二甲雙胍對非酒精性脂肪肝細胞模型PGC-1α及脂質表達的影響

程 靖，張 寶，管石俠，侯麗麗，蔣建華

非酒精性脂肪性肝病(non－alcoholic fatty liver disease，NAFLD)是指除酒精和其他明確的肝損害因素所致的，以彌漫性肝細胞大皰性脂肪變性為病理特征，與高胰島素血癥、血脂異常、2型糖尿病以及遺傳—環(huán)境—代謝應激密切相關的臨床綜合征［1］。二甲雙胍作為一種降血糖藥物可以在不刺激胰島素分泌的基礎上改善胰島素抵抗(insulin resistance，IR)和高胰島素血癥，還可以直接作用于胰島素靶細胞如肝臟細胞、脂肪細胞、肌肉細胞等，通過受體后機制增加胰島素的敏感性，因而二甲雙胍也被用于非酒精性脂肪肝的治療。過氧化物酶體增生物激活受體 γ 共激活因子－1α (peroxisome proliferator－activated receptor γ coactivator－1α，PGC－1α)是一種核轉錄共激活因子，在糖脂代謝是一種核受體轉錄輔助活化因子，可通過激活糖異生、脂肪酸氧化、線粒體呼吸的關鍵酶參與了IR、線粒體損傷和脂代謝紊亂的形成，而這些目前已經被公認參與NAFLD的發(fā)生機制。該研究擬通過檢測非酒精性脂肪肝細胞模型中PGC－1α基因的表達變化，探討二甲雙胍用于非酒精性脂肪肝治療的可能分子機制。

1 材料與方法

1.1 細胞、主要試劑 人肝細胞株(L－02)購自中國科學院上海細胞庫;RPMI 1640無糖無酚紅培養(yǎng)基、1∶125胰蛋白酶購自美國Gibco公司;胎牛血清購自美國Hyclone公司;鏈霉素、青霉素購自華北制藥華勝公司;二甲雙胍購自美國Sigma公司;TG檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所;TRIzol、2×Tap PCR Master Mix及逆轉錄試劑盒購自美國Invitrogen公司。

1.2 細胞培養(yǎng)與分組 參照文獻［2］方法建立模型組，正常人 L－02肝細胞株用含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基培養(yǎng)于25 ml培養(yǎng)瓶，置于37℃、飽和濕度、含5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。將離體培養(yǎng)的肝細胞傳代培養(yǎng)24 h后，待細胞生長穩(wěn)定、融合度約達80%時，加入 20 μg/ml油酸(油酸以0.5%DMSO溶解)誘導肝細胞脂肪變性，細胞隔天換液并加入新配制的油酸。油酸作用72 h形成非酒精性脂肪變性肝細胞模型。對照組加入含10%胎牛血清的普通1640培養(yǎng)基。在模型組中分別添加含2.5、5、7.5 mmol/L終濃度的二甲雙胍培養(yǎng)基分別建立低、中、高劑量組，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后收集細胞。

1.3 非酒精性脂肪變性肝細胞模型的鑒定 電鏡觀察:用40 ml培養(yǎng)瓶培養(yǎng)細胞，油酸作用72 h用胰酶消化收集細胞，并制作透射電鏡標本行電鏡觀察。各組細胞內TG的生化檢測:具體步驟見1.5。

1.4RT-PCR法測定PGC-1α mRNA的表達 細胞總RNA的提取采用TRIzol一步法，按說明書操作。逆轉錄合成單鏈cDNA后進行PCR。引物設計及引物合成由上海生工生物工程技術服務有限公司完成。PGC－1α 上游引物序列為:5'－CAGCAAGTCCTCAGTCCTCAC－3'，下 游 引 物:5'－TGCCTCCAAA GTCTCTCTCAG－3'，產物大小 247 bp;β－actin 上游引物序 列 為:5'－GAAATAAGAACACCCCTTC－3'，下 游引物:5'－TTGCCGACAGGATGCAGAA－3'，產物大小100 bp。擴增條件為:預變性95℃ 5min，進入循環(huán)，95 ℃ 50 s，55 ℃ 50 s，72 ℃ 50 s，32 個循環(huán)后72℃ 10 min。將PCR產物在瓊脂糖凝膠中進行電泳，置于凝膠圖像分析系統(tǒng)，用LabWorks 4.5軟件進行積分吸光度值(IA)測定，目的基因的IA與內參吸光度值的比值代表目的基因的相對表達含量。

