正交法優(yōu)選紅花抗肝纖維化的水溶性成分提取工藝*

李文靜，蔡德富，于慶蓮，牛英才，郭麗娜，洪博

(齊齊哈爾醫(yī)學院藥學院，齊齊哈爾 161006)

紅花系菊科植物紅花(Carthamus tinctoriusL.)的干燥管狀花，主產(chǎn)于我國新疆、甘肅、河南等地。作為活血化瘀的傳統(tǒng)中藥，具有活血通經(jīng)、祛瘀止痛之功效［1］。學者們對紅花化學成分和藥理作用研究較多［2-7］，其中紅花黃色素是紅花活血化瘀功效的有效成分。紅花常被中醫(yī)用于慢性肝病尤其是肝硬化的治療，并有研究報道，紅花水提物對實驗性肝纖維化、肝硬化具有抑制作用［8-10］。目 前，已 經(jīng) 明 確 羥 基 紅 花 黃 色 素 A(hydroxysafflor yellow A，HYSA)是紅花黃色素中含量最高的成分［11］，而且是紅花的有效水溶性部位，為了更好地發(fā)揮其藥用功效，需制定合理的提取工藝。本實驗以HYSA含量、浸膏得率和抗肝纖維化藥理作用為指標，采用正交實驗對紅花的抗肝纖維水溶性成分的提取工藝進行了優(yōu)選，以期為確定紅花抗肝纖維化的水溶性成分的提取和生產(chǎn)工藝提供更全面的科學依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Waters 2695高效液相色譜儀(UV2489檢測器，四元高壓梯度泵，柱溫箱;美國Waters公司);LAC214型電子分析天平(常熟市百靈天平儀器廠);HHS型電熱恒溫水浴鍋(上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠)。

1.2 試藥 紅花(來源于新疆維吾爾自治區(qū)吉木薩爾縣，經(jīng)齊齊哈爾醫(yī)學院中藥教研室郭麗娜教授鑒定為菊科植物紅花Carthamus tinctoriusL.的干燥管狀花);HYSA對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號:111647-200801，規(guī)格:20 mg);色譜純甲醇(北京北醫(yī)大醫(yī)療科技有限責任公司，批號:27771);磷酸、無水乙醇為分析純(天津市凱通化學試劑有限公司，批號分別為20120322，20101125);水為純凈水;四氯化碳(CCl4，天津市博迪化工有限公司，批號:20110506);丙氨酸氨基轉移酶(alanine aminotransferase，ALT，批號:201111)、谷氨酸氨基轉移酶(glutamate pyruvic aminotransferase，AST，批號:201121)試劑盒均購于南京建成生物工程研究所。

1.3 實驗動物 選用清潔級SD雄性大鼠50只，體質量(200±10)g，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供，動物使用許可證編號:SCXK(京)2007-0001。

2 方法與結果

2.1 HPLC測定HYSA的含量

2.1.1 色譜柱 Agilent C18柱(4.6mm ×250mm，5 μm);流動相:乙腈-0.2% 磷酸水溶液(30∶70);分析時間為15min;流速:1.0mL·min－1;進樣量:5 μL;柱溫:30℃;HYSA含量測定檢測波長為400 nm。

2.1.2 待測溶液的制備 ① 對照品溶液的制備:取HYSA對照品1.0 mg精密稱定，置10mL量瓶中，加甲醇溶解，定容至刻度，得質量濃度為0.1 mg·mL－1的對照品母液;② 供試品溶液的制備:精密量取正交實驗樣品提取液1～9號藥液，用孔徑0.22 μm微孔濾膜過濾，備用。

2.1.3 專屬性考察 空白實驗:吸取溶劑色譜純甲醇，按色譜條件進行測定，結果見圖1A;對照實驗:吸取對照品溶液進樣分析，結果見圖1B;樣品實驗:吸取2號供試品溶液，進樣分析，結果見圖1C?？瞻讓嶒灪蛯φ諏嶒灡砻?，空白無干擾，樣品溶液和對照品溶液在相同保留時間有相應色譜峰，其他組分無影響，可以對HYSA進行定量分析。

1.羥基紅花黃色素A圖1 空白甲醇(A)、對照品(B)與供試品(C)的HPLC色譜圖1.hydroxysafflor yellow AFig.1 HPLC chromatograms of methanol(A)，reference substance(B)and sample(C)

2.1.4 方法學考察 ① HYSA線性關系考察:取0.1 mg·mL－1HYSA對照品溶液稀釋為系列濃度(50，25，12.5，6.25，3.12，1.56，0.78 μg·mL－1)的對照品溶液，依次進樣5 μL。以峰面積為縱坐標，樣品濃度為橫坐標進行線性回歸，回歸方程Y=8 479X－3 607.7，r=0.999 8。表 明 HYSA 在 0.78 ～100.00 μg·mL－1范圍內與峰面積線性關系良好;②儀器精密度實驗:取3.12 μg·mL－1HYSA 對照品溶液，連續(xù)進樣6次，測定峰面積，計算得RSD為1.5%，表明儀器精密度良好;③方法精密度實驗:取同一批紅花藥材各約0.5 g，精密稱定，按表2中序號1的操作方法制備供試品溶液，平行操作6份，測定含量，計算得RSD值1.4%;④ 穩(wěn)定性實驗:取同一份供試品溶液，分別于 0，2，5，10，12，15 h 各進樣 5 μL，測定峰面積。結果HYSA峰面積RSD為1.1%，表明供試品溶液在15 h內穩(wěn)定;⑤加樣回收率實驗:取已知含量的同一批紅花藥材各約0.5 g，精密稱定，共9份，按樣品處理方法制備低、中、高濃度樣品溶液，計算得每個濃度的平均加樣回收率分別為93.08%，96.91%，99.28%，RSD 分別為 1.2%，0.9%，1.7%。

