蒜頭果蛋白對人白血病K562細(xì)胞體外生長的抑制作用

袁 燕，張 薇，李 彬，王紅斌，Colin J.Barrow，楊文榮

（1.云南民族大學(xué)民族藥資源化學(xué)國家民委-教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南昆明 650500；2.澳大利亞迪肯大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院化學(xué)與生物技術(shù)中心，吉朗3216，澳大利亞）

蒜頭果（Malania oleiferaChun et S.Lee），常綠喬木，屬于鐵青樹科（Olacaceae）蒜頭果屬[1]，是中國云南、廣西稀有瀕危植物[2]，廣西重點(diǎn)保護(hù)野生植物[3]，國家二級保護(hù)樹種[4]。蒜頭果種仁富含油脂，含油率高達(dá)51.85%～67.0%，成分為油酸、棕櫚酸和硬脂酸等，為良好的木本油料植物[5]。蒜頭果油可以食用，也可作為潤滑油和制皂的原料，油餅還可以作飼料。其油脂中還富含二十四碳-15-烯酸，是一種長鏈單不飽和脂肪酸，具有活躍腦細(xì)胞、治療身體免疫缺乏性疾病、心血管疾病等功用，且還是合成高價(jià)值的麝香酮所需的廉價(jià)理想原料[6-7]，具有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值[8]。

蒜頭果蛋白（malanin）是通過粉碎、抽提、硫酸銨沉淀、疏水色譜層析等分離手段從蒜頭果中分離純化出一種新的植物蛋白質(zhì)[9]，屬于原創(chuàng)研究。本文從蒜頭果種仁中提取蒜頭果蛋白并測定其對人白血病K562體外生長的抑制作用，為該蛋白作為新藥的開發(fā)利用提供理論依據(jù)與實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

蒜頭果種子 購自云南文山；HiprepTMphenyl FF（High sub，20ml）預(yù)裝柱 Amersham公司；人白血病K562細(xì)胞 昆明醫(yī)學(xué)院；注射用順鉑 齊魯制藥有限公司；四甲基偶氮唑鹽 Sigma公司；DMEM培養(yǎng)基 Gibco公司。

蛋白純化系統(tǒng) Amersham公司；酶標(biāo)儀Spectra Max 190 Molecular Devices Corporation；二氧化碳培養(yǎng)箱 日本SANYO公司；倒置相差顯微鏡 美國OLYMPUS公司；超凈工作臺 蘇凈集團(tuán)安泰公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 malanin的分離提取 將蒜頭果種仁搗碎，4℃抽提過夜，紗布過濾，30%～80%（NH4）2SO4沉淀，離心，沉淀用20mmol/L pH7.2的磷酸鹽緩沖液溶解，在蛋白質(zhì)純化系統(tǒng)上疏水預(yù)裝柱，用去離子水按0%100%線性梯度洗脫，4mL/min，280nm紫外檢測，按峰高收集。12%SDS-PAGE電泳檢測后收集樣品峰，冷凍干燥后備用[9]。

1.2.2 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察 將人白血病細(xì)胞K562細(xì)胞株在含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中，37℃、飽和濕度、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，取指數(shù)生長期的細(xì)胞接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)24h后，加入已過濾滅菌的malanin溶液（50μL/孔），繼續(xù)培養(yǎng)72h后于倒置顯微鏡觀察結(jié)果。

1.2.3 體外抑制腫瘤細(xì)胞活性測定 采用MTT比色法測定[10-11]。取對數(shù)生長期的K562細(xì)胞，充分吹打混勻成單細(xì)胞懸液，以5×104個(gè)細(xì)胞/mL濃度接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，100μL/孔。在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后，更換培養(yǎng)基（100μL/孔），每孔再加入20μL不同濃度的malanin樣品，用培養(yǎng)液作為陰性對照組，廣譜抗癌藥物順鉑（DDP）作為陽性對照組，均為6個(gè)平行復(fù)孔。繼續(xù)培養(yǎng)72h后，吸除上清液，每孔加入新配制的5g·L-1MTT溶液20μL，再培養(yǎng)4h，吸除上清，加入150μL/孔二甲基亞砜（DMSO），振蕩約30min，待紫色結(jié)晶完全溶解后，于酶標(biāo)儀在550nm波長下測定其吸光值（A），計(jì)算72h時(shí)malanin和DDP對K562細(xì)胞的抑制率。

抑制率（%）=[1-（A實(shí)驗(yàn)組/A對照組）]×100[12]

