明，HOTAIR在原發(fā)性與轉(zhuǎn)移性乳腺癌中表達(dá)上調(diào)，且其高表達(dá)與乳腺癌轉(zhuǎn)移和不良預(yù)后呈正相關(guān)［7］。還有一些研究顯示，HOTAIR在胃腸道間質(zhì)瘤［8］、胰腺癌［9］、結(jié)直腸癌［10］、肝癌［11］、鼻咽癌［12］中高表達(dá)，并且與腫瘤的轉(zhuǎn)移及不良預(yù)后有潛在關(guān)系。

多梳齒狀復(fù)合物2（polycomb repressive complex 2，PRC2）是多梳蛋白家族基因的一員，可通過修飾染色質(zhì)結(jié)構(gòu)來維持基因的轉(zhuǎn)錄抑制。有研究表明，HOTAIR可以通過連接PRC2和組蛋白去甲基酶LSD1來沉默HOXD位點(diǎn)的轉(zhuǎn)錄［10］。而作為PRC2靶基因的細(xì)胞周期調(diào)控相關(guān)基因受轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1（transforming growth factorβ1，TGF-β1）的調(diào)控。因此我們猜測(cè)，HOTAIR或許與TGF-β1間存在著某種相關(guān)性。目前僅有少數(shù)文獻(xiàn)研究食管癌中HOTAIR的表達(dá)［13］，因此，關(guān)于HOTAIR在食管鱗癌中的表達(dá)情況及作用機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。本研究采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)HOTAIR mRNA在食管鱗癌組織中的表達(dá)，并分析其與臨床病理參數(shù)間的關(guān)系，探討其與TGF-β1間潛在的關(guān)系。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 組織標(biāo)本 57例食管鱗癌組織與癌旁組織（距腫塊邊緣3～5 cm）均取自2012年4月至2013年5月江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院胸外科食管癌手術(shù)患者，術(shù)后均經(jīng)病理診斷確診為鱗癌，切緣陰性。患者年齡45～76歲，入院均行胸部X片、上消化道造影、纖維食管鏡、胸部CT等檢查。術(shù)前未接受任何放射或化學(xué)藥物等抗腫瘤治療。按AJCC臨床分期標(biāo)準(zhǔn)：Ⅰ、Ⅱ期29例，Ⅲ、Ⅳ期28例。術(shù)后病理確診：高、中分化43例，低分化14例。所有標(biāo)本收集后迅速置－80℃冰箱保存。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有患者均在手術(shù)前簽署書面同意書。

1.1.2 試劑和儀器 Trizol?（美國(guó)Invitrogen公司）、PrimeScriptTMRT reagent Kit（TaKaRa公司）、SYBR?Premix Ex TaqTM（TaKaRa公司）、引物由美國(guó)Invitrogen公司設(shè)計(jì)合成。BIOMATE 3S紫外／可見光分光光度計(jì)（美國(guó)THERMO公司）、My Cycler梯度PCR儀（美國(guó)Bio-rad公司），Mx3000p Real Time PCR儀（美國(guó)Stratagene公司）。

1.2 方法

1.2.1 總RNA提取 食管鱗癌與癌旁組織從－80℃冰箱取出后迅速稱重，取100 mg組織，按Trizol說明書進(jìn)行提取，最后用DEPC水溶解RNA。提取的RNA用分光光度計(jì)檢測(cè)其濃度和純度。

1.2.2 cDNA反轉(zhuǎn)錄合成 按反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書，以10μL反應(yīng)體系進(jìn)行cDNA反轉(zhuǎn)錄合成。反應(yīng)條件為37℃15 min、85℃5 s，－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR HOTAIR上游引物：5′-GGTAGAAAAAGCAACCACGAAGC-3′，下游引物：5′-ACATAAACCTCTGTCTGTGAGTGCC-3′，產(chǎn)物長(zhǎng)度為170 bp［7］。TGF-β1上游引物：5′-CTAATGGTGGAAACCCACAACG-3′，下游引物：5′-TATCGCCAGGAATTGTTGCTG-3′，產(chǎn)物長(zhǎng)度為209 bp。GAPDH上游引物：5′-TCAACGGATTTGGTCGTATTG-3′，下游引物：5′-TGGGTGGAATCATATTGGAAC-3′，產(chǎn)物長(zhǎng)度為136 bp。按實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒說明書，以25μL反應(yīng)體系進(jìn)行擴(kuò)增，陰性對(duì)照用2μL DEPC處理的超純水代替cDNA模板。反應(yīng)條件：95℃30 s 1個(gè)循環(huán)，95℃5 s，55℃20 s，40個(gè)循環(huán)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果用2－ΔΔCt法進(jìn)行分析。其中ΔΔCt＝ΔCt（癌組織）－ΔCt（癌旁組織）。所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次，取3次結(jié)果的平均值為實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，HOTAIR mRNA及TGF-β1mRNA相對(duì)表達(dá)量為非正態(tài)分布資料，計(jì)量資料以中位數(shù)（四分位數(shù)間距）表示，配對(duì)樣本采用非參數(shù)Wilcoxon符號(hào)秩和檢驗(yàn)，獨(dú)立樣本采用Mann-Whitney U和Kruskal-Wallis檢驗(yàn)。HOTAIR與TGF-β1相對(duì)表達(dá)量經(jīng)log2正態(tài)性轉(zhuǎn)換后，進(jìn)行Pearson相關(guān)性分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR產(chǎn)物電泳檢測(cè)結(jié)果

