三個水稻凝集素類受體蛋白激酶基因的表達活性分析

劉 冰，淡沐春，丁彩琴，侯 芳，陳吳方，楊曉坡,2

（1.赤峰學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院，內(nèi)蒙古 赤峰 024000；2.山西大學(xué) 科學(xué)技術(shù)哲學(xué)研究中心，山西 太原 003006）

三個水稻凝集素類受體蛋白激酶基因的表達活性分析

劉 冰1，淡沐春1，丁彩琴1，侯 芳1，陳吳方1，楊曉坡1,2

（1.赤峰學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院，內(nèi)蒙古 赤峰 024000；2.山西大學(xué) 科學(xué)技術(shù)哲學(xué)研究中心，山西 太原 003006）

凝集素類受體蛋白激酶基因LecRK在植物生長發(fā)育、機械損傷和抵抗逆境等應(yīng)答過程中發(fā)揮著重要作用.本文以不同生長條件和不同組織的水稻為材料，針對OsLecRK-Ⅲ.1等三個水稻凝集素類受體蛋白激酶基因的表達活性進行了研究，為水稻LecRK家族的功能研究奠定了基礎(chǔ).

水稻；凝集素類受體蛋白激酶；差異表達

植物凝集素類受體蛋白激酶(LecRK)是在擬南芥中首次發(fā)現(xiàn)的，目前對其研究已取得一定進展.Song等(1995)研究發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)抗病激酶Xa21的水稻植株具有明顯的白葉枯病抗性[1].研究顯示，擬南芥LecRK亞家族部分成員在花器官的生長發(fā)育過程中發(fā)揮著重要作用，CLV1蛋白的表達與花器官的分生組織形成密切相關(guān)，HAESA蛋白的表達與花器官的脫落密切相關(guān)，而SGC蛋白在花粉的發(fā)育過程中發(fā)揮了重要功能[2-4].擬南芥AtLecRK2基因可通過鹽脅迫被誘導(dǎo)[5]. Xin等（2009）發(fā)現(xiàn)擬南芥A4蛋白在種子萌發(fā)過程中對脫落酸（abscisicacid，ABA）應(yīng)答具有負調(diào)控的作用[6].擬南芥LecRK-I.9蛋白在茄科植物中的過量表達使得植株對疫病菌具有較好的抗性[7].綜上所述，LecRK家族有可能在植物生長發(fā)育、機械損傷和抵抗逆境等應(yīng)答過程中起到重要作用.本文針對水稻凝集素類受體蛋白激酶基因OsLecRK-Ⅲ.1 (Os03g15250)、OsLecRK-V.2（Os05g3450）和OsLecRK-Ⅺ.1（Os11g25860）的表達活性進行了研究與分析.

1 試驗材料

供試水稻為日本晴（O.Sative.L.JaponicNippanbare.）.本實驗所使用的rTaq酶等為TaKaRa生物公司產(chǎn)品.

2 試驗方法

2.1 水稻總RNA的提取及cDNA的擴增

將所提取的RNA置于冰盒上，引物、10×RTmix、超純dNTP混合液、Nase-freeddH2O在室溫（15~25℃）解凍后迅速置于冰上.20μL逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系如下：10×RTmix2μL、超純dNTP2μL、Random（10μM）2μL、QuantReverse Transcriptase1μL、RNase-freeH2O8μL、模板RNA5μL.反應(yīng)條件為37℃孵育60min.

2.2 RT-PCR反應(yīng)及電泳檢測

引物由Invitrogen公司合成,序列如下：OsLecRK-Ⅲ. 1-F：5’-AGCGCCGATCACAGGT-3’；OsLecRK-Ⅲ.1-R：5’-GTCTCGGTGGATGACTACTTTC-3’；OsLecRK-V.2-F：5’-GAGAAGACACTGAGCGACTAC-3’；OsLecRK-V.2-R：5’-GGATAGCGACGAGTGTCA-3’；OsLecRK-Ⅺ.1-F：5’-GT CTCTCTCACTTCCCCCT-3’；OsLecRK-Ⅺ.1-R：5’-GCCGCC ATAGCCGTTG-3’.OsLecRK-Ⅲ.1擴增程序如下：94℃5 min；94℃40s，55℃40s，72℃40s，35個循環(huán)；72℃5 min；4℃保存.OsLecRK-V.2擴增程序如下：94℃5min；94℃45s,57℃40s，72℃40s，32個循環(huán)；72℃5min；4℃保存.OsLecRK-Ⅺ.1擴增程序如下：94℃5min；94℃40s，59℃30s，72℃35s，32個循環(huán)；72℃5min；4℃保存.將PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，電泳完畢后于凝膠成像分析系統(tǒng)下觀察并照相.

3 結(jié)果與分析

3.1 水稻總RNA電泳分析

正常條件下水稻根、莖、葉、愈傷組織及黑暗條件下水稻根、莖、葉的RNA電泳圖譜如圖1、圖2.

