親水／反相二維色譜法制備桔梗中的三萜皂苷

邢倩倩， 傅 青， 金 郁， 梁鑫淼

（華東理工大學(xué)藥學(xué)院，上海200237）

桔梗是草本藥食同源植物，其主要藥理作用為消炎、止咳、祛痰、抗癌及免疫調(diào)節(jié)等。桔梗的主要化學(xué)成分為三萜皂苷、黃酮、多糖和花色苷等，其有效成分主要為齊墩果烷型三萜皂苷［1］。迄今已報道的桔梗中的三萜皂苷類成分有幾十種［2］，按照其母核的區(qū)別主要分為桔梗酸類、桔梗二酸類和遠(yuǎn)志酸類［3］。桔梗中以桔梗皂苷D和桔梗皂苷E含量居高，《中國藥典》（2010版）和《香港中藥材標(biāo)準(zhǔn)第二期》（2008版）分別以這兩種皂苷作為桔梗藥材質(zhì)量控制的指標(biāo)成分。隨著分離分析技術(shù)的提高，發(fā)現(xiàn)桔梗中仍含有大量的未知皂苷，需要開展更深入的分離制備工作。

傳統(tǒng)的皂苷單體制備通常選擇柱層析技術(shù)。近些年來，越來越多的分離純化技術(shù)用于桔梗皂苷單體的制備。如He等［2］使用3種不同的層析柱對總樣進(jìn)行前處理，然后選擇反相制備色譜純化桔梗中的三萜皂苷。高速逆流色譜作為一種快速發(fā)展的技術(shù)，亦應(yīng)用于三萜皂苷的制備。Young等［4］使用高速逆流色譜分離制備了桔梗中的6種主要皂苷，且純度均在90%以上。但是該技術(shù)更適用于簡單樣品或含量較高樣品的制備，在涉及復(fù)雜樣品及微量樣品的分離制備時，通常需要與反相色譜結(jié)合使用。如In等［5］選擇高速逆流色譜首先對桔梗中的微量皂苷進(jìn)行粗分離，再使用反相制備色譜進(jìn)行純化，得到兩種高純度的微量皂苷。由此可見，反相色譜在三萜皂苷的純化制備方面起著重要作用。反相色譜因其具有分離效率高、重現(xiàn)性好的優(yōu)點，在三萜皂苷的分離分析方面應(yīng)用廣泛［6，7］。桔梗中所含三萜皂苷種類多，結(jié)構(gòu)差異小，單使用反相色譜很難達(dá)到高效制備的需求。綜上所述，對桔梗中的三萜皂苷類化合物進(jìn)行分離純化，需將反相色譜和與之具有分離正交性的方法結(jié)合，從而有效的解決分離選擇性的問題。

桔梗中的三萜皂苷結(jié)構(gòu)由齊墩果烷型母核連接糖鏈構(gòu)成，同時具有親水基團(tuán)（糖）和疏水基團(tuán)（母核）。由此推測，這類化合物在親水色譜上應(yīng)有較好的保留。親水色譜模式在糖苷類化合物的分離分析上應(yīng)用較多［8，9］，也有學(xué)者對三萜皂苷在親水分離模式下的分離分析進(jìn)行了探討［10］。親水色譜與反相色譜的保留機理有很大的差異，因此這兩種分離模式具有很好的正交性。Xing等［11］建立親水／反相二維色譜模式－串聯(lián)質(zhì)譜檢測三七中的三萜皂苷，共檢測出224種皂苷。

本文在對桔梗進(jìn)行水煮醇沉后，選擇反相和親水固相萃?。⊿PE）過程分別去除桔梗水提物中的強極性和弱極性雜質(zhì)，得到三萜皂苷類組分；使用親水制備色譜對三萜皂苷類組分進(jìn)行分離，得到精細(xì)組分；然后選取代表性的精細(xì)組分，使用反相制備色譜對其進(jìn)行分離純化。本文建立的親水／反相二維色譜方法對于復(fù)雜樣品中三萜皂苷類化合物的分離純化具有一定的借鑒意義。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

