液相色譜－串聯(lián)質譜法同時測定生物組織全基因組DNA甲基化和羥甲基化水平

木曉麗， 張 潔， 彭思遠， 王曉雪， 申河清

（中國科學院城市環(huán)境研究所，城市環(huán)境與健康重點實驗室，福建 廈門361021）

表觀遺傳學研究基因表達在核苷酸序列不發(fā)生改變的情況下進行的可遺傳性變化。DNA甲基化是研究最為廣泛的表觀遺傳修飾，胞嘧啶在甲基轉移酶的作用下形成 5－甲基胞嘧啶（5－methylcytidine，5mC）。異常的DNA甲基化會導致染色質構象改變，最終抑制基因轉錄，改變基因表達量和活性；同時，還會影響細胞的增殖和分化，并與癌癥的誘發(fā)有著密切的聯(lián)系［1－4］。繼胞嘧啶的5－甲基修飾形式之后，被稱為第6個堿基的5－羥甲基胞嘧啶（5－h(huán)ydroxymethylcytosine，5hmC）作為又一重要的表觀遺傳修飾受到廣泛關注。甲基胞嘧啶雙加氧酶（ten－eleven translocation，tet）可將羥基轉移到5mC上形成5hmC。5hmC被認為是DNA去甲基化過程中的關鍵中間產(chǎn)物，羥甲基化DNA具有參與基因表達調控的潛在功能，同時5hmC可以通過多種途徑重新轉化成未修飾胞嘧啶，修復異常的DNA甲基化［5，6］。準確測定全基因組DNA甲基化和羥甲基化水平對于研究疾病機理和環(huán)境污染物健康效應具有重要的作用。

全基因組整體甲基化水平的分析方法主要包括SssI甲基轉移酶法、氯乙醛法、免疫化學法和高效液相色譜及相關方法。作為最早發(fā)展的方法，SssI甲基轉移酶法由于酶不穩(wěn)定導致結果不夠精確［7］。氯乙醛反應法具有較高的靈敏度和穩(wěn)定性，但是操作費時費力，而且氯乙醛為有毒物質［8］。免疫化學法可以對DNA甲基化和羥甲基化水平進行測定，但是由于使用特異性抗體，檢測成本較高。近年來，高效液相色譜成為基因組整體水平DNA甲基化水平的主流檢測方法［9］。但是受紫外檢測器本身靈敏度的限制，該法對于DNA含量較低的生物樣品的分析不夠理想。除此以外，高效毛細管電泳法、單分子實時測序方法和酶區(qū)甲基化分析方法也被應用于全基因組DNA甲基化和羥甲基化水平的檢測［9－12］。最近的研究發(fā)現(xiàn)生物體內5hmC的含量非常低［13］，而且存在多種不同基團修飾的胞嘧啶［5］，酶學方法和亞硫酸鹽處理等技術不能區(qū)分不同基團修飾的胞嘧啶，亟待發(fā)展可以同時高效、準確測定5mC和5hmC的檢測方法。我們最近采用串聯(lián)質譜作為檢測器，測定了細胞系和血漿、精子樣本的全基因組DNA甲基化率［14］。本研究在以前的基礎上改進了液相色譜－串聯(lián)質譜法，可同時定量測定5mC和5hmC，并應用于研究砷暴露大鼠全基因組DNA甲基化和羥甲基化水平。該方法快速簡便且重現(xiàn)性好，具有較高的靈敏度和準確度，能夠滿足生物樣品中5mC和5hmC定量分析要求。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

