螺旋藻γ-亞麻酸的提取優(yōu)化及體外抗氧化活性的研究

王 菲，佘星星，孫冰潔，杜嘉琛，張家瑋，任迪峰，* ，魯 軍

（1.北京林業(yè)大學生物科學與技術學院，北京市林業(yè)食品加工與安全重點實驗室，北京 100083;2.中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院，北京市蛋白功能肽工程技術研究中心，北京 100015）

鈍頂螺旋藻（Spirulina platensis，SP）屬藍藻門（Cyanophyta），顫藻科（Oscillatoriales），螺旋藻屬或節(jié)旋藻屬（Arthrospira）［1］。螺旋藻富含人體必需氨基酸、維生素、礦物質、微量元素、不飽和脂肪酸等多種營養(yǎng)物質，具有抗氧化、抗輻射、抗腫瘤等多種生物功效［2－3］，被聯(lián)合國糧農組織及聯(lián)合國世界食品協(xié)會推薦為“二十一世紀最理想食品”。螺旋藻中GLA含量占其總脂肪酸含量 80～250g·kg－1［4］，高于螺旋藻常見提取來源月見草（80g·kg－1）和琉璃苣（210g·kg－1）。螺旋藻生產廠家遍布云南、內蒙古等10多個省份，年產量高達1000t［5］，但目前市場螺旋藻產品多為藻粉和片劑，螺旋藻粉直接應用于食品中因其溶解性質的局限性，不利于人體吸收，因而螺旋藻應用受到一定限制。

γ－亞麻酸是人體代謝過程中不可或缺的多不飽和脂肪酸，是合成前列腺素E1的前體物質。GLA還能夠衍生成如二高－γ－亞麻酸（DHGLA）以及花生四烯酸（AA）等物質［6］。GLA及其衍生物具有多種有益的藥理作用。許多研究證明，GLA具有多種生物活性，如抗腫瘤，減肥，抗血栓，降低低密度脂蛋白等活性［7－10］。

目前，有研究采用超臨界CO2萃取法（SCE），以乙醇為夾帶劑，從極大螺旋藻中提取GLA，回收率為4.4g·kg－1（GLA/干 量）［11］。Sajilata 等 人［12］優(yōu) 化 了SCE提取方法，從鈍頂螺旋藻中提取得到5.1g·kg－1GLA。但是SCE高成本，產率低的特點限制了其在大規(guī)模工業(yè)化提取GLA中的應用。此外，對于GLA的體外抗氧化活性鮮有報道。因此，本研究目的為建立一種經濟的從螺旋藻中提取GLA的有機溶劑提取方案，并對螺旋藻GLA的抗氧化活性進行研究，為開發(fā)利用我國豐富螺旋藻資源以及開發(fā)新型醫(yī)療保健食品提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

螺旋藻粉 內蒙古再回首生物工程限公司（中國內蒙古，鄂爾多斯）;人正常肝細胞HL－7702細胞系 中國科學院上海細胞庫，培養(yǎng)于含有10%胎牛血清以及1%青霉素鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基中;γ－亞麻酸甲酯標準品 美國AccuStandard公司;乙醇、丙酮、石油醚（分析純）等試劑 北京化學試劑公司。

7890A氣相色譜 安捷倫，配有火焰離子檢測器和 INNOMAX 極性柱（30m ×250μm ×0.25μm）;SHZ－88水浴恒溫振蕩器 金壇市國旺實驗儀器廠;SHB－III真空泵 鄭州長城科工貿有限公司;RE－5203旋轉蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠;752紫外可見分光光度計 上海美譜達儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 提取方案設計 采用單因素實驗方法對螺旋藻中GLA進行提取，探討提取溶劑、提取料溶比、提取溫度、提取時間對提取得率的影響。

