嬰幼兒乳粉中泛酸測(cè)定的不確定度研究

（山東省產(chǎn)品質(zhì)量檢驗(yàn)研究院，山東濟(jì)南 250103）

測(cè)量不確定度是表征合理地賦予被測(cè)量值的分散性，與測(cè)量結(jié)果相聯(lián)系的參數(shù)[1]。它可以表征被測(cè)量值的合理范圍，并直接與檢驗(yàn)結(jié)果的合格判定相關(guān)。完整的測(cè)量結(jié)果表示應(yīng)該包括測(cè)量不確定度[2]。由于某些檢測(cè)方法的性質(zhì)，決定了無(wú)法從計(jì)量學(xué)和統(tǒng)計(jì)學(xué)角度對(duì)測(cè)量不確定度進(jìn)行有效而嚴(yán)格的評(píng)估，這時(shí)至少應(yīng)通過(guò)分析方法，列出各主要的不確定度分量，并做出合理的評(píng)估[3]。

泛酸是輔酶A（CoA）和?；d體蛋白（ACP）生物合成的重要前體物質(zhì)，參與人體中類(lèi)固醇、褪黑激素、抗體和亞鐵血紅素的合成[4]，是維持生命正常生理機(jī)能的必需小分子有機(jī)物，也是嬰幼兒乳粉中重要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。GB 10765-2010《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)嬰兒配方食品》和GB 10767-2010《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)較大嬰兒和幼兒配方食品》中規(guī)定泛酸在嬰幼兒乳粉中的限量分別為96μg/100kJ～478μg/100kJ和大于70μg/100 kJ，即 1 920 μg/100 g～9 560 μg/100 g 和大于 1 400 μg/100 g（以乳粉能量為2 000 kJ/100 g計(jì)）。

目前測(cè)定泛酸的方法有高效液相法、氣相色譜法和微生物法[5-7]。微生物法測(cè)定泛酸含量靈敏度高，是美國(guó)公職分析化學(xué)家協(xié)會(huì)AOAC要求的官方檢測(cè)方法，也是國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)方法的仲裁法。該方法操作繁雜，且因微生物生長(zhǎng)的不確定性強(qiáng)使得影響結(jié)果的因素很多，對(duì)檢驗(yàn)人員的操作和實(shí)驗(yàn)室設(shè)施要求較高。為了保證泛酸測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性，本實(shí)驗(yàn)依據(jù)JJF1059.1-2012和GB/Z 22553-2010對(duì)泛酸測(cè)定過(guò)程中影響檢驗(yàn)結(jié)果的各個(gè)分量進(jìn)行了評(píng)估，并給出擴(kuò)展不確定度，可據(jù)此提高微生物法測(cè)定嬰幼兒乳粉中泛酸的精密度和準(zhǔn)確度。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

試樣為在市場(chǎng)上隨機(jī)抽取的嬰幼兒乳粉。植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum，ATCC8014）；乳酸桿菌瓊脂培養(yǎng)基；乳酸桿菌肉湯培養(yǎng)基；泛酸測(cè)定用培養(yǎng)基（配制見(jiàn)附錄A[8]）；泛酸鈣標(biāo)準(zhǔn)品（＞98.8%），德國(guó)Dr.Ehrenstorfer公司；Tris緩沖液；去離子水；0.1 mol/L鹽酸溶液；定量濾紙。

1.2 儀器與設(shè)備

AL204型電子天平：瑞士梅特勒-托利多儀器公司（精度0.1mg）；PHS-3E型酸度計(jì)：上海雷磁公司（精度0.01）；SX-300型高壓蒸汽滅菌鍋：日本TOMY公司；315K型高速冷凍離心機(jī)：德國(guó)Sigma公司（最大轉(zhuǎn)速15 300 r/min）；SHP-250型生化培養(yǎng)箱：上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司（36℃±0.5℃）；Cary100型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)：美國(guó)瓦里安公司（精度0.000 1）。

1.3 樣品處理與試驗(yàn)方法

1.3.1 試樣處理與稀釋

稱(chēng)取2.00 g（精確至0.000 1 g）試樣于三角瓶中，加入10 mL Tris緩沖液和少量去離子水，121℃水解15 min后冷卻。用0.1 mol/L鹽酸溶液調(diào)節(jié)pH至4.5，轉(zhuǎn)入250 mL容量瓶中用去離子水定容。取少許稀釋樣液，定量濾紙過(guò)濾。取5 mL濾液，用去離子水稀釋至160 mL，即為試樣的測(cè)試液。