UltimateTMLC－液相色譜（Dionex，美國）；5500 QTRAP串聯(lián)質譜（ABI，美國）；凝膠成像系統(tǒng)（Bio－RAD，美國）；kinetex?core－shell C18柱（Phenomenex，美國）；恒溫水浴鍋（上海梅香儀器，中國）；臺式高速冷凍離心機（Hettich，德國）；ND－1000超微量紫外分光光度計（NanoDrop，美國）；80℃超低溫冰箱（海爾，中國）；Milli－Q 超純水處理系統(tǒng)（Pall，美國）；微量移液器（10、20、100、200、1 000、5 000μL）（Eppendorf，德國）。亞砷酸鈉（NaAsO2，分析純，國家標準物質中心，中國）；DNA提取試劑盒（DNeasy Blood ＆ Tissue Kit，QIAGEN，德 國）；RNase A （天根生化，中國）；DNaseⅠ（RNasefree）、FastAPTMThermosensitive Alkaline Phosphatase、ExonucleaseⅠ（Fermentas，加拿大）；5－甲基脫氧胞嘧啶核苷（2′－deoxy－5－methylcytidine，5mdC，東京仁成工業(yè)株式會社，日本）；脫氧鳥嘌呤核苷（deoxyguanosine，dG，百靈威，中國）；5－甲基脫氧胞 嘧 啶 DNA 標 準 品 （5－Methylcytosine ＆ 5－Hydroxymethylcytosine DNA Standard，Zymo Research，美國）；甲醇（色譜純，Honeywell，美國）。

1.2 動物暴露實驗

SPF級健康Sprague Dawley雄性大鼠30只（購自上海斯萊克實驗動物有限公司），體重為（200±10）g。適應性飼養(yǎng)1周后，大鼠隨機分組編號：對照組為6只，暴露組為8只。暴露組飲水中亞砷酸鈉的質量濃度分別為2 mg／L。動物每日經(jīng)自然飲水連續(xù)暴露染毒，持續(xù)9周。大鼠每日給予充足飲水和食物，并記錄每日飲水消耗量，每7天測量1次體重。9周后進行取材。使大鼠吸入乙醚麻醉，仰臥固定于操作臺，對其進行解剖，取其肝臟和小腦，至于－80℃保存待用。

1.3 DNA的提取和酶解

取保存于－80℃的肝臟和小腦樣品，置于－20℃半小時，而后于4℃對樣品進行退凍。稱取適量的樣品，采用DNA提取試劑盒提取DNA，流程嚴格按照試劑盒說明書進行。為避免RNA干擾實驗結果，在提取過程中加入RNase A，并在提取后用1%瓊脂糖凝膠電泳檢驗提取結果。利用超微量紫外分光光度計測定提取的DNA濃度。DNA的酶解參照文獻［14，15］報道的方法。根據(jù)測得的DNA濃度，取1μg DNA樣品于100℃水浴中加熱3 min，然后冰浴10 min，加入1／10體積的0.1 mol／L醋酸銨溶液（pH7.5）；加入2 units DNaseⅠ，于37℃水浴中孵育3 h；然后加入2 units Alkaline Phosphatase，于37℃水浴中孵育3 h；最后加入40 units ExonucleaseⅠ，于37℃水浴中孵育過夜保證DNA酶解完全。酶解后用1%瓊脂糖凝膠電泳檢驗酶解效果。

1.4 標準溶液的配制

分別精確稱取1 mg 5mdC和dG；用超純水定容并稀釋得到標準溶液。5mdC的標準溶液質量濃度為0.05、0.25、0.40、1.00和5.00 ng／mL，dG的標準溶液質量濃度為1、5、10和20 ng／mL。5－羥甲基脫氧胞嘧啶DNA標準品為897 bp的DNA片段，其中的胞嘧啶已全部經(jīng)過處理，轉化為5－羥甲基脫氧胞嘧啶（5hmdC）。取5－羥甲基脫氧胞嘧啶DNA標準品，對其進行與提取DNA相同的酶解過程，用超純水定容并稀釋得到標準溶液，其質量濃度為0.004 5、0.022 4、0.044 8和0.224 0 ng／mL。

