黃金茶中總黃酮超聲提取工藝

盛丹丹，李楠，葉振南，王文君

（江西農(nóng)業(yè)大學(xué)江西省天然產(chǎn)物與功能食品重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西南昌330045）

“黃金茶”是蠟梅科植物，學(xué)名為柳葉蠟梅，半常綠灌木，盛產(chǎn)于浙江西部的開(kāi)化，淳安及江西東北部的玉山等縣市，尤其是在三清山及其周邊一帶海拔三百到一千五百米的山麓分布最多。黃金茶是山茶，優(yōu)于苦丁茶，是純天然有機(jī)綠色保健飲品，該茶色澤翠綠，香氣高雅，一般生長(zhǎng)在陡峭的峭壁巖石上。經(jīng)國(guó)家有關(guān)科研單位測(cè)定，黃金茶中含揮發(fā)油、生物堿、黃酮類(lèi)等多種有效性成分。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究認(rèn)為：黃金茶有抗菌消炎，抗病毒作用，并有較好的降脂、健腦、減肥、醒酒之良效。常飲黃金茶，能調(diào)節(jié)人體機(jī)能，增強(qiáng)體質(zhì)，延緩衰老，提高抗病能力，這些可能與其含有的生物活性成分有關(guān)[1-4]。

黃酮類(lèi)化合物又稱(chēng)為黃酮體、黃堿素，是在植物界中廣泛分布的一類(lèi)成分[5]。黃酮類(lèi)化合物具有降血糖、降血脂等作用，同時(shí)它還是一種天然的抗氧化劑，具有清除人體中超氧離子自由基、抗衰老、增強(qiáng)機(jī)體免疫力的生理活性[6]。目前，有關(guān)黃金茶中黃酮類(lèi)化合物的研究尚鮮見(jiàn)報(bào)道，因此本試驗(yàn)對(duì)黃金茶中總黃酮的超聲提取工藝進(jìn)行了研究，以總黃酮的含量為指標(biāo)，采用分光光度法進(jìn)行測(cè)量，并運(yùn)用正交試驗(yàn)的方法對(duì)相關(guān)工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，確定最佳的提取條件，以期為黃金茶中黃酮類(lèi)化合物的開(kāi)發(fā)利用提供理論依據(jù)。黃酮類(lèi)化合物易溶于甲醇、乙醇、氯仿等極性溶劑，在510 nm處可見(jiàn)光譜帶吸收較強(qiáng)。但由于甲醇毒性大、易揮發(fā)；氯仿有劇毒，且使用沒(méi)有乙醇方便、安全，因此本試驗(yàn)選用乙醇作為提取溶劑。

1 材料與方法

1.1 材料及主要儀器

1.1.1 試驗(yàn)原料

黃金茶：購(gòu)自江西省玉山縣黃金茶廠(chǎng)。

1.1.2 主要試劑

無(wú)水乙醇（分析純）；蘆丁（≥95.0%）：上海潤(rùn)捷化學(xué)試劑有限公司；亞硝酸鈉，硝酸鋁，氫氧化鈉均為分析純。

1.1.3 主要儀器

104-4-BS型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠(chǎng)；FLB-100型萬(wàn)能高速粉碎機(jī)：上海菲力博食品機(jī)械有限公司；YP600型電子天平：上海精科天平有限公司；KQ3200DB型數(shù)控超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；WFJ2100型可見(jiàn)分光光度計(jì)：尤尼柯上海儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 原料預(yù)處理

將黃金茶用粉碎機(jī)粉碎，過(guò)70目篩，在電熱恒溫干燥箱中60℃下干燥15 h后放于干燥器中備用。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的制作

根據(jù)參考文獻(xiàn)[7-9]，精確稱(chēng)取60℃下烘干至恒重的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品10 mg于小燒杯中，加適量70%的乙醇溶解并定容至25 mL容量瓶中，搖勻，即為0.4 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液。精確吸取 0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL 的標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別置于6個(gè)25 mL容量瓶中，加5%的亞硝酸鈉0.3 mL，放置6 min，再加10%的硝酸鋁0.3 mL，放置6 min，最后加4%的氫氧化鈉4 mL，用70%的乙醇定容至刻度，搖勻，放置15 min后用可見(jiàn)分光光度計(jì)在510 nm處測(cè)定吸光度。根據(jù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，可得回歸方程：A=6.832 1c-0.018 5，R2=0.998 6，標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的線(xiàn)性范圍為0.008 mg/mL～0.048 mg/mL。以各標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度為橫坐標(biāo)，以測(cè)得的相應(yīng)的吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)見(jiàn)圖1。

圖1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)Fig.1 The standard curve of rutin