1.3.2 測(cè)定

按照GB5413.17-2010《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)嬰幼兒食品和乳品中泛酸的測(cè)定》6.3～6.8進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線制作、試樣管制作、滅菌、接種、培養(yǎng)、測(cè)定。

1.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制、結(jié)果計(jì)算與分析

以泛酸含量（ng）為橫坐標(biāo)，OD550nm為縱坐標(biāo)，使用專(zhuān)業(yè)繪圖軟件繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并利用軟件讀取測(cè)試液中的泛酸含量[9]。數(shù)值取舍方法按照GB5413.17-2010《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)嬰幼兒食品和乳品中泛酸的測(cè)定》6.10進(jìn)行。

1.5 計(jì)算公式

根據(jù)GB 5413.17-2010，測(cè)量結(jié)果計(jì)算公式為：

式中：X 為試樣中泛酸含量，（μg/100 g）；Cx為有效試樣管中每毫升測(cè)試液泛酸含量的總平均值，ng；m為試樣的質(zhì)量，g；f為稀釋倍數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不確定度來(lái)源分析

根據(jù)整個(gè)試驗(yàn)過(guò)程分析，微生物法進(jìn)行泛酸含量測(cè)定的不確定度主要來(lái)自以下方面：測(cè)量重復(fù)性、標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)稱(chēng)取及標(biāo)準(zhǔn)溶液配制、試樣稱(chēng)量、試樣前處理及稀釋、紫外分光光度計(jì)測(cè)量偏差[10-12]。

2.2 測(cè)量不確定度評(píng)定

2.2.1 測(cè)量重復(fù)性引入的不確定度

重復(fù)測(cè)定產(chǎn)生的不確定度屬于A類(lèi)不確定度[13]，它包含試樣稱(chēng)量、試樣前處理及稀釋操作、微生物生長(zhǎng)差異、使用器具和儀器引入的不確定度。按照GB 5413.17-2010的要求對(duì)同一試樣的泛酸進(jìn)行12次平行測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 乳粉重復(fù)測(cè)定的結(jié)果及回收率Table 1 Results and recoveries of the repeated measurements

所測(cè)結(jié)果X平均值的標(biāo)準(zhǔn)不確定度u（X）采用平均值的標(biāo)準(zhǔn)偏差s（）來(lái)表示，則重復(fù)測(cè)定引入的不確定度：

相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

2.2.2 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)及標(biāo)準(zhǔn)溶液配制引入的不確定度

2.2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)品引入的不確定度

根據(jù)泛酸鈣標(biāo)準(zhǔn)品說(shuō)明書(shū)所述，其純度p=（100±1.2）%，按B類(lèi)不確定度評(píng)定[13]，區(qū)間的半寬度為0.001 2，視為矩形分布，則標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

2.2.2.2 標(biāo)準(zhǔn)品稱(chēng)量引入的不確定度

用電子天平準(zhǔn)確稱(chēng)取44.00 mg泛酸鈣標(biāo)準(zhǔn)品，所用天平精度為0.1 mg。根據(jù)檢定證書(shū)，最大重復(fù)性誤差為0.2 mg，當(dāng)0≤m≤50 g時(shí)，示值誤差為0.5 mg。采用矩陣分布，包含因子為按B類(lèi)不確定度評(píng)定，標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

標(biāo)準(zhǔn)品稱(chēng)量引入相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

2.2.2.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制過(guò)程引入的不確定度

標(biāo)準(zhǔn)溶液配制過(guò)程使用了容量瓶、吸量管等玻璃器具，而這些玻璃器具的校準(zhǔn)和室溫對(duì)液體體積的影響可導(dǎo)致標(biāo)準(zhǔn)溶液配制的偏差[14-15]。

根據(jù)最大允許誤差[16]，按均勻分布處理?yè)?jù)此計(jì)算不確定度分量：

據(jù)此計(jì)算得出的相對(duì)不確定度數(shù)值見(jiàn)表2。

表2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制時(shí)玻璃量具校準(zhǔn)引入的不確定度Table 2 Uncertainties for measuring glasses’calibration in standard solution preparation

合成玻璃器具校準(zhǔn)引入的不確定度分量：

實(shí)驗(yàn)室溫度變化介于（20±5）℃之間，與玻璃器具20℃的校準(zhǔn)溫度不同。根據(jù)水的膨脹系數(shù)為2.1×10-4/℃，且遠(yuǎn)大于玻璃膨脹系數(shù)。假設(shè)溫度變化為矩形分布，其引入的不確定度分量為：

u（VT）=，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為，合成實(shí)驗(yàn)室溫度變化引入的玻璃器具相對(duì)不確定度分量：

由標(biāo)準(zhǔn)品及其稱(chēng)量、標(biāo)準(zhǔn)溶液配制引入的不確定度分量合成的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