1.5 各組細胞內TG的檢測 采用6孔板，每孔植入約1×105個細胞，按上述方法分組處理，培養(yǎng)24 h后棄去上清液，收集各組培養(yǎng)板上的細胞，反復凍融裂解細胞，3 000 r/min離心10 min，取上清液檢測TG。采用TG檢測試劑盒，按試劑盒的說明書檢測TG含量。

1.6 電鏡觀察 由安徽省立醫(yī)院電鏡室專業(yè)人員固定和處理細胞、切片，觀察細胞器、線粒體和脂滴形成情況。

1.7 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 11.0軟件進行分析，數(shù)據用±s表示。兩組間計量資料比較采用t檢驗，同組不同濃度間比較采用方差分析，兩因素間的相關性用直線相關分析法進行分析。

2 結果

2.1 電鏡下觀察有無線粒體損傷及脂滴變化 對照組細胞中可見少量大小不等的脂滴，線粒體呈橢圓形或圓形，嵴膜清晰。模型組細胞中脂滴明顯增多(生化檢測示模型組細胞內TG水平明顯升高，說明油酸誘導造模成功)，少數(shù)線粒體出現(xiàn)空泡樣改變。低、中劑量組細胞中可見脂滴分布，線粒體空泡樣改變有所減少。高劑量組細胞中可見較少脂滴，線粒體稍腫脹，但線粒體嵴膜清晰。見圖1。

2.2 不同濃度二甲雙胍對L-02細胞內TG含量的影響 與對照組比較，模型組細胞內TG水平明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);與模型組比較，高劑量組細胞內TG明顯減少，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);與低劑量組比較，高劑量組細胞內TG明顯減少，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。見表1。

表1 二甲雙胍和L-02細胞內TG的含量(±s)

與模型組比較:*P＜0.05;與對照組比較:#P＜0.05;與低劑量組比較:△P＜0.05;與中劑量組比較:▽P＜0.05;與高劑量組比較:▲P＜0.05

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2.3 不同濃度二甲雙胍對L-02細胞PGC-1α mRNA變化的影響 與對照組比較，模型組L－02細胞中PGC－1α mRNA表達量明顯減少，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。與模型組比較，低、中、高劑量組細胞內PGC－1α mRNA表達量明顯增多，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。與低劑量組比較，高劑量組細胞內PGC－1α mRNA表達量明顯增多，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。見表2。

表2 二甲雙胍和PGC-1α灰度值(±s)

表2 二甲雙胍和PGC-1α灰度值(±s)

與模型組比較:*P＜0.05;與對照組比較:#P＜0.05;與低劑量組比較:△P＜0.05;與中劑量組比較:▽P＜0.05;與高劑量組比較:▲P＜0.05

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圖2 L-02細胞PGC-1α mRNA相對表達量

2.4 肝細胞中PGC-1α基因表達水平與TG的相關性 L－02細胞中PGC－1α基因的表達水平與細胞內TG的水平呈負相關 (r=－0.581，P＜0.05)。

3 討論

NAFLD患者經常伴有代謝綜合征病癥如肥胖、葡萄糖耐量受損、2型糖尿病、高血脂和高血壓等，這些伴隨疾病不僅能增加發(fā)生心血管疾病的風險還可能進一步加重肝臟的損害。因此，對于NAFLD的治療，關鍵在于改善與IR有關的代謝紊亂。胰島素增敏藥物二甲雙胍在NAFLD的治療中，不僅對改善IR、肝臟血清酶學指標和體重有明確的療效［3］，而且對肝臟脂肪變性、肝細胞損傷和NAFLD活動評分也有一定作用［4］。而最近一些研究［5－7］顯示二甲雙胍雖能改善IR等代謝紊亂癥狀卻對肝臟組織學改善不明顯，這可能與各研究中二甲雙胍劑量、觀察時間及評價方法不同等有關。所以對該藥的具體療效、治療機制及其副作用仍有待研究。

二甲雙胍作為一種口服降糖藥可促進外周組織對葡萄糖的利用和減少肝糖的輸出。PGC－1α作為一種協(xié)同刺激因子，可與不同受體及轉錄因子結合發(fā)揮不同生理功能。PGC－1α在肝臟中的主要作用為促進肝糖異生及調節(jié)肝臟脂肪酸氧化。在肝臟中，PGC－1α 對PPAR－α 有協(xié)同刺激作用，可增加脂肪酸β氧化酶的轉錄活性。PGC－1α還可通過激活肝臟脂肪酸β氧化的限速酶肉毒堿棕櫚?；D移酶(CPT)的表達啟動脂肪酸β氧化。有研究［8］顯示腺苷酸活化蛋白激酶α(AMPKα)活化可通過激活PPARα和PPARγ的復合激活因子PGC－1增加小鼠骨骼肌細胞的脂肪酸氧化。