分析型儀器：Waters Alliance高效液相色譜（美國Waters公司），包括2695四元梯度泵、2489紫外檢測器、自動進(jìn)樣器和柱溫箱。超高效液相色譜－串聯(lián)四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀（ACQUITY UPLCTMSystem with a Quattro Micro MS，美國 Waters公司），采用電噴霧（ESI）離子源。

制備型儀器：Waters自動純化系統(tǒng)（美國 Waters公司），包括2545二元梯度泵、2489紫外檢測器、2767餾分收集器和自動進(jìn)樣器。

采用Masslynx 4.1操作軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行采集和處理。

樣品濃縮儀器：90YY40－2GT真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海上自儀轉(zhuǎn)速表儀表電機有限公司）；冷凍干燥機（Scientz－10N）。

試劑：色譜級乙腈購于百靈威（北京）；色譜級甲醇購于禹王公司（山東）；色譜級甲酸購于Acros公司（北京）；工業(yè)級乙腈和甲醇購于上海禾汽化工科技有限公司；制備級乙腈購于安徽時聯(lián)特種溶劑股份有限公司；流動相用水為 Milli－Q超純水（Millipore，美國）。

材料：桔梗飲片購于雷允上藥店（上海）；親水Click XIon及反相C1固相萃取填料（60～100 μm）、XAmide（150 mm×4.6 mm，5μm）、XAmide（150 mm×20 mm，5μm）（華譜新創(chuàng)科技有限公司，北京）；Atlantis T3（150 mm×4.6 mm，5μm）、Atlantis PrepT3（100 mm×30 mm，5μm）（Waters，美國）。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品前處理

稱取2 kg桔梗飲片，加入20 L水煎煮2 h后抽濾取濾液，緩慢滴加乙醇至體積分?jǐn)?shù)為75%，在4℃下靜置過夜。抽濾，取濾液旋蒸，除去濾液中乙醇后用反相SPE柱（20 g／60 mL，C1，60～100μL）處理。反相SPE柱先經(jīng)甲醇活化，再用水平衡后上樣，分別用甲醇－水（1∶9，如無特殊說明均為體積比）和甲醇洗脫，收集甲醇洗脫部分。繼續(xù)使用親水SPE柱（20 g／60 mL，Click XIon，60～100μL）處理。親水SPE經(jīng)水活化和乙腈平衡后，取反相SPE處理后的樣品上樣，用乙腈－水（6∶4）洗脫，收集即得桔梗中三萜皂苷類組分。

1.2.2 色譜條件

分析型親水色譜條件：色譜柱為XAmide（150mm×4.6 mm，5μm）；流動相為水（A）和乙腈（B）。梯度洗脫條件如下：0到30 min，B相從95%到60%；30到35 min，B相保持在60%。流速為1.0 mL／min；檢測波長為203 nm；進(jìn)樣量為20μL。

親水色譜制備過程在Waters自動純化系統(tǒng)上完成，樣品質(zhì)量濃度為250 g／L；所用色譜柱為XAmide（150 mm×20 mm，5μm）；梯度條件與分析級別相同；流速為20.0 mL／min；觸發(fā)波長為203 nm。

分析型反相色譜條件：色譜柱為Atlantis T3（150 mm×4.6 mm，5μm）；流動相為水（A）和乙腈（B）。梯度洗脫條件如下：0到30 min，B相保持在20%；30到35 min，B相從20%到95%。流速為1.0 mL／min；檢測波長為203 nm；進(jìn)樣量為5μL。

反相制備過程在Waters自動純化系統(tǒng)上完成，樣品質(zhì)量濃度為100 g／L；所用色譜柱為Atlantis T3（100 mm×30 mm，5μm）；梯度條件和檢測波長均與分析級別相同；流速為42.5 mL／min。