2.2.3 試樣稱(chēng)量引入的不確定度

試樣稱(chēng)取質(zhì)量介于0～50 mg之間，稱(chēng)取2.013 2 g，即2 013.2 mg試樣引入的相對(duì)不確定度計(jì)算方法可參照本文2.2.2.2，應(yīng)為：

2.2.4 試樣前處理及稀釋引入的不確定度

2.2.4.1 試樣前處理引入的不確定度

樣品前處理過(guò)程中泛酸存在損失，通過(guò)試樣添加泛酸計(jì)算回收率，12次試樣添加回收率見(jiàn)表1，回收率范圍88.1%～112.4%，平均回收率為r=99.1%，標(biāo)準(zhǔn)偏差S（r）=0.091。標(biāo)準(zhǔn)不確定度采用平均值的標(biāo)準(zhǔn)偏差，標(biāo)準(zhǔn)不確定度為，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為因此，由試樣前處理過(guò)程產(chǎn)生的相對(duì)不確定度為2.64×10-2。

2.2.4.2 試樣稀釋過(guò)程引入的不確定度

試樣的前處理過(guò)程需要進(jìn)行稀釋操作，期間使用了容量瓶、吸量管、量筒等玻璃器具，而玻璃器具的校準(zhǔn)和室溫對(duì)液體體積的影響可導(dǎo)致試樣泛酸含量測(cè)定的偏差。根據(jù)2.2.2.3的公式可計(jì)算得出玻璃器具校準(zhǔn)引入的相對(duì)不確定度，具體數(shù)值見(jiàn)表3。合成試樣稀釋過(guò)程中玻璃量具引入的不確定度：

表3 試樣稀釋時(shí)玻璃量具校準(zhǔn)引入的不確定度Table 3 Uncertainties for measuring glasses’calibration in sample dilution

參照2.2.2.3的評(píng)估，合成實(shí)驗(yàn)室溫度變化造成的玻璃量具不確定度分量：

由試樣前處理及稀釋過(guò)程引入的的不確定度分量合成的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

2.2.5 紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)量偏差引入的不確定度

根據(jù)檢定證書(shū)，紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)的透射比示值誤差是0.4%，透射比重復(fù)性是0.0%，測(cè)定值一般為對(duì)稱(chēng)分布，則紫外分光光度計(jì)測(cè)量偏差引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

2.3 合成不確定度的計(jì)算

實(shí)驗(yàn)過(guò)程中影響檢驗(yàn)結(jié)果的各個(gè)因素引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度見(jiàn)表4。綜合各分量可得到合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度。則嬰幼兒食品和乳粉中泛酸含量測(cè)定的不確定度為：

表4 各影響因素分量引入的不確定度Table 4 Uncertainties of all affecting factors

2.4 擴(kuò)展不確定度評(píng)定

擴(kuò)展不確定度可由合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度乘以包含因子（k），在 95%置信水平下，k=2，因此，試樣中泛酸含量測(cè)定的相對(duì)擴(kuò)展不確定度為：

由計(jì)算得出的嬰幼兒乳粉中泛酸含量為（1 990.1±121.0）μg/100g。

3 結(jié)語(yǔ)

經(jīng)評(píng)估，微生物法測(cè)定嬰幼兒乳粉中泛酸含量的操作過(guò)程中，對(duì)檢驗(yàn)結(jié)果影響最大的是試樣前處理及稀釋?zhuān)浯问菢?biāo)準(zhǔn)溶液的配制和測(cè)量重復(fù)性。試樣的稱(chēng)量、紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)量偏差對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響較小。整個(gè)試驗(yàn)過(guò)程涉及較多玻璃器具的使用，應(yīng)嚴(yán)格移液操作，從而提高檢驗(yàn)的精密度和準(zhǔn)確度。

整個(gè)測(cè)定過(guò)程以植物乳桿菌作為媒介，每次測(cè)定時(shí)的細(xì)菌培養(yǎng)溫度、菌齡均有細(xì)微差異，這些不易估計(jì)的影響因素可粗略用基于試驗(yàn)及最終結(jié)果的重復(fù)性的標(biāo)準(zhǔn)偏差來(lái)表征[17-18]。在以微生物為媒介測(cè)定化學(xué)成分的方法中，每次測(cè)定時(shí)微生物生長(zhǎng)狀態(tài)的差異，是檢驗(yàn)人員操作和儀器測(cè)量偏差之外的主要誤差來(lái)源。

微生物法測(cè)定嬰幼兒乳粉中泛酸的結(jié)果為（1 990.1±121.0）μg/100 g，k=2，p=95%。

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