所有標(biāo)本總RNA提取后進(jìn)行光密度檢測(cè)，純度較好，D（260 nm）／D（280 nm）值在1.8～2.0之間。陰性對(duì)照無擴(kuò)增曲線。PCR產(chǎn)物通過2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，于170 bp及209 bp處出現(xiàn)特異性目標(biāo)條帶（圖1）。

2.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果

食管鱗癌組織中HOTAIRmRNA表達(dá)高于癌旁組織（Z＝－2.507，P＝0.012），TGF-β1mRNA表達(dá)低于癌旁組織（Z＝－2.038，P＝0.042）。見圖2。

圖1 HOTAIR及TGF-β1 PCR產(chǎn)物電泳檢測(cè)結(jié)果

2.3 HOTAIR mRNA表達(dá)與食管鱗癌患者臨床病理特征的關(guān)系

HOTAIR mRNA表達(dá)與腫瘤分化程度（P＝ 0.041）及患者臨床分期有關(guān)（P＝0.041），與性別、年齡、腫塊的部位與大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無統(tǒng)計(jì)學(xué)相關(guān)（P＞0.05）。TGF-β1mRNA表達(dá)與腫瘤分化程度（P＝0.010）、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（P＝0.041）、臨床分期（P＝0.044）有關(guān)，與性別、年齡、腫塊的部位與大小無統(tǒng)計(jì)學(xué)相關(guān)（P＞0.05），見表1。

圖2 HOTAIR與TGF-β1 mRNA在食管鱗癌組織中的表達(dá)

表1 HOTARI和TGF-β1 m RNA與食管鱗癌患者臨床病理特征的關(guān)系 M（QR）

2.4 HOTAIR與TGF-β1間的相關(guān)性

相關(guān)分析結(jié)果表明，在食管鱗癌組織中，HOTAIR mRNA表達(dá)與TGF-β1呈負(fù)相關(guān)（r＝－0.406，P＝0.002），見圖3。

圖3 食管鱗癌組織中HOTAIR與TGF-β1 mRNA表達(dá)的相關(guān)性

3 討論

lncRNA HOTAIR是人類12號(hào)染色體HOXC基因簇的一條反義鏈，能募集哺乳動(dòng)物PRC2（主要由H3K27me3、SUZ12、EZH2和EED組成），并將其定位于2號(hào)染色體HOXD位點(diǎn)，進(jìn)而沉默該基因座基因轉(zhuǎn)錄［6－7，14］。另外，HOXD也能與CoREST／REST共抑制復(fù)合物（包含LSD1）結(jié)合［15］。因此，HOTAIR用其5′端與PRC2結(jié)合，負(fù)責(zé)H3K27甲基化，而3′端綁定LSD1復(fù)合物，介導(dǎo)H3K4me2去甲基化，從而沉默HOXD基因［16－17］。以上機(jī)制也分別在乳腺癌［7］、結(jié)直腸癌［10］中被驗(yàn)證。還有一些研究表明HOTAIR對(duì)snail蛋白［1］、PTEN［18］也有作用。因此，HOTAIR的準(zhǔn)確機(jī)制仍有待闡明。

本研究從食管鱗癌著手，比較分析了食管鱗癌組織與癌旁組織中HOTAIR mRNA的表達(dá)情況，結(jié)果顯示，與癌旁組織相比，HOTAIR mRNA在食管鱗癌組織中表達(dá)升高，且其表達(dá)隨著腫瘤分化程度的降低和臨床分期的進(jìn)展而增高，這表明HOTAIR的高表達(dá)不僅與食管鱗癌的惡性程度有關(guān)，且可能參與了食管鱗癌的發(fā)生發(fā)展。