色譜－質(zhì)譜分析條件：色譜柱為Atlantis T3（150 mm×4.6 mm，5μm）；流動相為0.1%（v／v）甲酸水溶液（A）和0.1%（v／v）甲酸乙腈溶液（B）。梯度洗脫條件如下：0到30 min，B相保持在20%；30到35 min，B 相從 20% 到 95%；流速為 1.0 mL／min。電噴霧電離源，正離子檢測模式，脫溶劑氣為氮氣，脫溶劑氣流速為600 L／h，脫溶劑溫度為380℃，離子源溫度為120℃，毛細(xì)管電壓為2.5 kV，錐孔電壓為15 V。

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品前處理

由于桔梗皂苷結(jié)構(gòu)中多數(shù)含有5個以上的糖單元，極性相對較大，故選定水提醇沉的提取方式。醇沉過程可除去占提取液60%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）的雜質(zhì)。醇沉的提取液顏色依然較深，反相色譜分析結(jié)果顯示其中仍存在大量的強極性物質(zhì)（見圖1a）。通過反相SPE處理，甲醇－水（1∶9）洗脫，可以去除其中的強極性物質(zhì)，再經(jīng)甲醇洗脫得到所需要的組分。經(jīng)過此過程處理得到的樣品仍含有一定量的色素及少量的弱極性物質(zhì)。選擇親水SPE將色素吸附在SPE柱上，在乙腈－水（6∶4）洗脫條件下，得到三萜皂苷類組分（見圖1b）。連續(xù)反相、正相SPE處理后，可避免提取液中的雜質(zhì)對后續(xù)親水色譜和反相色譜分離的干擾。

2.2 三萜皂苷類組分在親水色譜條件下的分離

圖1 桔梗提取物處理（a）前、（b）后的反相色譜分析譜圖Fig.1 Analytical RPLC chromatograms of（a）pre－and（b）post－pretreatment extract from Platycodon grandiflorum

三萜皂苷在親水色譜中的保留規(guī)律與其結(jié)構(gòu)上的糖個數(shù)密切相關(guān)，通常隨著糖個數(shù)的增加，其保留增強。由于親水色譜對三萜皂苷的分離度不及反相色譜，選定親水色譜作為第一維對三萜皂苷類組分進(jìn)行分離。

首先進(jìn)行色譜柱和流動相兩個參數(shù)的優(yōu)化。基于三萜皂苷結(jié)構(gòu)特性，選擇酰胺固定相（XAmide）對其進(jìn)行分離。親水模式下，水和乙腈是常用的流動相［12］。研究發(fā)現(xiàn)，在水中加入三氟乙酸和甲酸銨，三萜皂苷的保留時間及分離度都沒有明顯改善，所以選定流動相為乙腈和水，分析譜圖如圖2所示。

進(jìn)一步，將分析條件放大到制備級別。選定制備柱型號為XAmide（150 mm×20 mm），為使制備柱達(dá)到與分析柱類似的分離效果，需保證在相同的梯度條件下兩種色譜柱具有相同的線速度。相應(yīng)流速可由公式（1）計算：

其中，F(xiàn)Anal和DAnal分別代表分析型系統(tǒng)中洗脫液的流速和色譜柱內(nèi)徑，F(xiàn)Prep和DPrep分別代表制備型系統(tǒng)中洗脫液的流速和色譜柱內(nèi)徑。根據(jù)該公式計算，制備條件下流速為18.9 mL／min?？紤]到制備型儀器泵的精確性，選定流速為20.0 mL／min。

在制備過程中進(jìn)樣體積較大，為了避免穿透現(xiàn)象需選擇合適的上樣溶劑。三萜皂苷在甲醇、乙醇、正丁醇等中等極性溶劑中溶解性較好，考慮到在親水色譜中甲醇的洗脫能力比水弱，所以以甲醇為上樣溶劑。其相應(yīng)的制備色譜圖如圖3所示，與分析譜圖（圖2）相似，分離效果有所下降。

