胰腺癌伴神經(jīng)浸潤動(dòng)物模型的建立

張曉蘭 邢鈴 張志鋼 楊鳴 吳紅玉 滿曉華 金晶 李兆申 金震東

神經(jīng)浸潤(perineural invasion ，PNI)是胰腺癌的典型表現(xiàn)，其發(fā)生率為50%～100%。PNI亦是腫瘤細(xì)胞侵犯周圍神經(jīng)及轉(zhuǎn)移擴(kuò)散的途徑之一，疼痛的產(chǎn)生也與PNI密切相關(guān)。PNI的發(fā)生預(yù)示著胰腺癌的局部復(fù)發(fā)及胰腺癌患者較差的預(yù)后[1]，但其發(fā)病機(jī)制目前仍未明確。由于缺乏有效的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ停韧槍?duì)PNI發(fā)病機(jī)制的研究多局限于體外實(shí)驗(yàn)。本研究建立有效的PNI體內(nèi)模型，模擬腫瘤細(xì)胞浸潤神經(jīng)時(shí)的體內(nèi)微環(huán)境，為PNI發(fā)病機(jī)制的研究提供一定的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

材料與方法

一、細(xì)胞培養(yǎng)

人胰腺癌細(xì)胞株CAPAN-2、PANC1及SW1990均購自美國ATCC(American Type Culture Collection)，按照ATCC推薦的培養(yǎng)條件培養(yǎng)、傳代，取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞，收集于1.5 ml EP管中備用。

二、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

4～5周齡BALB/c裸小鼠32只，體質(zhì)量18～22 g，購自上海中科院斯萊克動(dòng)物中心，于第二軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心SPF級(jí)屏障系統(tǒng)飼養(yǎng)。飼養(yǎng)條件：室溫26～28℃，相對(duì)濕度40%～60%，動(dòng)物飼養(yǎng)箱置于層流架中，飲用水、飼料及墊料均經(jīng)嚴(yán)格消毒，定期更換，專人管理。入室適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后開始實(shí)驗(yàn)。按完全隨機(jī)法分為4組，其中3組分別接種CAPAN-2、PANC1、SW1990細(xì)胞，不做任何處理的裸鼠為對(duì)照組，每組8只。

三、造模方法

BALB/c裸小鼠稱重后用1%戊巴比妥按照40 mg/kg體質(zhì)量劑量腹腔注射麻醉。待麻醉完全后，消毒裸鼠右下肢，在其股骨頭下約1～2 mm處沿股骨干走行方向切一3～4 mm的小切口，鈍性沿肌肉走行輕輕剝離肌肉，找尋并暴露坐骨神經(jīng)，在坐骨神經(jīng)周圍分別注射約106個(gè)胰腺癌細(xì)胞(圖1)，縫合切口。術(shù)后自由進(jìn)食、水。動(dòng)態(tài)觀察成瘤情況、成瘤時(shí)間。待瘤塊長至最長徑約0.8 cm時(shí)，給予1%戊巴比妥鈉麻醉裸鼠，沿股骨干剝離、切下腫瘤。給予冰PBS沖洗后將取下的腫瘤組織一分為二，一部分置-80℃冰箱凍存?zhèn)溆?，另一部分置?%多聚甲醛中固定48 h后常規(guī)行石蠟包埋、切片、HE染色，光鏡下觀察。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

圖1 暴露的坐骨神經(jīng)(a)及注射胰腺癌細(xì)胞的裸鼠(b)

結(jié) 果

一、一般狀況

對(duì)照組裸鼠體質(zhì)量增加，各癌細(xì)胞注射組裸鼠成瘤后體質(zhì)量明顯下降(表1)，活動(dòng)度下降，甚至呈現(xiàn)惡液質(zhì)，且成瘤側(cè)肢體活動(dòng)受限，跛行(圖2)。

表1 各組裸鼠的體質(zhì)量變化

注：與對(duì)照組比較，F(xiàn)=434.41，aP<0.01；與成瘤前比較，t值分別為7.719、6.481、5.640，bP<0.01

圖2 成瘤側(cè)肢體活動(dòng)受限的裸鼠

二、成瘤情況及平均成瘤時(shí)間

CAPAN-2注射組及SW1990注射組的8只裸鼠最終均成瘤，PANC1注射組只有5只成瘤。

以腫瘤最長徑長至約0.8 cm為時(shí)間截點(diǎn)，CAPAN-2注射組、PANC1注射組、SW1990注射組裸鼠的成瘤時(shí)間分別為(49.8±5.0)、(56.6±2.4)、(25.4±3.0)d。SW1990注射組3～4周成瘤，PANC1注射組8周左右成瘤，CAPAN-2注射組7～8周成瘤，3組成瘤時(shí)間的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=73.51，P<0.01)。

三、PNI造模成功率

待最終成瘤時(shí)，見腫瘤與表皮有部分粘連，但均可順利分離。剝離表皮后暴露腫瘤，見大部分腫瘤呈類球狀，部分呈不規(guī)則形狀，包繞股骨干，侵及肌肉。部分腫瘤包繞坐骨神經(jīng)(圖3a)，部分腫瘤位于坐骨神經(jīng)旁。光鏡下見癌細(xì)胞包繞神經(jīng)生長，侵犯神經(jīng)束膜(3b)。CAPAN-2注射組、PANC1注射組、SW1990注射組裸鼠造模成功率分別為87.5%(7/8)、20.0%(1/5)、50.0%(4/8)。

