輕癥急性胰腺炎患者血清代謝組學(xué)研究

許宏敏 張磊 康華 王宇凡 吳靜 劉懷平 周淑芬 張鳳美 劉樹業(yè)

代謝組學(xué)(metabolomics)作為系統(tǒng)生物學(xué)的重要組成部分，是繼基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)之后發(fā)展起來的一門新興的學(xué)科，其概念為“生命體系對(duì)病理生理刺激或遺傳改造所產(chǎn)生的動(dòng)態(tài)、多指標(biāo)代謝影響的定量測定”[1]。研究者通過鑒別出樣本中盡可能多的代謝物來分析不同機(jī)體狀態(tài)下的代謝組學(xué)[2-3]，期望找到某一個(gè)或某一組特異靈敏的代謝物，用以描述及區(qū)別生物體系的不同狀態(tài)。本研究聯(lián)合應(yīng)用具有高分辨率和高質(zhì)量精度的超高效液相色譜與高分辨質(zhì)譜(UPLC-HRMS)平臺(tái)，采用代謝組學(xué)的方法對(duì)輕癥急性胰腺炎(MAP)、膽石癥患者及健康志愿者的血清代謝物進(jìn)行分析，以尋找與MAP密切相關(guān)的代謝物和潛在標(biāo)志物。

材料與方法

一、研究對(duì)象

選取2012年5月至2012年12月天津市第三中心醫(yī)院肝膽外科確診并收治住院的輕癥急性胰腺炎(MAP)患者38例，診斷均符合2004年中華醫(yī)學(xué)會(huì)消化病學(xué)分會(huì)胰腺疾病學(xué)組制定的診斷及分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)[4]。38例MAP中男性18例，女性20例，平均年齡(50±16)歲。選取同期住院治療，根據(jù)臨床表現(xiàn)、B超、CT、磁共振膽胰管造影診斷為膽石癥且無合并急性胰腺炎、腫瘤性疾病的患者26例作為膽石癥組，其中男性12例，女性14例，平均年齡(59±17)歲；以同期36例健康志愿者作為對(duì)照組，其中男性16例，女性20例，平均年齡(51±16)歲。MAP組、膽石癥組、對(duì)照組入院時(shí)的平均血淀粉酶活性分別為(1170±1823)、(5230±574)、(67±26)U/L；脂肪酶為(1234±2214)、(642±556)、(41±9)U/L；胰淀粉酶為(692±1127)、(3751±366)、(21±11)U/L。從38例MAP患者中抽取11例在住院治療期間進(jìn)行病程跟蹤，分別于入院時(shí)、治療中期(治療第6天)及治愈出院前采集血清樣本，檢驗(yàn)結(jié)果見表1。

表1 11例MAP患者各階段血、尿、胰液淀粉酶及脂肪酶的變化

二、超高效液相色譜與高分辨質(zhì)譜聯(lián)用(UPLC-HRMS)分析

本研究經(jīng)天津市第三中心醫(yī)院臨床醫(yī)學(xué)研究倫理委員會(huì)同意并授權(quán)，所有患者及健康志愿者血清標(biāo)本采集前均經(jīng)本人或家屬知情同意。MAP及膽石癥患者于入院次日清晨空腹采集靜脈血，其中11例在入院治療第6天及出院前再次采集靜脈血，健康志愿者空腹12 h后采靜脈血。血標(biāo)本經(jīng)離心分離血清，置-80℃冷凍保存。分析前室溫下解凍，取100 μl血清與300 μl甲醇混合，劇烈振蕩30 s后 4℃靜置5 min，再在4℃下12 000 g離心15 min，取上清液上樣。

Accela超高效液相色譜系統(tǒng)為Thermo Fisher公司產(chǎn)品，色譜柱為Thermo Hypersil GOLD反相C18柱(2.1 mm i.d.×50 mm. 1.9 μm)。自動(dòng)進(jìn)樣器溫度設(shè)定在4℃，柱溫設(shè)定在20℃，進(jìn)樣量為10 μl。上樣后采用二元溶劑梯度洗脫。流動(dòng)相A液為0.1%甲酸水溶液，流動(dòng)相B液為0.1%甲酸乙腈溶液，洗脫起始梯度為95%A液與5%B液的混合液，洗脫3.5 min，然后10 min的洗脫過程中混合液的A液從95%線性降至5%，而B液從5%線性增加至95%，并維持3 min，迅速換成起始梯度洗脫3.5 min以平衡色譜柱?？偵V洗脫過程為20 min，流速設(shè)定在200 μl/min。