1.2.4 IC50值的測定 半數(shù)抑制濃度（IC50，Median Inhibitory Concentration）是指一種藥物能將某種酶的活性或腫瘤細(xì)胞生長或病毒復(fù)制抑制50%所需的濃度。以每個(gè)樣本實(shí)際濃度的負(fù)對數(shù)（-lgC）為橫坐標(biāo)，抑制率（%）為縱坐標(biāo)作線性回歸分析，計(jì)算以引起50%細(xì)胞抑制率濃度，即72h時(shí)malanin和DDP的IC50值[13]。

1.2.5 malanin與DDP聯(lián)合抑制效應(yīng) 為了比較malanin抗腫瘤活性的強(qiáng)弱，本實(shí)驗(yàn)采用廣譜抗癌藥物DDP作陽性對照，同時(shí)用malanin和DDP聯(lián)合應(yīng)用（malanin+DDP）對每種細(xì)胞的生長是否具有協(xié)同抑制作用。

將malanin、DDP和malanin+DDP在同一濃度下與K562細(xì)胞作用12、24、36、48和72h后，計(jì)算其對K562細(xì)胞的抑制率，判斷malanin和DDP聯(lián)合用藥是否對K562細(xì)胞具有協(xié)同作用。

1.2.6 malanin的穩(wěn)定性分析

1.2.6.1 malanin在不同保存方式下的穩(wěn)定性分析 為了解malanin以何種方式保存比較穩(wěn)定，本實(shí)驗(yàn)采用MTT比色法測定在不同保存方式下的malanin樣品對K562細(xì)胞的IC50值，分析其穩(wěn)定性。

1.2.6.2 Malanin熱穩(wěn)定性分析 將malanin溶液于50、60、70、80、90、100℃條件下在水浴鍋中熱處理2h，4℃則是樣品保存于4℃冰箱中，計(jì)算在不同溫度下處理的malanin與K562細(xì)胞作用24、48和72h的成活率：成活率（%）=（A實(shí)驗(yàn)組/A對照組）×100[14]。

2 結(jié)果與分析

2.1 malanin的分離提取

在蛋白純化系統(tǒng)上疏水色譜層析柱后，其結(jié)果如圖1所示，主要得到4個(gè)組份（I、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ），通過SDSPAGE電泳（如圖2第3孔所示）檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，組份Ⅳ即為malanin，其相對分子質(zhì)量約為60ku左右。收集組份Ⅳ真空冷凍成干粉，置于-20℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

圖1 malanin分離提取的疏水色譜層析圖Fig.1 Purification of malanin on HiprepTMphenyl FF（High sub）column

圖2 12%SDS-PAGE電泳圖Fig.2 12%SDS-PAGE of malanin

2.2 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察

malanin與 K562細(xì)胞作用72h后的細(xì)胞形態(tài)如圖3所示。可見，空白對照組（圖3（A））K562懸浮在培養(yǎng)基中，長勢良好，呈圓形，胞體飽滿，細(xì)胞密度大，大部分單個(gè)生長。隨著作用時(shí)間的延長，細(xì)胞外型逐漸皺縮，細(xì)胞的體積變小，繼而細(xì)胞發(fā)生崩解，破裂成碎片，散落在培養(yǎng)瓶底部（圖3（B）），說明malanin能較強(qiáng)地作用于腫瘤細(xì)胞并抑制其生長。

圖3 Malanin對K562細(xì)胞的抑制效果圖（20×）Fig.3 The inhibitory effect of malanin on K562 cells（20×）

2.3 IC50值的測定

體外抑制腫瘤細(xì)胞活性測定結(jié)果表明，malanin和DDP均具有抑制K562細(xì)胞體外增殖的作用，且隨著濃度的增大和作用時(shí)間的延長，malanin和DDP對K562細(xì)胞的生長抑制率均逐漸升高，呈一定的劑量和時(shí)效依賴性。

圖4 Malanin和DDP與K562細(xì)胞作用72h的抑制率Fig.4 The inhibition rate of malanin and cisplatin on K562 cells for 72h

以蛋白濃度的負(fù)對數(shù)為橫坐標(biāo)，細(xì)胞的抑制率為縱坐標(biāo)進(jìn)行直線作圖（如圖4所示），根據(jù)線性回歸方程計(jì)算malanin、DDP對K562細(xì)胞的IC50值分別為1.58×10-8、5.50×10-5mol·L-1?？梢姡琺alanin的IC50值明顯小于廣譜抗癌藥物DDP，說明malanin的抗腫瘤活性較強(qiáng)，具有用于免疫毒素治療癌癥的應(yīng)用前景。

2.4 malanin與DDP聯(lián)合抑制效應(yīng)

圖5 Malanin、DDP和malanin+DDP與K562細(xì)胞作用不同時(shí)間的抑制率Fig.5 The inhibition rate of malanin,cisplatin and malanin combined with cisplatin on K562 cells at different times

