瓷熔附基底冠合金細(xì)胞毒性的實(shí)驗(yàn)研究

弓二海，劉 靜

（赤峰學(xué)院附屬醫(yī)院，內(nèi)蒙古 赤峰 024000）

瓷熔附基底冠合金細(xì)胞毒性的實(shí)驗(yàn)研究

弓二海，劉 靜

（赤峰學(xué)院附屬醫(yī)院，內(nèi)蒙古 赤峰 024000）

目的：通過測量五種常用瓷熔附基底冠合金浸提液對人牙齦成纖維細(xì)胞的細(xì)胞毒性，為瓷熔附基底冠合金的生產(chǎn)和臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù).方法：體外培養(yǎng)人牙齦成纖維細(xì)胞，利用五種常用瓷熔附基底冠合金浸提液對人牙齦成纖維細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，應(yīng)用MTT法測定各合金浸提液內(nèi)細(xì)胞的增值率.結(jié)果：鎳鉻合金、鈷鉻合金、低含金量金合金、含鈦鎳鉻合金組與對照組和純鈦組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p＜0.001)；鎳鉻合金和鈷鉻合金組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)；低含金量金合金和含鈦鎳鉻合金組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＞0.05)；鎳鉻合金和鈷鉻合金組與低含金量金合金和含鈦鎳鉻合金組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）.結(jié)論：鎳鉻合金、鈷鉻合金、含鈦鎳鉻合金、低含金量金合金抑制細(xì)胞增殖，含鈦鎳鉻合金、低含金量金合金的生物相容性優(yōu)于鎳鉻合金、鈷鉻合金，純鈦基本不影響細(xì)胞增殖.表明應(yīng)根據(jù)合金的細(xì)胞毒性來指導(dǎo)新型合金的研制和臨床應(yīng)用.

人牙齦成纖維細(xì)胞；細(xì)胞培養(yǎng)；瓷熔附基底冠合金；細(xì)胞毒性；MTT法

隨著瓷熔附基底冠（Porcelain-fused-to-metal crown）在臨床上的廣泛應(yīng)用及新型合金的研制和加速發(fā)展，合金的種類以及成分都發(fā)生了變化，合金對人體產(chǎn)生的生物學(xué)效應(yīng)也受到人們的關(guān)注.盡管國內(nèi)學(xué)者對牙科鑄造合金的生物相容性做了大量的研究，但由于測試方法本身的局限性和測試標(biāo)準(zhǔn)不統(tǒng)一，實(shí)驗(yàn)結(jié)果常常不一致，有時(shí)甚至得出相反的結(jié)論.目前牙科材料的細(xì)胞毒性研究常用L929鼠成纖維細(xì)胞.有研究[2]認(rèn)為由于細(xì)胞系是在高生長率的條件下培養(yǎng)的，所以人體正常細(xì)胞可能比細(xì)胞系更耐受牙科合金材料的毒性.因此，人牙齦成纖維細(xì)胞作為牙科合金細(xì)胞毒性研究模型比已有的來源于其他動(dòng)物細(xì)胞系敏感，本實(shí)驗(yàn)通過建立人牙齦成纖維細(xì)胞模型更能客觀反映牙科材料的細(xì)胞毒性，可以為進(jìn)一步認(rèn)識(shí)烤瓷合金對細(xì)胞增殖的影響及其實(shí)驗(yàn)研究提供依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鎳鉻合金(上海齒科材料廠，成分不詳)；含鈦鎳鉻合金（上海齒科材料廠Ti:4-6%）；純鈦（西北有色金屬研究院）；低含金量金合金(美國AURIUM公司含金75.6%)；鈷鉻合金（上海齒科材料廠Co: 33%;Cr：30%）.

DMEN培養(yǎng)液（Gibco公司）；國產(chǎn)胎牛血清（杭州四季青生物制品有限公司）；胰蛋白酶（Gibco公司產(chǎn)品）；MTT(德國Merck公司產(chǎn)品)；二甲基亞颯（美國Sigama公司）.