LTQ Orbitrap XL雜交質(zhì)譜系統(tǒng)為Thermo Fisher公司產(chǎn)品，采用正離子掃描模式，離子源電壓4.5 kV，毛細(xì)管電壓30 V，錐孔電壓150 V，去溶劑化溫度設(shè)定為350℃，鞘氣流速為30 arb(99.999%氮?dú)?，輔氣流速5 arb(99.999%氮?dú)?。色譜洗脫20 min過程中采集數(shù)據(jù)，采集范圍在質(zhì)荷比(m/z)50～1000，質(zhì)譜分辨率設(shè)定為100 000(FMHW)。二級(jí)質(zhì)譜檢測采用碰撞誘導(dǎo)解離模式(CID)，能量設(shè)定在35(標(biāo)準(zhǔn)化碰撞能量)，碰撞氣為高純氦氣(99.9999%氦氣)。

三、差異代謝物的篩選及鑒定

利用MZmine 2.0軟件[5]對(duì)數(shù)據(jù)按照提取離子色譜峰強(qiáng)度信噪比(S/N)>10，保留時(shí)間(RT)偏移不超過±0.2 min及m/z值偏差不超過±0.02的規(guī)則進(jìn)行峰的識(shí)別、匹配及歸一化處理。血清代謝物的相對(duì)含量以色譜峰積分面積表示。數(shù)據(jù)導(dǎo)入SIMCA-P+12.0.1.0軟件[6](瑞典Umetrics公司)，通過模式識(shí)別方法來構(gòu)建主成分分析(PCA)和正交偏最小二乘判別分析(OPLS-DA)模型[7-8]。根據(jù)代謝物離子含量差異對(duì)于模型構(gòu)建的重要程度(very importance, VI)值及VI置信區(qū)間篩選差異代謝物。在VI值>1的代謝物中排除在VI圖和系數(shù)圖上置信區(qū)間包含零的代謝物，再通過載荷圖確保篩選出的代謝物同時(shí)具有較大的變化程度和較高可靠性，初步篩選潛在的差異代謝物[9]。以差異代謝物的精確m/z值查找HMDB(http://hmdb.ca/)數(shù)據(jù)庫，按照m/z值偏差不超過0.01的規(guī)則、準(zhǔn)確電荷數(shù)以及與實(shí)驗(yàn)條件相符合的電離方式對(duì)檢索結(jié)果進(jìn)行校驗(yàn)，保留與要求相匹配物質(zhì)的鑒定結(jié)果；同時(shí)將差異代謝物行MS/MS掃描，獲得的二級(jí)質(zhì)譜圖與Mass Frontier6.0軟件(Thermo Fisher公司)自帶數(shù)據(jù)庫模擬出HMDB鑒定結(jié)果的理論碎片進(jìn)行比對(duì)，按照特征離子的二級(jí)質(zhì)譜m/z值與理論碎片比對(duì)偏差不超過0.2(二級(jí)質(zhì)譜碎片由離子阱質(zhì)譜CID模式產(chǎn)生)，理論碎片能夠與特征離子二級(jí)碎片的三強(qiáng)峰相匹配且能夠覆蓋特征離子二級(jí)碎片質(zhì)譜峰的80%以上的原則對(duì)差異代謝物進(jìn)行鑒定。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

一、總離子流圖及PCA、OPLS-DA模型分析

MAP組、膽石癥組與健康對(duì)照組血清總離子流圖(TIC)見圖1。從MAP組患者入院時(shí)、治療中期、治愈出院以及膽石癥組、對(duì)照組共122個(gè)血清樣本中提取出內(nèi)源性代謝物432個(gè)，每一個(gè)代謝物離子均有其特定的m/z及RT。

圖1 MAP組(上)、膽石癥組(中)、對(duì)照組(下)血清樣本的總離子流圖

隨機(jī)選取MAP組、膽石癥組、對(duì)照組各70%的血清樣本作為模型組，余30%的血清樣本作為驗(yàn)證組。應(yīng)用模型組血清標(biāo)本構(gòu)建的PCA模型擁有10個(gè)主成分(R2X=77.1%，Q2=23.5%，圖2a)，MAP組和對(duì)照組的血清代謝物具有一定的區(qū)分聚類趨勢；構(gòu)建的OPLS-DA模型含有2個(gè)預(yù)測主成分及5個(gè)正交主成分(R2X=58.7%，R2Y=84.0%，Q2=62.8%，圖2b)，3組樣本呈明顯的區(qū)分聚類，具有很好的擬合性和預(yù)測能力。應(yīng)用驗(yàn)證組血清標(biāo)本對(duì)所構(gòu)建的OPLS-DA模型的預(yù)測能力進(jìn)行驗(yàn)證，全部血清標(biāo)本均能夠正確地歸入分組聚類，模型的預(yù)測準(zhǔn)確度達(dá)100%(圖2c)。