1.5 液相色譜－串聯(lián)質譜檢測

液相色譜條件：Kinetex C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，2.6μm，美國Phenomenex公司）；流速0.3 mL／min；柱溫40℃；進樣量5μL。流動相A：超純水；流動相B：甲醇。梯度洗脫程序：0～5 min，3%B；5～6 min，5%B升至100%B；6～7.5 min，維持100%B；7.5～7.51 min，100%B降至5%B；7.51～10 min，維持3%B。

串聯(lián)質譜條件：電噴霧離子源；正離子掃描；多反應監(jiān)測（MRM）模式；電噴霧電壓5 500 V；離子源溫度（TEM）550℃；碰撞氣（CAD，N2）Medium；氣簾氣（CUR，N2）30 L／min；霧化氣（GS1）55 L／h；輔助加熱氣（GS2）50 L／h；駐留時間20 ms；入口電壓（EP）10 V；監(jiān)測離子對、去簇電壓（DP）和碰撞能量（CE）詳見表1。

表1 質譜參數(shù)Table 1 Operating parameters of mass spectrometry

圖1 （a）脫氧甲基胞嘧啶核苷、（b）脫氧羥甲基胞嘧啶核苷和（c）脫氧鳥嘌呤核苷的標準品典型色譜圖、（d）大鼠小腦組織樣品的色譜圖和（e）大鼠肝臟樣品的色譜圖Fig.1 Typical chromatograms of（a）deoxy－5－methylcytidine（5 mdC），（b）deoxy－5－h(huán)ydroxymethylcytidine（5hmdC），（c）deoxyguanosine（dG）standard samples，（d）DNA sample of rat cerebellum，（e）DNA sample of rat liver

1.6 統(tǒng)計分析

采用SPSS18.0軟件進行統(tǒng)計學分析。大鼠對照組和暴露組中組織樣品的DNA甲基化水平和羥甲基化水平采用Wilcoxon符號秩檢驗進行比較。

2 結果與討論

2.1 液相色譜－串聯(lián)質譜條件的優(yōu)化

本研究比較了乙腈和甲醇作為流動相的分離能力。dG、5mdC和5hmdC均屬于強極性化合物，在C18柱上保留較弱。由于乙腈的洗脫能力強于甲醇，即使在低濃度下也無法對這些化合物進行基線分離。我們還考察了甲酸、乙酸銨等添加劑對分離和檢測的影響，結果發(fā)現(xiàn)這些添加劑并沒有顯著的改善分離和檢測靈敏度。因此，選擇甲醇作為流動相。通過進一步優(yōu)化梯度洗脫條件，dG、5mdC和5hmdC可在4 min內實現(xiàn)基線分離，如圖1a～c所示。我們分別對3種核苷的標準溶液進行母離子全掃描，確定其分子離子，并優(yōu)化各分子離子的去簇電壓。然后分別以上述離子為母離子，對其子離子進行全掃描，選擇豐度較高、干擾較小的兩對子離子為定性離子，豐度最高的作為定量離子，然后優(yōu)化其碰撞能量，使得分子離子與特征碎片離子產(chǎn)生的離子對強度達到最大時為最佳。

2.2 計算方法的優(yōu)化

生物DNA樣品中胞嘧啶（5mC、5hmC和G）的水平與脫氧胞嘧啶（5mdC、5hmdC和dG）相等，因此，我們通過測定3種脫氧胞嘧啶從而確定胞嘧啶的水平。按實驗方法制備標準溶液，按外標法計算樣品中5mdC、5hmdC和dG的濃度，并根據(jù)下式計算全基因組的DNA甲基化率（MR）和羥甲基化率（HMR）：

報道的全基因組DNA甲基化率的計算公式為：MR＝100%×（5mdC／（5mdC＋dC））［14－16］。但是胞嘧啶存在多種修飾形式，甲基修飾只是其中一種［5］，因此此計算公式存在一定的誤差。鳥嘌呤與不同形式的胞嘧啶進行配對，而且其結構較為穩(wěn)定，因此本研究中對計算公式進行了修正。，5－羥甲基脫氧胞嘧啶核苷的LOD和LOQ分別為0.001和0.003 ng／mL，脫氧鳥嘌呤核苷的LOD和LOQ分別為0.2和0.6 ng／mL。