圖1 波形絲蛋白染色呈陽性×400

圖2 抗細(xì)胞角蛋白染色陰性×200

1.2 人牙齦成纖維細(xì)胞的體外培養(yǎng)及鑒定

經(jīng)患者同意，取臨床冠延長術(shù)切取的齦緣組織（患者年齡22歲），酶消組織塊法原代培養(yǎng)，原代培養(yǎng)細(xì)胞在7～10d左右開始生長融合成片,當(dāng)細(xì)胞匯合達(dá)75%左右時(shí),按1：2比例傳代培養(yǎng).取第二代細(xì)胞爬片倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)特征，用免疫組化ABC法進(jìn)行波形絲蛋白和細(xì)胞角蛋白染色，證明其為中胚層來源的成纖維細(xì)胞(圖1、2).

1.3 合金浸提液的制取

將合金制作為5.5mm×2.5mm的小圓柱，為更好地模擬臨床，，試樣處理與臨床相符，經(jīng)過高溫鑄造及烤瓷燒結(jié)程序.常規(guī)打磨、拋光、消毒.將金屬小圓柱浸入0.5ml含培養(yǎng)液的小牛血清中,在培養(yǎng)箱中 37℃、5%CO2、濕度95%下保存，72小時(shí)后收集合金析出液.

1.4 MTT檢測指標(biāo)

將細(xì)胞培養(yǎng)液配成單細(xì)胞懸液，接種到96孔板（孔體積200ul），每孔1.0×104個(gè)細(xì)胞，在37℃、5%CO2、濕度95%條件下培養(yǎng)48h.用等量合金浸漬液置換培養(yǎng)液，每孔加MTT溶液（5mg/ml）20ul.繼續(xù)孵育4小時(shí)，離心后再吸去孔內(nèi)培養(yǎng)上清液.每孔加150ulDMSO，振蕩10分鐘.結(jié)晶物充分溶解后，選擇490nm波長，在酶聯(lián)免疫監(jiān)測儀上測定各孔光吸收值，記錄結(jié)果，每種合金離子溶液重復(fù)10次試驗(yàn).

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

用spss17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對五組合金和對照組的吸光值進(jìn)行單因素方差分析.

2 結(jié)果

2.1 光鏡觀察

人牙齦成纖維細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果：貼壁生長的人牙齦成纖維細(xì)胞呈星形、棱形，細(xì)胞核為橢圓形單核；在上述5種烤瓷合金浸提液里培養(yǎng)4h后，細(xì)胞生長密集，其形態(tài)和核相沒有發(fā)生明顯的改變，各合金浸提液中培養(yǎng)的牙齦成纖維細(xì)胞形態(tài)差異不明顯（圖3）.

對五組合金和對照組的吸光度均值統(tǒng)計(jì)學(xué)分析表明，鎳鉻合金、鈷鉻合金、低含金量金合金、含鈦鎳鉻合金組與對照組和純鈦組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.01)；鎳鉻合金和鈷鉻合金組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；低含金量金合金和含鈦鎳鉻合金組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；鎳鉻合金和鈷鉻合金組與低含金量金合金和含鈦鎳鉻合金組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.01).

5種合金浸提液培養(yǎng)細(xì)胞的OD值及OD值降低的百分比見附表.

圖3 5種合金浸提液培養(yǎng)細(xì)胞24h倒置顯微鏡下觀察×100

附表 五組合金和對照組的吸光度均值

3 討論

合金析出元素在局部微環(huán)境的聚集達(dá)到超出一定濃度時(shí)，會(huì)引起局部不良反應(yīng).牙科烤瓷合金邊緣位常于齦下，改變了正常的牙體形態(tài)結(jié)構(gòu)，使得食物殘?jiān)子诖娣e且不易清潔，食物殘?jiān)l(fā)酵產(chǎn)酸，使其更易發(fā)生腐蝕，釋放出來的金屬離子首先沉積于牙齦組織中.Wataha[3]等研究發(fā)現(xiàn)酸性環(huán)境會(huì)增加某些合金的金屬離子釋放.同時(shí)烤瓷冠的頸緣是應(yīng)力集中部位，合金應(yīng)力疲勞后，更易發(fā)生腐蝕.析出的金屬離子還可經(jīng)牙周組織或消化道途徑進(jìn)入機(jī)體內(nèi)部[4]，如達(dá)到一定濃度則對機(jī)體局部和系統(tǒng)產(chǎn)生毒性作用，研究表明[5]，較低濃度的金屬離子即可引起局部毒性反應(yīng),因而烤瓷合金對牙齦的局部毒性更應(yīng)該受到研究者們的關(guān)注.