1.2.3 黃金茶中總黃酮得率的測(cè)定

準(zhǔn)確稱(chēng)取黃金茶粉末0.5 g于50 mL三角瓶中，加入定量一定濃度的乙醇溶液，在一定超聲功率下，超聲一定時(shí)間，將提取液轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶中，用相應(yīng)濃的乙醇定容至刻度，搖勻，過(guò)濾。準(zhǔn)確吸取1 mL濾液于25 mL容量瓶中，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)中的顯色方法顯色，測(cè)定吸光度，根據(jù)回歸方程，計(jì)算總黃酮的含量，得出得率：

總黃酮得率（%）=（c×25×50×100%）/（m×1 000）

式中：c為0.5 g黃金茶粉末經(jīng)乙醇提取后所得黃酮的濃度；m為黃金茶粉末的質(zhì)量。

1.2.4 單因素及正交試驗(yàn)

本試驗(yàn)通過(guò)對(duì)提取工藝中超聲時(shí)間（A）、超聲功率（B）、乙醇濃度（C）、料液比（D）4個(gè)影響黃金茶中總黃酮得率的主要因素進(jìn)行單因素試驗(yàn)及正交試驗(yàn)，確定最佳的工藝參數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果及分析

2.1.1 不同超聲時(shí)間對(duì)黃金茶總黃酮得率的影響

準(zhǔn)確稱(chēng)取0.5 g黃金茶粉末于50 mL三角瓶中，加入70%的乙醇10 mL（即料液比1∶20），超聲功率為120 W 的條件下，分別作用 10、15、20、25、30 min，然后轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶中，用70%乙醇定容至刻度，搖勻后過(guò)濾。分別取濾液1 mL于25 mL容量瓶中，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)中的顯色方法顯色，測(cè)定吸光度，計(jì)算總黃酮得率見(jiàn)圖2。

圖2 超聲時(shí)間對(duì)黃金茶中總黃酮得率的影響Fig.2 Effect of ultrasonic time on extraction ratio of flavonoids compounds

如圖2所示，總黃酮的得率隨超聲時(shí)間的延長(zhǎng)先增大后減小，原因是時(shí)間過(guò)短，黃酮物質(zhì)還未充分溶出，20 min時(shí)黃酮物質(zhì)充分溶出以達(dá)到平衡，再延長(zhǎng)時(shí)間，黃金茶中其他雜質(zhì)也溶出到提取液中，可能對(duì)黃酮的檢測(cè)有一定影響，而且黃酮易于氧化，有效成分可能隨時(shí)間延長(zhǎng)而減少[10-11]，所以應(yīng)該選擇提取時(shí)間20 min左右。

2.1.2 不同超聲功率對(duì)黃金茶總黃酮得率的影響

準(zhǔn)確稱(chēng)取0.5 g黃金茶粉末于50 mL三角瓶中，加入70%的乙醇10 mL（即料液比1∶20），分別在功率60、75、90、105、120、135 W 條件下，作用 20 min，然后轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶中，用70%乙醇定容至刻度，搖勻后過(guò)濾。分別取濾液1 mL于25 mL容量瓶中，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)中的顯色方法顯色，測(cè)定吸光度，計(jì)算總黃酮得率見(jiàn)圖3。

圖3 超聲功率對(duì)黃金茶中總黃酮得率的影響Fig.3 Effect of ultrasonic power on extraction ratio of flavonoids compounds

如圖3所示，隨超聲功率的增大，黃酮得率先增大后減小又增大，功率在75 W時(shí)得率最大，黃酮得率變化趨勢(shì)的原因還有待進(jìn)一步的研究?？紤]到節(jié)約能源，選擇超聲功率在75 W左右。

2.1.3 不同乙醇濃度對(duì)黃金茶總黃酮得率的影響

準(zhǔn)確稱(chēng)取0.5 g黃金茶粉末于50 mL三角瓶中，分別加入50%、60%、70%、80%、90%的乙醇 10 mL（即料液比1∶20 g/mL），在功率75 W條件下，作用20 min，然后轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶中，用相應(yīng)濃度的乙醇定容至刻度，搖勻后過(guò)濾。分別取濾液1 mL于25 mL容量瓶中，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)中的顯色方法顯色，測(cè)定吸光度，計(jì)算總黃酮得率見(jiàn)圖4。

圖4 乙醇濃度對(duì)黃金茶中黃酮得率的影響Fig.4 Effect of ethanol concentration on extraction ratio of flavonoids compounds