將60g螺旋藻粉放入避光燒瓶中，加入60mL提取溶劑，于60℃恒溫水浴120min后，轉移到旋轉蒸發(fā)儀。在壓力175MPa溫度40℃條件下蒸去大部分溶劑后，產物冷凍干燥并進行GLA定量。將螺旋藻粉與提取效果最好溶劑乙醇分別以不同料溶比（w/v）:1∶8、1∶10、1∶12、1∶15、1∶18 混合，其余操作步驟同上所述。將螺旋藻粉與乙醇以從上步實驗獲得最佳料溶比混合，分別在60℃水浴加熱30、60、90、120、150min，其余步驟如上所述。按照之前實驗所得最佳料溶比、最佳提取時間，分別在30～80℃水浴溫度條件下，每10℃一組，進行提取實驗，后續(xù)步驟如前所述。

1.2.2 GLA含量測定 將真空冷凍干燥后的提取物用正己烷溶于10mL的燒瓶中，加入1mL H2SO4－CH3OH（1∶9，v/v）混合液后在70℃條件下恒溫水浴10min進行甲酯化。甲酯化后樣品置于室溫下冷卻后加入1mL正己烷后，再加入去離子水定容至10mL。取上層液體1μL用于氣相色譜定量。定量時流速30mL·min－1，程序升溫，190℃保持 3min 進而以8℃·min－1速度升高至230℃并保持8min。注射器和檢測器的溫度分別是220℃和250℃。

將γ－亞麻酸甲酯標準品溶于正己烷配制不同濃度 0.025、0.050、0.075、0.100、0.125g·L－1的溶液，GC定量分析后，以濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標繪制標準曲線。標準曲線顯示良好線性關系（R2=0.9941）。將提取得到螺旋藻GLA樣品甲酯化后，GC色譜進樣定量，得到峰面積帶入公式（1）縱坐標，得到γ－亞麻酸甲酯濃度后換算為GLA濃度。

最終螺旋藻GLA提取產量由下式計算:

GLA產量=（提取所得GLA濃度×1mL×10）/藻粉質量×100

1.2.3 實驗參數(shù)正交優(yōu)化及螺旋藻GLA純化 基于料溶比 （1∶10、1∶12、1∶15）、提取時間 （60、90、120min）、提取溫度（60、70、80℃）三個單因素實驗結果，進行了L9（34）三因素三水平正交實驗優(yōu)化實驗參數(shù)，實驗設計如表1所示。采用文獻［12］方法對螺旋藻GLA進行純化，純化后螺旋藻GLA提取物純度由58.9%提高到90%，進一步應用于抗氧化活性分析。

表1 L9（34）正交實驗的各個因素和水平Table 1 Factors and levels of the L9（34）orthogonal test

1.2.4 DPPH自由基清除能力 DPPH自由基清除能力采用Burits等人［13］的方法進行測定。

1.2.5 羥自由基清除能力 參照周波等人［14］方法進行測定。

1.2.6 脂質抗氧化能力 脂質過氧化抑制能力評價采用文獻［15］的方法，利用不飽和脂肪酸氧化產物與硫代巴比妥酸（TBA）反應生成有色化合物在535nm有最大吸收值。此法基于卵磷脂能夠創(chuàng)造一層脂質層用于反應并且Fe2+能夠誘導氧化反應。

1.2.7 對雙氧水氧化損傷HL－7702細胞保護作用 將生長良好的HL－7702細胞以1×105mL－1密度接種于96孔板，每孔100μL，于37℃ CO2培養(yǎng)箱中孵育24h。細胞貼壁后以含50μmol·L－1GLA提取物培養(yǎng)基預先孵育24h，再以不同濃度雙氧水染毒HL－7702細胞18h，并設置對照組及調零孔，每組三個復孔。處理后的細胞采用MTT比色法進行細胞活率檢測，每孔加入 20μL 0.5%MTT（5mg·mL－1）避光37℃孵育4h后吸棄上清液，加入100μL的DMSO，避光振蕩10min，使結晶物充分溶解后，酶標儀492nm處測定吸光值。結果表示為同對照組相比的百分值。