研究細(xì)胞毒性作用的方法有很多，當(dāng)前常用的體外實(shí)驗(yàn)均無法精確預(yù)測材料長期的生物學(xué)作用.盡管近年來對牙科合金生物相容性的研究報(bào)道很多，可是這些研究結(jié)果常常引起爭議，不一致的實(shí)驗(yàn)方法常導(dǎo)致不同的結(jié)果.MTT比色法是通過測量線粒體內(nèi)酶的變化來判定細(xì)胞的活性的.線粒體是細(xì)胞的病理變化中細(xì)胞受損最靈敏的指標(biāo)，因此MTT法能夠更靈敏地反映材料的細(xì)胞毒性程度[6].但細(xì)胞活性受多種因素影響，只用一種酶的活性評價(jià)材料的細(xì)胞毒性是不全面的.隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，可通過研究合金析出的金屬離子對基因表達(dá)和蛋白質(zhì)合成的影響來更全面的反映材料的細(xì)胞毒性機(jī)制.

統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果表明，鎳鉻合金和鈷鉻合金對細(xì)胞增殖影響最明顯（Ni-Gr：1.020；Co-Cr：1.035），鎳鉻合金和鈷鉻合金之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0. 05）；含鈦鎳鉻合金和低含金量金合金次之（低含金量金合金：OD:1.137；含鈦鎳鉻合金:OD:1.147），含鈦鎳鉻合金和低含金量金合金之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05）；純鈦和對照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），基本不影響細(xì)胞增殖.本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與其他學(xué)者研究基本一致[7-9].表明臨床醫(yī)生要充分了解瓷熔附基底冠合金的生物學(xué)性能，在修復(fù)選擇時(shí)應(yīng)盡量選用生物相容性好的材料，以取得良好的修復(fù)效果.含鈦鎳鉻合金和低含金量金合金抑制細(xì)胞增殖作用明顯低于鎳鉻合金和鈷鉻合金，可能與金、鈦元素改善了合金的生物性能、增加了合金的耐腐蝕性有關(guān)，研究表明含鈦量在4%～6%的含鈦鎳鉻合金可在合金表面形成氧化鈦(TiO2)，TiO2鈍化膜可改善合金的腐蝕性和生物相容性[2-6].這表明應(yīng)使用金、鈦等生物相容性較好的元素改善烤瓷合金材料力學(xué)性能、耐蝕性能及生物相容性并降低合金成本.

人牙齦成纖維細(xì)胞在5種烤瓷合金浸提液里培養(yǎng)24h后，未見明顯的細(xì)胞形態(tài)改變.倒置顯微鏡下可見細(xì)胞生長密集、細(xì)胞膜完整、無明顯的細(xì)胞損壞或凋亡，表明這五種合金材料均有較好的生物相容性.結(jié)合六級毒性評分標(biāo)準(zhǔn)顯示5種合金的細(xì)胞毒性分級都是1級，屬合格，表明盡管各種基底金屬材料的細(xì)胞毒性作用存在一定的差異，但其在臨床應(yīng)用均具有安全性.

牙科鑄造合金的生物學(xué)反應(yīng)是多方面的，細(xì)胞毒性反應(yīng)是合金與機(jī)體相互作用的結(jié)果，受合金本身化學(xué)成分、金相結(jié)構(gòu)、腐蝕性能和機(jī)體生物學(xué)環(huán)境多方面的影響，不同個(gè)體對合金的毒性反應(yīng)存在個(gè)體差異，因而在對烤瓷合金細(xì)胞毒性進(jìn)行研究時(shí)，要從多方面的多種因素加以考慮，尤其在臨床應(yīng)用中，要對所選用的鑄造合金的成分、性能、結(jié)構(gòu)及可能產(chǎn)生的不良生物學(xué)反應(yīng)具有充分的了解.本研究結(jié)果表明金合金、純鈦具有良好的生物學(xué)性

能，是牙科材料未來的發(fā)展趨勢，應(yīng)盡量選用，以取得最好的修復(fù)效果，逐步代替鎳、鉻等生物相容性差的材料.進(jìn)一步研究烤瓷基底冠合金的細(xì)胞毒性作用機(jī)制，除了牙科醫(yī)師的努力外，還需材料學(xué)專家、生物學(xué)專家等的參與.

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A

1673-260X（2014）12-0059-03