如圖4所示，乙醇濃度小于70%時(shí)，黃酮得率逐漸增大，達(dá)到70%之后得率開(kāi)始下降，而且在乙醇濃度達(dá)到90%時(shí)，黃酮得率明顯下降。原因可能是不同濃度的乙醇其極性不同，溶解的物質(zhì)性質(zhì)不同。隨乙醇濃度的的增大，一些醇溶性雜質(zhì)、色素、親脂性強(qiáng)的成分溶出量增加，這些成分與黃酮類(lèi)物質(zhì)競(jìng)爭(zhēng)同乙醇—水分子結(jié)合，從而導(dǎo)致黃酮得率下降[12]。選擇乙醇濃度70%左右為宜。

2.1.4 不同料液比對(duì)黃金茶總黃酮得率的影響

準(zhǔn)確稱(chēng)取0.5 g黃金茶粉末于50 mL三角瓶中，分別加入 70%的乙醇 5、7.5、10、12.5、15 mL（即料液比1 ∶10、1 ∶15、1 ∶20、1 ∶25、1 ∶30），在功率 75 W 條件下，作用20 min，然后轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶中，用70%的乙醇定容至刻度，搖勻后過(guò)濾。分別取濾液1 mL于25 mL容量瓶中，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)中的顯色方法顯色，測(cè)定吸光度，計(jì)算總黃酮得率（圖5）。

圖5 料液比對(duì)黃金茶中黃酮得率的影響Fig.5 Effect of material to liquid ratio on extraction ratio of flavonoids compounds

料液比即是溶劑的用量，如圖5所示，隨著料液比的增大，黃酮得率先增大后減小，原因是料液比較小時(shí)，黃酮的有效成分不能充分溶出，隨著料液比的增大，黃酮的有效成分基本溶出，再增大料液比，會(huì)造成溶劑和能源的浪費(fèi)，綜合考慮得率、溶劑用量和能源損耗等因素，選擇料液比 1∶20（g/mL）左右為宜[13]。

2.2 正交試驗(yàn)

2.2.1 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

為了綜合考慮多因素相互作用對(duì)黃金茶中黃酮得率的影響，在以上但因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，對(duì)影響黃酮得率的主要因素：超聲時(shí)間、超聲功率、乙醇濃度、料液比進(jìn)行L9（34）正交試驗(yàn)，同時(shí)對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析。對(duì)上述4個(gè)因素各取3個(gè)優(yōu)化水平，因素水平設(shè)計(jì)表和正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)表見(jiàn)表1、表2。

表1 正交試驗(yàn)因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments

2.2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果分析

按上述正交設(shè)計(jì)表進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果及分析見(jiàn)表3。

由表3正交試驗(yàn)結(jié)果及極差分析正交試驗(yàn)結(jié)果可知，各因素對(duì)超聲輔助提取黃金茶中黃酮得率影響的程度依次為乙醇濃度＞超聲時(shí)間＞超聲功率＞料液比（C＞A＞B＞D）。由表3方差分析表及表4 Duncan新復(fù)極差法多重比較分析可知，乙醇濃度，超聲時(shí)間，均為差異極顯著的因素（P＜0.01），超聲功率和料液比是差異不顯著因素。超聲輔助提取黃金茶中黃酮的最佳提取工藝條件為A3B2C1D3，超聲時(shí)間20min，超聲功率75W，乙醇濃度70%，料液比1∶20（g/mL）。為了驗(yàn)證最佳的提取工藝，利用上述條件做了驗(yàn)證試驗(yàn)，經(jīng)過(guò)3次試驗(yàn)取平均值得到此條件下的得率為5.350 4%，這與理論預(yù)測(cè)值相差不大。因此，利用正交試驗(yàn)優(yōu)化得到的最佳提取工藝可靠，具有實(shí)用價(jià)值。

表2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)表L9（34）Table 2 The design table of orthogonal experiments

表3 正交試驗(yàn)方案及結(jié)果分析表Table 3 The design and results of orthogonal experiments

表4 黃酮類(lèi)化合物得率的方差分析Table 4 Analysis of variance of extraction ratio of flavonoids compounds

3 結(jié)論

采用單因素試驗(yàn)考察了4個(gè)因素（超聲時(shí)間、超聲功率、乙醇濃度和料液比）對(duì)黃金茶中黃酮提取得率的影響，然后對(duì)超聲時(shí)間、超聲功率、乙醇濃度和料液比采用L9（34）正交試驗(yàn)進(jìn)行優(yōu)化。利用DPS軟件得出數(shù)據(jù)，通過(guò)極差分析和方差分析得出的合理工藝參數(shù)。從極差R值和方差分析來(lái)看，黃金茶中黃酮提取含量的影響因素主次順序?yàn)橐掖紳舛龋境晻r(shí)間＞超聲功率＞料液比（C＞A＞B＞D）。超聲輔助提取黃金茶中黃酮的最佳提取工藝條件為A3B2C1D3，超聲時(shí)間20 min，超聲功率 75 W，乙醇濃度 70%，料液比 1∶20（g/mL）。

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