我們?cè)谇懊嫣岬剑琍RC2的靶基因同時(shí)也受TGF-β1的調(diào)控。因此我們猜測(cè)HOTAIR與TGF-β1間存在著某種相關(guān)性，從而從另一條通路來調(diào)控下游靶基因的表達(dá)。我們的結(jié)果表明，TGF-β1作為重要的腫瘤抑制物，在食管鱗癌組織中的表達(dá)要低于癌旁組織，且與腫瘤的惡性程度、臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均有關(guān)系。同時(shí)，相關(guān)性分析結(jié)果顯示，在食管鱗癌組織中，HOTAIR mRNA表達(dá)與TGF-β1呈負(fù)相關(guān)。

TGF-β1對(duì)腫瘤的生長(zhǎng)呈抑制作用，TGFβ／Smads信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是TGF-β1發(fā)揮生物學(xué)功能的主要通路，通路中任一元件發(fā)生突變都將會(huì)影響信號(hào)的傳遞，使細(xì)胞逃避TGF-β1介導(dǎo)的生長(zhǎng)抑制作用，從而具有選擇性生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)，導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生與發(fā)展［19］。我們的結(jié)果表明，HOTAIR很可能是通過抑制TGF-β1的生物學(xué)功能來促進(jìn)食管鱗癌的發(fā)生發(fā)展，但其作用機(jī)制尚需進(jìn)一步探討和驗(yàn)證。

綜上所述，lncRNA HOTAIR的異常高表達(dá)可能參與了食管鱗癌的發(fā)生發(fā)展，且可能是通過TGF-β1實(shí)現(xiàn)其對(duì)食管鱗癌組織的促進(jìn)作用。下一步我們將從體內(nèi)體外兩方面進(jìn)一步驗(yàn)證HOTAIR在食管鱗癌中的作用，探討其與TGF-β1負(fù)相關(guān)的具體分子機(jī)制，希望能為食管鱗癌的發(fā)生發(fā)展機(jī)制提供一個(gè)新的思路。

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Expression and clinical significance of long non-coding RNA HOTAIR in patients w ith esophageal squamous cell carcinoma

ZHANG Zhao-yue1，YIN Yue1，MOU Xiao1，WU Shi1，MAO Chao-ming2，CHEN De-yu3
（1.School of Clinical Medicine，Jiangsu University，Zhenjiang Jiangsu 212001；2.Department of Nuclear Medicine，the Affiliated Hospital of Jiangsu University，Zhenjiang Jiangsu 212001；3.Department of Radiation Oncology，the Affiliated Hospital of Jiangsu University，Zhenjiang Jiangsu 212001，China）

Objective：To explore the expression and clinical significance of long non-coding RNA HOTAIR（lncRNA HOTAIR）in esophageal squamous cell carcinoma（ESCC）and analyze its correlation with transforming growth factorβ1（TGF-β1）.M ethods：Quantitative real-time polymerase chain reaction was used to detect the expressions of HOTAIRmRNA and TGF-β1mRNA in 57 ESCC tissues and matched tumor-free tissues.The relationship between HOTAIRmRNA and clinico-pathological features of ESCCwas also analyzed.Results：In comparison tomatched tumor-free tissues，the expressions of HOTAIR mRNA（Z＝－2.507，P＝0.012）and TGF-β1mRNA（Z＝－2.038，P＝0.042）were found to be elevated and lowered，respectively，in ESCC tissues.Up-regulation of HOTAIR expression was correlated with tumor differentiation degree and clinical stage.The expression of HOTAIR was negative correlated with TGF-β1（r＝－0.406，P＝0.002）.Conclusion：lncRNA HOTAIR in ESCC tissuesmay play a significant role in the occurrence and development of ESCC through TGF-β1signaling pathways.

HOTAIR；transforming growth factorβ1；esophageal squamous cell carcinoma

R735.1

A

1671－7783（2014）03－0260－04

10.13312／j.issn.1671-7783.y140007

鎮(zhèn)江市社會(huì)發(fā)展支撐計(jì)劃項(xiàng)目（SH2011019；SH2012023）

張曌玥（1988—），女，碩士研究生；陳德玉（通訊作者），教授，主任醫(yī)師，E-mail：cdeyu＠hotmail.com

2014－01－07 ［編輯］ 何承志