表2 單因素實驗結果Table 2 Results of single factor test

2 結果與分析

2.1 各個提取條件對提取結果影響

本實驗分別控制提取溶劑、提取溫度、料溶比、提取時間等因素的變化來研究各個因素對提取結果的影響，實驗結果如表2所示。

從表2中看出，乙醇提取效果明顯優(yōu)于其它兩種有機溶劑。乙醇溶劑提取產率近于丙酮提取產率的2倍，并且將近石油醚提取產量的12倍。此外，由于丙酮作為提取溶劑時可能會轉化為有害的丙酸［16］，而乙醇常被用于從植物材料中提取天然產物［17］，因而選用乙醇作為從SP中提取GLA的提取溶劑。乙醇在提取SP中的油脂時其夾帶效果與其自身氫鍵和離子力共同作用，從而增加了油脂在乙醇中的溶解度，因而GLA產量得到提高［18］。

隨著料溶比由1∶8降低至1∶12時，GLA產量顯著增加，當料溶比繼續(xù)降低時，產量仍略有升高，但不顯著。此結果與之前研究表現(xiàn)出相同的趨勢，表明了隨著料溶比降低，螺旋藻中油脂產量升高［19］。

GLA產量隨著時間變化趨勢與料溶比相似，提取時間90min及150min時均出現(xiàn)增長，從成本節(jié)約角度考慮，90min為較適宜提取時間。同樣隨著提取溫度升高，GLA與乙醇的擴散率進一步加劇，GLA產量大幅度升高。

隨著提取溫度升高至60℃時，GLA產量顯著升高，溫度繼續(xù)上升至70℃時GLA產量達到最大。這是由于溶劑和溶質（脂質成分）擴散性加劇所致。但當提取溫度高于乙醇沸點70℃時，大量乙醇溶劑沸騰而揮發(fā)至空氣中，提取溶劑急劇減少，導致提取效率急劇下降［19］。

2.2 正交實驗優(yōu)化

L9（34）正交實驗結果如表3所示，三個因素對GLA產量的影響順序從高到低分別為提取溫度、料溶比、提取時間（C＞A＞B）。最優(yōu)組合為A2B2C2即料溶比1∶12，提取時間90min，提取溫度70℃。采用最優(yōu)條件從SP中提取GLA 得到了（8.3±0.17）g·kg－1，與之前研究中采用SCE 方法得到的產率4.4g·kg－1和5.1g·kg－1相比，產量至少提高了 62.7%［11－12］。

2.3 螺旋藻GLA抗氧化活性

以廣泛公認的抗氧化劑VC為陽性對照，螺旋藻GLA提取物DPPH自由基抑制活性結果如表4所示:

表3 L9（34）正交實驗結果及方差分析Table 3 Results and variance analysis of the L9（34）orthogonal test

表4 GLA提取物對DPPH自由基清除效果Table 4 Inhibitory activity of the γ－linolenic acid extract on 1，1－diphenyl－2－picrylhydrazyl radicals

隨著 VC濃度升高（100～800mg·L－1），其對DPPH自由基抑制率呈線性升高（y=112.59x+4.6648，R2=0.9735），展現(xiàn)了良好的DPPH自由基清除效果。但與之相反，盡管GLA濃度呈指數(shù)升高，其抑制效果仍然較低。

同樣的，VC展現(xiàn)出明顯的羥基自由基清除效果，如表5所示，盡管隨著GLA提取物濃度升高，抑制百分率相應小幅度升高，在一定濃度范圍內展現(xiàn)出了羥基自由基清除效果，但不足以充分體現(xiàn)其抗氧化活性。

表5 不同濃度VC/GLA的羥基自由基清除能力Table 5 Inhibitory activity of the γ－linolenic acid extract on hydroxyl radicals

GLA提取物脂質抗氧化能力如表6所示，螺旋藻GLA與VC均展現(xiàn)出良好的脂質抗氧化能力，并呈濃度依賴性。10mg·L－1的GLA提取物的自由基抑制率（47.67% ± 0.40%）甚至高于 100mg·L－1的 VC，展現(xiàn)出了極強的脂質抗氧化能力。實驗證明以大鼠尾模型，飼喂添加GLA飼料后其體內總抗氧化能力及抗脂質過氧化能力得到增強［20］。

表6 不同濃度GLA提取物的脂質抗氧化能力Table 6 Inhibitory activity of the γ－linolenic acid extract on Fe2+induced lipid peroxidation