2.3 檢出限與定量限

逐步稀釋標準溶液進行測試，以信噪比為3和10的要求確定5－甲基脫氧胞嘧啶核苷的檢出限（LOD）和定量限（LOQ）分別為 0.015 和 0.045 ng／mL，5－羥甲基脫氧胞嘧啶核苷的LOD和LOQ分別為0.001和0.003 ng／mL，脫氧鳥嘌呤核苷的LOD和LOQ分別為0.2和0.6 ng／mL。

2.4 定量標準曲線與回收率

配制0.1、0.8和2.5 ng／mL的5－甲基脫氧胞嘧啶核苷溶液，0.5、2.5、10 ng／mL脫氧鳥嘌呤核苷溶液，0.01、0.05和0.2 ng／mL的5－羥甲基脫氧胞嘧啶核苷溶液。每個濃度均配制5份，依照實驗方法進行測定。定量標準曲線和回收率測定結果見表2。

2.5 方法應用

大量流行病學、動物暴露和細胞暴露研究表明砷暴露會顯著影響生物體的全基因組DNA甲基化修飾。流行病學研究發(fā)現(xiàn)砷暴露濃度與全基因組DNA甲基化水平變化在大部分研究中都不是呈單調的線性關系，動物暴露實驗的研究對象主要集中于肝臟，而且在不同物種和不同的暴露濃度得到的全基因組DNA甲基化水平的變化趨勢存在差異，不同的細胞暴露實驗中也得到不同結論［17，18］。精確的檢測方法是進一步研究砷對DNA甲基化水平的影響的基礎。在本研究中對大鼠砷暴露濃度為2 mg／L，暴露9周，取其肝臟和小腦按照上述實驗方法測定5mdC、5hmdC和dG，并計算全基因組DNA甲基化和羥甲基化水平。典型色譜圖見圖1d～e，動物組織樣品檢測結果如圖2和圖3所示。結果表明砷暴露導致小腦和肝臟中全基因組DNA甲基化率顯著升高，而全基因組DNA羥甲基化率未發(fā)生顯著變化。小腦和肝臟的全基因組DNA甲基化率水平接近，維持在4%～6%之間；而全基因組DNA羥甲基化率在兩個組織中差異較大，小腦中的水平超過了肝臟的3倍以上。

表2 脫氧甲基胞嘧啶核苷、脫氧羥甲基胞嘧啶核苷和脫氧鳥嘌呤核苷的定量標準曲線、相關系數(shù)及回收率Table 2 Linear equations，correlation coefficients（R2）and recoveries of deoxy－5－methylcytidine，deoxy－5－h(huán)ydroxymethylcytidine and deoxyguanosine

圖2 砷暴露大鼠肝臟和小腦全基因組DNA甲基化率的變化Fig.2 Changes of global DNA methylation ratio of liver and cerebellum in rat after arsenic exposure

圖3 砷暴露大鼠肝臟和小腦全基因組DNA羥甲基化率的變化Fig.3 Changes of global DNA hydroxymethylation ratio of liver and cerebellum in rat after arsenic exposure

3 結論

本研究基于液相色譜－電噴霧串聯(lián)質譜，建立了同時檢測生物樣品中全基因組DNA甲基化和羥甲基化水平的分析方法。5mdC和5hmdC的檢出限和定量限明顯優(yōu)于之前的研究報道［14，16］。通過分析大鼠肝臟和小腦中全基因組DNA甲基化率和羥甲基化率表明該方法具有良好的重現(xiàn)性、靈敏度和穩(wěn)定性。這也為今后同時研究DNA甲基化和羥甲基化提供了有力的支持。

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