圖1 正常條件下水稻總RNA電泳圖譜

圖2 黑暗條件下水稻總RNA電泳圖譜

3.2 水稻OsLecRK-Ⅲ.1、OsLecRK-V.2和OsLecRK-Ⅺ.1基因保守序列的RT-PCR擴增

瓊脂糖凝膠電泳分析表明，OsLecRK-Ⅲ.1在正常水稻的根、莖、葉、愈傷以及黑暗條件下水稻的莖和葉中均獲得了大小約為560bp的目的片段（圖3），OsLecRK-V.2在正常水稻的根、莖、葉、愈傷以及黑暗條件下水稻的莖和葉中均獲得了大小約為448bp的目的片段（圖4），OsLecRK-Ⅺ.1在正常水稻的根、葉、愈傷以及黑暗條件下水稻的根和葉中均獲得了大小約為340bp的目的片段（圖5）.水稻OsLecRK -Ⅲ.1、OsLecRK-V.2和OsLecRK-Ⅺ.1基因在不同組織中的表達情況如表1所示.

圖3 水稻OsLecRK-Ⅲ.1基因保守序列RT-PCR擴增產(chǎn)物

圖4 水稻OsLecRK-V.2基因保守序列RT-PCR擴增產(chǎn)物

圖5 水稻OsLecRK-Ⅺ.1基因保守序列RT-PCR擴增產(chǎn)物

表1 OsLecRK-Ⅲ.1、OsLecRK-V.2和OsLecRK-Ⅺ.1基因差異表達情況

4 討論與結(jié)論

由RT-PCR表達分析的結(jié)果可知，水稻OsLecRK-Ⅲ. 1、OsLecRK-V.2和OsLecRK-Ⅺ.1基因在不同植物組織和培養(yǎng)條件下均存在一定程度的差異表達（differential expression）.Bouwmeester等（2009）在基因組水平上對擬南芥L型LecRK進行了分類與表達活性分析[8].通過與擬南芥L型LecRK基因表達譜進行比較發(fā)現(xiàn)，OsLecRK-Ⅲ.1和OsLecRK-V.2與LecRK-I.4（At3g45420）、LecRK-V.1（At1g 70110）、LecRK-S.3（At3g46760）等基因在表達特征上有一定的相關(guān)性，而OsLecRK-Ⅺ.1與LecRK-Ⅳ.3(At4g02410)在表達特征上基本相同，因此推斷彼此在相似的發(fā)育階段或生長條件下可能具有相似的功能.本文對水稻OsLecRK-Ⅲ. 1、OsLecRK-V.2和OsLecRK-Ⅺ.1基因在植物不同組織及不同生長狀態(tài)下表達活性的分析，為水稻LecRK家族的功能研究奠定了基礎(chǔ).

〔1〕SongWY,WangGL,Chen LL,etal.Areceptor kinase-like protein encoded by the rice disease resistancegene,Xa21[J].Science,1995,270:1804-1806.

〔2〕Clark SE,Williams RW,Meyerowitz EM.The CLAVATA1geneencodesaputativereceptorkinase that controls shoot and floral meristem size in Arabidopsis[J].Cell,1997,89:575-58.

〔3〕JinnTL,StoneJM,WalderJC.HAESA,anArabidopsis leucine-richrepeatreceptorkinase,controlsfloralorgan abscission[J].GenesDevel,2000,14:108-117.

〔4〕WanJ,PatelA,MathieuM,etal.Alectinreceptorlike kinase isrequired for pollen developmentin Arabidopsis[J].PlantMolBiol,2008,67:469–482.

〔5〕HeXJ,ZhangZG,YanDQ,etal.Asalt-responsive receptor-likekinase gene regulated by the ethylene signalingpathwayencodesaplasmamembraneserine/ threoninekinase[J].Theor.Appl.Genet,2004,109:377–383.

〔6〕XinZ,WangA,YangG,etal.TheArabidopsisA4 subfamilyofLectinreceptorkinasesnegativelyregulates abscisicacid responsein seed germination [J].Plant Physiol,2009,149:434–444.

〔7〕BouwmeesterK,HanM,Blanco-PortalesR,etal.The ArabidopsislectinreceptorkinaseLecRK-I.9enhances resistancetoPhytophthorainfestansinSolanaceousplants [J].PlantBiotechnologyJournal.2014,12:10–16.

〔8〕BouwmeesterK,GoversF.ArabidopsisL-typelectin receptor kinases:phylogeny,classification,and expression profiles [J].JournalofExperimentalBotany,2009,60 (15):4383-4396.

Q78；Q943

A

1673-260X（2014）12-0011-02

內(nèi)蒙古自治區(qū)教育廳高等學(xué)?？茖W(xué)研究項目（NJSY11219）