本研究顯示，與對照組肝臟細胞比較，油酸誘導的非酒精性脂肪肝細胞模型中TG的含量明顯增多，而PGC－1α mRNA的表達量明顯下降。給予二甲雙胍藥物干預后，低、中、高劑量組細胞中的TG水平明顯低于模型組，而PGC－1α mRNA的表達量有所增加，且細胞中PGC－1α基因的表達水平與細胞內TG的水平呈負相關，這提示改善PGC－1α的表達可減少肝臟細胞中脂質的堆積。有研究［9］顯示二甲雙胍可以增加人類骨骼肌細胞及心衰患者心肌細胞中PGC－1α的表達。在人類的肌小管中，PGC－1α的過表達增加了棕櫚酸的氧化速率和調節(jié)脂質代謝相關基因的mRNA表達，并促進了線粒體的生物合成功能［10］。目前關于人肝臟細胞中 PGC－1α的表達水平及二甲雙胍干預的體外實驗較少，但有研究［11］顯示在成年小鼠的肝臟細胞中二甲雙胍可阻止雷帕霉素靶蛋白復合物2(TORC2)－調節(jié)的PGC－1α的上調，所以二甲雙胍對肝臟細胞 PGC－1α表達的影響及具體分子機制還有待進一步研究。

綜上所述，PGC－1α與脂肪酸氧化、線粒體生物功能和脂代謝紊亂密切相關，研究不同濃度二甲雙胍對PGC－1α表達的影響，可進一步明確二甲雙胍用于NAFLD治療的分子機制。二甲雙胍已被證實為AMPK的激活劑，由此可推測二甲雙胍可能通過活化細胞內調節(jié)因子AMPKα從而激動PGC－1α基因的表達，以增加脂酶的活性和提高胰島素敏感性，在調節(jié)肝臟的脂肪代謝功能和改善肝細胞脂肪變性等方面具有顯著效果。

［1］中華醫(yī)學會肝臟病學分會脂肪肝和酒精性肝病學組.非酒精性脂肪肝病診療指南(2010年修訂版)［J］.中華肝臟病雜志，2010，18(3):163 －6.

［2］楊林輝，陳東風.油酸誘導培養(yǎng)肝細胞脂肪變性模型的建立［J］.重慶醫(yī)學，2007，36(8):698 －700.

［3］Idilman R，Mizrak D，Corapcioglu D，et al.Clinical trial:insulinsensitizing agents may reduce consequences of insulin resistance in individuals with non－alcoholic steatohepatitis［J］.Aliment Pharmacol Ther，2008，28(2):200 －8.

［4］Loomba R，Lutchman G，Kleiner D E，et al.Clinical trial:pilot study of metformin for the treatment of non－alcoholic steatohepatitis［J］.Aliment Pharmacol Ther，2009，29(2):172 －82.

［5］Nar A，Gedik O.The effect of metformin on leptin in obese patients with type 2 diabetes mellitus and nonalcoholic fatty liver disease［J］.Acta Diabetol，2009，46(2):113 －8.

［6］Haukeland J W，Konopski Z，Eggesb? H B，et al.Metformin in patients with non－alcoholic fatty liver disease:a randomized，controlled trial［J］.Scand J Gastroenterol，2009，44(7):853 － 60.

［7］Omer Z，Cetinkalp S，Akyildiz M，et al.Efficacy of insulin－sensitizing agents in nonalcoholic fatty liver disease［J］.Eur J Gastroenterol Hepatol，2010，22(1):18 －23.

［8］Lee W J，Kim M，Park H S，et al.AMPK activation increases fatty acid oxidation in skeletal muscle by activating PPARalpha and PGC－1［J］.Biochem Biophys Res Commun，2006，340(1):291－5.

［9］Suwa M，Egashira T，Nakano H，et al.Metformin increases the PGC－1 protein and Aoxidative enzyme activities possibly via AMPK phosphorylation in skeletal muscle in vivo［J］.J Appl Physiol，2006，101(6):1685 －92.

［10］Nikoli N，Rhedin M，Rustan A C，et al.Overexpression of PGC－1α increases fatty acid oxidative capacity of human skeletal muscle cells［J］.Biochem Res Int，2012，2012:714074.

［11］Shaw R J，Lamia K A，Vasquez D，et al.The kinase LKB1 mediates glucose homeostasis in liver and therapeutic effects of metformin［J］.Science，2005，310(5754):1642 －6.