圖2 模型組樣本構(gòu)建的PCA模型(上)、OPLS-DA模型(中)及驗(yàn)證組血清樣本的OPLS-DA模型圖(下)

二、差異代謝物的篩選及鑒定

在提取的432個(gè)代謝物中共篩選出49個(gè)差異代謝物，經(jīng)非參數(shù)檢驗(yàn)，MAP組與膽石癥組或?qū)φ战M間存在12個(gè)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的差異代謝物，其中鞘氨醇、辛酰膽堿、甘氨膽酸、十四烷酸、癸?；憠A、十二烷醇、2-十四酮、L-甲狀腺原氨酸8個(gè)差異代謝物經(jīng)物質(zhì)鑒定結(jié)果可靠。它們?cè)贛AP時(shí)的血清含量均較健康者升高。與膽石癥患者比較，血清鞘氨醇、辛酰膽堿、十四烷酸、癸?；憠A、十二烷醇、2-十四酮含量顯著升高，而甘氨膽酸、L-甲狀腺原氨酸含量顯著下降，差異均存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，表2)。

表2 差異代謝物鑒定結(jié)果及相對(duì)含量比較

三、差異代謝物的臨床診斷價(jià)值

由篩選出的12個(gè)差異代謝物分別構(gòu)建MAP組(26例)與膽石癥組(26例)、MAP組(26例)與 對(duì)照組(36例)的二級(jí)SVM分類模型，兩個(gè)模型的內(nèi)核函數(shù)均為RBFkernel，由SVM經(jīng)十倍交叉驗(yàn)證取得的敏感度、準(zhǔn)確度均為100%，均無假陽性，表明差異代謝物對(duì)MAP的診斷及鑒別診斷具有極大的潛在臨床應(yīng)用價(jià)值。

評(píng)估篩選出的12個(gè)差異代謝物和實(shí)驗(yàn)室檢查常用的血、尿、胰液淀粉酶及脂肪酶的ROC曲線見圖3。12個(gè)差異代謝物的曲線下面積(AUC)均大于實(shí)驗(yàn)室常用指標(biāo)，其中辛酰膽堿的診斷價(jià)值最高，其AUC達(dá)0.865。

圖3 12個(gè)差異代謝物及胰液淀粉酶 、脂肪酶、尿淀粉酶、血清淀粉酶對(duì)MAP診斷的ROC曲線

四、差異代謝物與病情變化的相關(guān)性

根據(jù)11例MAP患者動(dòng)態(tài)跟蹤血清樣本與對(duì)照組樣本構(gòu)建的OPLS-DA模型含有一個(gè)預(yù)測主成分及2個(gè)正交主成分(R2X=41.5%，R2Y=35.7%，Q2=24.2%，圖4)。隨著治療進(jìn)程MAP患者的差異代謝物含量呈現(xiàn)逐漸恢復(fù)趨勢，逐漸接近健康人群水平。通過血清差異代謝物含量的變化趨勢與對(duì)照組該代謝物的血清含量的對(duì)比，鞘氨酸、L-甲狀腺原氨酸、甘氨膽酸及2-十四酮4種代謝物隨著治療進(jìn)程均呈逐漸下降趨勢，并逐漸接近正常水平(圖5)，出院前的水平較入院時(shí)水平顯著下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.05)。

圖4 MAP患者入院時(shí)(1)、治療中期(2)、治愈出院前(3)的血清差異代謝物的OPLS-DS圖

aP<0.05，bP<0.01

討 論

在現(xiàn)今階段，急性胰腺炎(AP)的臨床診斷準(zhǔn)確率雖然較以往呈上升趨勢，但仍容易與許多疾病發(fā)生混淆，例如膽囊炎、膽道蛔蟲病、胃及十二指腸潰瘍穿孔、腎絞痛、冠心病或心肌梗死等。特別是膽石癥、膽囊炎，在臨床檢驗(yàn)中通常是依據(jù)患者血清淀粉酶與脂肪酶上升倍數(shù)的不同來進(jìn)行區(qū)分，但是這種方法的特異性不高，在無影像學(xué)支持的情況下容易出現(xiàn)誤診。因此，提高對(duì)AP診斷、治療和病程監(jiān)測、預(yù)后判斷無疑將具有重大的意義。