從圖5中可以看出，malanin、DDP和兩藥聯(lián)合（malanin+DDP）對K562細(xì)胞的生長抑制率曲線隨著時(shí)間的延長，抑制率逐漸升高，細(xì)胞的成活率逐漸降低，表現(xiàn)出明顯的生長抑制作用，說明malanin、DDP和malanin聯(lián)合DDP均具有抑制K562細(xì)胞體外生長的作用，且存在時(shí)間依賴性。此外，兩藥聯(lián)用對K562細(xì)胞的抑制率曲線是最高的，均高于malanin和DDP單獨(dú)與K562細(xì)胞作用的抑制率曲線，說明malanin和DDP聯(lián)用表現(xiàn)出了明顯的協(xié)同抑制效應(yīng)，兩藥聯(lián)合應(yīng)用效應(yīng)會增加。

2.5 malanin的穩(wěn)定性分析

表1 malanin在不同保存方式下對K562細(xì)胞活性的影響Table 1 The cytoactivity effect of malanin on K562 cells in different time of save

2.5.1 malanin在不同保存方式下的穩(wěn)定性分析 表1為malanin在不同保存方式下對K562細(xì)胞活性的影響?？梢?，malanin溶液直接從層析柱上分離純化后立即進(jìn)行K562細(xì)胞活性測定，其抗腫瘤活性最高；將此溶液于-20℃保存12個(gè)月后其活性下降了2.2倍，但反復(fù)凍、融3次后其活性明顯急劇下降。而將malanin干粉于-20℃保存6個(gè)月和12個(gè)月后，再測定其活性，發(fā)現(xiàn)其活性變化不大。此結(jié)果表明，malanin樣品最好的保存方式是將其冷凍成干粉并于-20℃保存，避免反復(fù)凍融。

圖6 不同溫度水浴處理的malanin與K562細(xì)胞作用24，48，72h的成活率Fig.6 The cell viability of malanin on K562 cells under different temperature for 24，48 and 72h

2.5.2 malanin熱穩(wěn)定性分析 在不同溫度下水浴處理的malanin溶液與K562細(xì)胞作用24、48、72h后，細(xì)胞的成活率如圖6所示。結(jié)果表明，malanin對K562細(xì)胞的熱穩(wěn)定性比較好，在4～70℃細(xì)胞活性差異不大，隨著溫度的升高，細(xì)胞的成活率逐漸升高，到80℃以上時(shí)，malanin變性就比較徹底，幾乎就沒有細(xì)胞活性了，且隨著malanin與細(xì)胞作用時(shí)間的延長，細(xì)胞成活率逐漸升高。

3 結(jié)論與討論

疏水色譜層析是基于溶質(zhì)極性流動(dòng)相和非極性固定相表面間的疏水效應(yīng)建立的一種色譜模式，其一個(gè)非常重要的特點(diǎn)就是配基具有很弱的疏水性，與蛋白質(zhì)作用很溫和，從而能很好地保留蛋白質(zhì)的天然構(gòu)象和生物活性。本研究將粗蛋白干粉上疏水色譜層析柱HiprepTMphenyl FF（high sub）后，結(jié)果出現(xiàn)了4個(gè)峰（如圖1所示）。前3個(gè)峰在280nm處的吸收值都比較低，第4個(gè)峰則遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他吸收峰，收集這4個(gè)峰經(jīng)SDS-PAGE電泳發(fā)現(xiàn)，前3個(gè)峰濃度低，且條帶比較多，但第4個(gè)峰濃度很高，且只出現(xiàn)一條比較明顯的60ku左右的條帶（如圖2所示），說明純度較高，得率為26%左右。

本研究以人白血病K562細(xì)胞為對象，測定蒜頭果蛋白體外抗腫瘤活性。結(jié)果表明，malanin具有明顯抑制K562細(xì)胞體外增殖的作用，其IC50值為1.58×10-8mol·L-1，比廣譜抗癌藥物DDP抗腫瘤活性都強(qiáng)，而且malanin和DDP聯(lián)用表現(xiàn)出了明顯的協(xié)同抑制效應(yīng)，兩藥聯(lián)合應(yīng)用效應(yīng)會增加。此外，malanin的熱穩(wěn)定性非常好，將其冷凍成干粉并于-20℃保存1年其活性仍變化不大，此結(jié)果為malanin在腫瘤治療方面的開發(fā)利用提供依據(jù)和思路，也為該蛋白作為新藥的研發(fā)打下基礎(chǔ)，同時(shí)也對云南植物資源的開發(fā)利用具有重要意義。

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