圖2 桔梗中三萜皂苷類組分的親水色譜分析譜圖Fig.2 Analytical HILIC chromatogram of triterpenesaponins fromPlatycodon grandiflorum

圖3 桔梗中三萜皂苷類組分的親水色譜制備譜圖Fig.3 Preparative HILIC chromatogram of triterpene saponins fromPlatycodon grandiflorum

桔梗皂苷類組分按照時間觸發(fā)模式，每1 min收集一次，在6～25 min內(nèi)共收集20個組分。連續(xù)進(jìn)樣，完成20.00 g桔梗皂苷類組分的親水色譜分離，合并相同時間組分，凍干，稱重。得到各組分的質(zhì)量如表1所示。

通過第一維的親水色譜制備，大大降低了樣品的復(fù)雜性。親水色譜制備中，總上樣量為20.00 g，20個組分的質(zhì)量之和為15.64 g，從洗針液中回收樣品1.92 g，考慮到制備過程中前5 min未收集部分，該制備方法的回收率較高。

表1 親水色譜制備得到的各個組分的質(zhì)量Table 1 Mass of the preparative HILIC fractions fromPlatycodon grandiflorum

2.3 JG23組分中單體化合物的反相制備及表征

JG23為親水色譜上收集的第18個組分，保留時間為23～24 min，質(zhì)量為1.11 g。該組分在反相Atlantis T3色譜柱上分析獲得的色譜圖如圖4所示。JG23組分在親水色譜模式下為一個色譜峰，在反相模式下為分離度較高的兩個色譜峰。由于其在兩種模式下的分離呈現(xiàn)較好的正交性，故作為代表性組分進(jìn)行制備過程示范。第二維反相色譜制備過程使用Atlantis T3 Prep色譜柱（100 mm×30 mm，5μm），根據(jù)公式（1）計算得到流速為42.5mL／min。相應(yīng)制備色譜圖如圖4b所示，制備色譜圖與分析色譜圖沒有明顯差別。

圖4 優(yōu)化條件下JG23組分在（a）分析和（b）制備水平的反相液相色譜圖Fig.4 Analytical and preparative RPLC chromatograms of JG23 under the optimum conditions

以紫外觸發(fā)的方式進(jìn)行餾分收集，收集的餾分經(jīng)過處理，得到單體化合物JG23－1和JG23－2，質(zhì)量分別為26.2 mg和135.9 mg，色譜峰純度分別為91.42%和98.43%。以質(zhì)譜和核磁共振對其進(jìn)行分析。質(zhì)譜結(jié)果如圖5所示，根據(jù)正離子模式下形成的［M＋H］＋峰推斷其相對分子質(zhì)量分別為1 416和1 548。通過質(zhì)譜解析，確定JG23－1結(jié)構(gòu)上糖單元信息為3個六碳糖、1個脫氧六碳糖和2個五碳糖；JG23－2結(jié)構(gòu)上糖單元信息為3個六碳糖、1個脫氧六碳糖和3個五碳糖。結(jié)合核磁數(shù)據(jù)（未給出），確定兩個化合物分別為deapi－platycoside E和platycoside E（桔梗皂苷E）［13］（見圖6）。

圖 5 JG23－1和JG23－2的質(zhì)譜圖Fig.5 Mass spectra of JG23－1 and JG23－2

圖 6 JG23－1和JG23－2的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.6 Chemical structures of JG23－1 and JG23－2

3 結(jié)論

本文以桔梗藥材為研究對象，結(jié)合色譜填料建立前處理方法，除去其中的非皂苷雜質(zhì)，得到三萜皂苷類組分。構(gòu)建了親水／反相二維色譜法對三萜皂苷類組分進(jìn)行分離純化，成功得到兩個單體化合物，經(jīng)分析其純度均達(dá)到90%以上。使用質(zhì)譜和核磁共振對其定性，確定這兩種化合物分別為deapiplatycoside E和platycoside E。本文所用方法步驟少、簡便，對于復(fù)雜樣品中皂苷的分離純化具有較好的實際應(yīng)用價值。

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