Lusczek等[12]應(yīng)用核磁共振技術(shù)對(duì)輕度AP患者和慢性胰腺炎(CP )患者的尿液進(jìn)行代謝組學(xué)掃描，并與健康對(duì)照組進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)了5個(gè)可以區(qū)分胰腺炎患者與健康者的代謝物，但未發(fā)現(xiàn)可以區(qū)分AP與CP的代謝物。該實(shí)驗(yàn)因其標(biāo)本量等的限制具有一定的局限性，但仍為胰腺炎的代謝組學(xué)研究打開了新的思路，同時(shí)在方法學(xué)方面奠定了一定基礎(chǔ)。

本研究聯(lián)合應(yīng)用超高效液相色譜與高分辨質(zhì)譜(UPLC-HRMS)分析平臺(tái)對(duì)MAP患者、膽石癥患者及健康對(duì)照人群的血清進(jìn)行代謝組學(xué)分析，并對(duì)11例MAP患者進(jìn)行縱向病程跟蹤，結(jié)果在血清標(biāo)本中提取出432個(gè)內(nèi)源性代謝物。通過PCA模型及OPLS-DA模型篩選出49個(gè)差異代謝物，再經(jīng)過非參數(shù)檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)其中在3組之間均存在著顯著性差異的12個(gè)差異代謝物。它們的受試者工作特征曲線下面積均大于實(shí)驗(yàn)室常用的淀粉酶、脂肪酶的曲線下面積。經(jīng)過物質(zhì)鑒定，結(jié)果可靠的有鞘氨醇、辛酰膽堿、甘氨膽酸、十四烷酸、癸?；憠A、十二烷醇、2-十四酮、L-甲狀腺原氨酸8個(gè)差異代謝物，它們?cè)贏P時(shí)的血清含量均較健康者升高。與膽石癥患者比較，AP患者血清鞘氨醇、辛酰膽堿、十四烷酸、癸?；憠A、十二烷醇、2-十四酮含量顯著升高，而甘氨膽酸、L-甲狀腺原氨酸含量顯著下降。

鞘氨醇是細(xì)胞膜的組成部分。在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和血清實(shí)驗(yàn)中，鞘氨醇濃度與炎癥的嚴(yán)重程度反應(yīng)呈正相關(guān)[13-16]。AP時(shí)血清鞘氨醇水平的升高可能是胰蛋白酶水解后造成大量細(xì)胞破裂所致[17]。辛酰膽堿和癸?；憠A屬于膽堿類物質(zhì)，都是膽堿與脂肪酸在膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶作用下通過酯化反應(yīng)形成的產(chǎn)物[18]。膽堿類物質(zhì)代謝通路是炎癥反應(yīng)中的重要通路之一，在小鼠AP模型中，膽堿酯酶與AP的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)，而膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶與AP的嚴(yán)重程度呈負(fù)相關(guān)[19]，從而導(dǎo)致它們?cè)谘逯泻康淖兓８拾蹦懰崾悄懼岬慕M成成分。Vinokurova等[20]報(bào)道，CP患者血清甘氨膽酸呈下降趨勢。本研究結(jié)果顯示其在AP時(shí)升高，可能與AP發(fā)病期間胰腺分泌物的不正常排放相關(guān)。十四烷酸是一種飽和脂肪酸，在磷脂酶D的介導(dǎo)下合成磷脂酸。AP期間磷脂酶D的活性降低，導(dǎo)致十四烷酸堆積，血液中含量上升[21]。

本研究首次發(fā)現(xiàn)血清癸?；憠A、十二烷醇、2-十四酮含量在AP時(shí)升高，其原因尚不清楚。但這3個(gè)差異代謝物與另5個(gè)曾有過報(bào)道的差異代謝物一樣，對(duì)AP的診斷基因潛在的應(yīng)用價(jià)值。

本研究對(duì)部分AP患者進(jìn)行動(dòng)態(tài)檢測，發(fā)現(xiàn)鞘氨酸、L-甲狀腺原氨酸、甘氨膽酸及2-十四酮等4種代謝物隨著治療進(jìn)程均呈逐漸下降趨勢，并逐漸接近正常水平，有可能作為AP臨床病程檢測的代謝標(biāo)志物。

但本研究的病例有限，且病種不完整，需補(bǔ)充病例數(shù)量及擴(kuò)大病種類別以進(jìn)一步驗(yàn)證本結(jié)果的結(jié)論。

參 考 文 獻(xiàn)

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