圖3 腫瘤包繞神經(jīng)生長(a)，侵及神經(jīng)束膜(b，HE ×100)

討 論

Batsakis[2]廣義的PNI定義為癌細(xì)胞侵及神經(jīng)內(nèi)、神經(jīng)周圍或穿過神經(jīng)。有人認(rèn)為PNI專指癌細(xì)胞能在神經(jīng)束膜內(nèi)觀察到，但這一觀點(diǎn)過于嚴(yán)格。大部分PNI是腫瘤與神經(jīng)在神經(jīng)束膜內(nèi)接觸，但在鞘膜內(nèi)并未發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞。因此，不同作者定義的腫瘤與神經(jīng)接觸的標(biāo)準(zhǔn)是不一樣的。腫瘤生長方式的描述亦包括全部包繞、部分包繞、同心型板層結(jié)構(gòu)及切面的接觸等，因而PNI的定義也不一致。大部分作者建議，腫瘤細(xì)胞環(huán)繞神經(jīng)周圍至少33%以上才能稱之為PNI。但起初描述癌細(xì)胞的PNI為癌細(xì)胞沿著腫瘤周圍神經(jīng)纖維的旁側(cè)生長[3]。Leibig等[4]定義PNI為癌細(xì)胞在神經(jīng)內(nèi)、圍繞或穿過神經(jīng)，腫瘤密切接觸神經(jīng)并至少環(huán)繞神經(jīng)外周的33%，或神經(jīng)細(xì)胞侵及神經(jīng)鞘3層結(jié)構(gòu)的任何一層。本研究以Leibig的PNI定義作為判斷標(biāo)準(zhǔn)。

目前國內(nèi)外針對(duì)胰腺癌PNI的研究大多應(yīng)用體外實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?。本?shí)驗(yàn)室既往曾應(yīng)用BD Matrigel基質(zhì)膠內(nèi)小鼠背根神經(jīng)節(jié)與人胰腺癌細(xì)胞株三維共培養(yǎng)的模式成功建立PNI的體外模型，可見神經(jīng)突觸與癌細(xì)胞間有相向生長的趨勢(shì)[5]。但體外實(shí)驗(yàn)具有一定的局限性，不能完全模擬體內(nèi)腫瘤細(xì)胞遷徙、轉(zhuǎn)移的微環(huán)境。國外有少部分PNI體內(nèi)模型建立的方法，如Gil等[6]采用微量注射器顯微注射癌細(xì)胞于裸鼠坐骨神經(jīng)建立PNI模型，用于觀察癌細(xì)胞的浸潤對(duì)神經(jīng)功能的影響。但該方法需用微量注射器及顯微注射技術(shù)，操作復(fù)雜且費(fèi)用昂貴。因此，建立一種簡單易行、復(fù)制率高的體內(nèi)動(dòng)物模型勢(shì)在必行。

根據(jù)以往體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果及相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，人胰腺癌細(xì)胞株CAPAN-2具有較高的神經(jīng)侵犯特性，PANC1具有較低的神經(jīng)侵犯特性。因此，本研究選擇不同人胰腺癌細(xì)胞株進(jìn)行裸鼠坐骨神經(jīng)周圍注射的方法建立PNI體內(nèi)模型。結(jié)果顯示， SW1990細(xì)胞擴(kuò)增速度快，成瘤成功率高，時(shí)間短，但PNI發(fā)生率不高；CAPAN-2細(xì)胞擴(kuò)增速度較慢，成瘤時(shí)間相對(duì)長，但PNI發(fā)生率最高；PANC1細(xì)胞擴(kuò)增速度慢，成瘤時(shí)間最長，PNI發(fā)生率最低。本研究結(jié)果提示細(xì)胞株的選擇對(duì)于胰腺癌PNI動(dòng)物模型造模成功有重要的影響。

本研究建立的體內(nèi)造模方法簡單、易行，但存在一定的創(chuàng)傷性，且因存在切口，如縫合不好可出現(xiàn)注射的細(xì)胞外滲，從而導(dǎo)致成瘤率下降，甚至不成瘤。另外，分離坐骨神經(jīng)時(shí)如將神經(jīng)周圍肌肉剝離暴露過多也可造成注入的癌細(xì)胞沿組織間隙擴(kuò)散，不能很好地聚集在坐骨神經(jīng)周圍，從而導(dǎo)致成瘤率及PNI發(fā)生率的下降。

參 考 文 獻(xiàn)

[1] Bapat AA, Hostetter G, Von Hoff DD, et al. Perineural invasion and associated pain in pancreatic cancer[J]. Nat Rev Cancer, 2011,11(10):695-707.

[2] Batsakis JG. Nerves and neurotropic carcinomas[J]. Ann Otol Rhinol Laryngol, 1984,94(4 Pt 1):426-427.

[3] Demir IE, Ceyhan GO, Liebl F, et al. Neural invasion in pancreatic cancer: the past, present and future[J]. Cancers(Basel), 2010,2(3):1513-1527.

[4] Liebig C, Ayala G, Wilks JA, et al. Perineural invasion in cancer: a review of the literature[J]. Cancer, 2009,115(15):3379-3391.

[5] 安薇, 李平, 李桂香, 等. 胰腺癌神經(jīng)浸潤體外模型的構(gòu)建與觀察[J]. 中華胰腺病雜志, 2012,12(3):160-163.

[6] Gil Z, Cavel O, Kelly K, et al. Paracrine regulation of pancreatic cancer cell invasion by peripheral nerves[J]. J Natl Cancer Inst, 2010,102(2):107-118.