2.1.5 樣品的制備 取紅花藥材約0.5 g，精密稱定，按表2中方法制備樣品，所得提取液配制成250mL，過濾后采用高效液相色譜分析，并做肝纖維化實驗分析。

2.2 肝功能指標ALT、AST的測定

2.2.1 大鼠分組及模型制備 雄性SD大鼠適應性飼養(yǎng)1周，飲食、飲水、活動正常者納入實驗。將50只大鼠編號半隨機分為10組:第1組(正常對照組)、第2～10組(按照正交表的9個實驗排序)，每組5只。第1組為正常雄性SD大鼠，第2～10組用CCl4復合制作肝纖維化(hepatic fibrosis，HF)模型［12］。

2.2.2 給藥處理 造模后第3周起，腹腔注射給予藥物處理，每周5次，第1組腹腔注射0.9%氯化鈉溶液，第2～10組給予不同方法處理的多種紅花水溶液樣品，劑量為 1mL·kg－1(0.5 g·mL－1)。連續(xù)注射8周，于第10周末處死全部大鼠，取材。

2.2.3 ALT、AST測定 第10周末各組大鼠末次給藥后，禁食12 h，3.5%水合氯醛麻醉，摘除眼球取血后處死大鼠。將血液室溫靜置1 h后，4℃離心15min(3 500 r·min－1)，取上清液，嚴格按照試劑盒操作檢測ALT、AST含量。

2.3 提取工藝的正交實驗

2.3.1 正交表設計 對影響提取工藝的主要因素溶劑用量(因素A)、提取時間(因素B)，提取次數(shù)(因素C)，提取溶劑(因素D)進行L9(34)實驗，因素水平見表1，正交實驗結果見表2。

2.3.2 綜合評分方法 采用排隊評分法［13］(將全部實驗結果按照指標從優(yōu)到劣進行排隊)對正交實驗數(shù)據(jù)進行綜合分析，對于每個指標找到最好的結果，排在第一名，給10分，最后一名，給1分，其他號實驗結果視其與該指標最好的結果的差異按比例打分，然后對每號實驗的所有分數(shù)相加即得綜合評分，綜合評分結果見表2。

表1 紅花水溶性成分提取工藝因素水平表Tab.1 Factors and levels of extraction process of water solubility component from Carthamus tinctorius L.

2.4 測定結果分析 綜合評分方差分析結果見表3。

2.4.1 水平優(yōu)劣分析 表2的A列K值，A1＞A2＞A3，說明A1比A2和 A3好;B 列K值，B1＞B3＞B2，說明 B1比B2和B3好;C 列K值，C2＞C3＞C1，說明 C1比 C2和 C3好，D 列K值，D2＞D1＞D3，說明D2比 D1和D3好。

2.4.2 因素主次分析 由直觀分析表明，因素D的極差R最大，因此是主要影響因素。其次是因素A和C，最后是因素B。

2.4.3 最佳工藝條件分析 由方差分析結果可得出，因素A和D對實驗結果有顯著影響，從具有抗肝纖維化作用和工業(yè)生產(chǎn)提高生產(chǎn)效率的角度出發(fā)，優(yōu)選出的最佳提取工藝條件為A1B1C2D2，即用10倍量10%乙醇，提取2次，每次0.5 h。

2.5 提取工藝驗證 為驗證該工藝的穩(wěn)定性，按優(yōu)選出的最佳工藝進行3批驗證性實驗。分別取同一批紅花藥材0.5 g，平行3份進行提取，得到的HYSA的含量分別為 16.1，15.9，16.4 mg·g－1，RSD 為 1.5%，說明優(yōu)選出的提取工藝合理可行。

3 討論

文獻報道，紅花的主要成分是紅花黃色素，紅花黃色素的主要成分為HYSA，是活血化瘀的主要成分。文獻［14］報道稱紅花與HYSA均具有明顯的降酶保肝作用，而且HYSA作用有優(yōu)于紅花的趨勢。ALT和AST是用于判斷肝纖維化和肝實質受損的主要酶類，所以本研究選擇以HYSA含量和血清中ALT、AST含量為考察指標，優(yōu)選紅花抗肝纖維化水溶性成分的最佳工藝，保證了工藝的有效性和科學性。

本實驗比較了提取時間對結果的影響，發(fā)現(xiàn)提取1.5 h有效成分含量不比1 h多，部分甚至更低，推測可能是加熱時間過長使有效成分降解所致。

排隊評分法綜合考慮各指標，排序給出評分值，并作為單指標分析數(shù)據(jù)，方法簡單，是處理多指標問題常用方法，本文綜合評分法結果與單因素直觀分析和方差分析相結合確定最佳提取工藝結果相一致。

表2 紅花水溶性成分提取工藝正交實驗結果Tab.2 Results of orthogonal experiment on extraction process of water solubility component from Carthamus tinctorius L.

表3 綜合評分方差分析Tab.3 Variance analysis on comprehensive score

中藥材藥效是多成分、多靶點整體作用的結果，中藥提取工藝優(yōu)選過程中，若采用某單體成分含量為優(yōu)化指標，不能反映全方的整體效應。筆者嘗試以藥理作用為考察指標與有效成分含量相結合的形式，進行多指標綜合評定優(yōu)化紅花水溶性抗肝纖維化成分的提取工藝，較以往可以更有針對性地得到有效成分。

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