2.4 螺旋藻GLA對雙氧水所致HL－7702細胞氧化損傷的保護作用

較早實驗結果顯示 250μmol·L－1濃度以下的螺旋藻亞麻酸對HL－7702細胞無損傷作用（數(shù)據(jù)未顯示）。圖 1顯示，不同濃度雙氧水處理均會對HL－7702細胞造成損傷，且呈現(xiàn)出濃度依賴性，700μmol·L－1雙氧水處理導致細胞活率下降為對照組的60%。50μmol·L－1螺旋藻 GLA 預先孵育處理能夠有效抑制各個濃度雙氧水導致的細胞活率下降，尤其對 700μmol·L－1損傷細胞具有顯著保護作用。這可能與其較強的脂質抗氧化能力有關，通過自身氧化抑制HL－7702細胞膜脂質過氧化發(fā)生，避免細胞因細胞膜受損所致細胞活率下降。

3 討論

圖1 GLA提取物對H2O2所致氧化損傷HL－7702細胞保護作用Fig.1 Protective effect of GLA on H2O2－induced HL－7702 cells

DPPH自由基被廣泛用于測定多種天然物質的體外抗氧化活性，這是因為其能夠排除葡萄糖干擾而具有很好的穩(wěn)定性［21］。但最近有爭論稱其不存在于體內，因而不能反映真實的代謝情況［22］。Fenton反應是最常見的產生羥基自由基的化學反應，鄰菲羅啉－Fe2+是一種常見的氧化還原指示劑，能夠根據(jù)系統(tǒng)的氧化還原狀態(tài)的變化改變它的顏色。此外，GLA具有高不飽和度而極易被氧化，DPPH和羥基自由基清除法為水相環(huán)境，可能會導致水包油型乳狀液的氧化，因而影響GLA提取物的穩(wěn)定性以及自由基清除能力［23］。因此，GLA提取物在水相環(huán)境中沒有展現(xiàn)出明顯的抗氧化活性，其抗氧化能力受到了限制。

亞鐵離子能夠誘導脂質產生自由基，并引發(fā)鏈反應，最終導致脂質過氧化作用。而具有抗氧化能力的物質能夠與脂質過氧化的中間產物發(fā)生反應，例如脂質自由基，終止鏈反應并最終抑制脂質過氧化。這種機制可以用來建立一種不飽和脂肪酸（UFA）的氧化模型，用來評估樣品的抗氧化性。螺旋藻GLA清除DPPH自由基和羥基自由基活性實驗提示雖然螺旋藻GLA提取物本身容易被氧化，但難以在水相環(huán)境中發(fā)揮其抗氧化活性。與之相反，脂質抗氧化能力能夠成功模擬體內的脂質環(huán)境，因而螺旋藻GLA提取物表現(xiàn)出較強的脂質抗氧化能力。

H2O2常用于制造氧化應激引起的細胞損傷模型，氧化損傷細胞中由H2O2介導的自由基ROS大量產生［24］。在人體內，不飽和脂肪酸是細胞膜的組成成分，容易受到自由基的攻擊，從而導致不可控的鏈反應發(fā)生脂質過氧化并最終導致生物損傷。GLA提取物可能先通過自身被氧化保護細胞或者細胞膜免受自由基攻擊，并保護細胞免受脂質過氧化的威脅，最終降低由自由基帶來的損傷，對氧化損傷HL－7702細胞起到保護作用。關于螺旋藻GLA提取物的抗氧化護肝效果的詳細作用機制有待進一步深入研究。

4 結論

4.1 同丙酮和石油醚相比，乙醇更適合作為從SP中提取GLA的提取溶劑。

4.2 以乙醇為溶劑，1∶12（V/V）料溶比70℃恒溫條件下提取90min能夠得到最高GLA產量8.3±0.17g·kg－1（GLA/干物質量）。

4.3 螺旋藻GLA提取物具有較強的抑制Fe2+誘導的脂質過氧化效果。

4.4 螺旋藻GLA提取物能夠保護人正常肝細胞免受雙氧水所致氧化損傷，其體外抗氧化生物活性具有潛在功能應用價值。

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