大孔吸附樹脂純化胡蘆巴中原薯蕷皂苷的研究

郭清峰，王 瑋，余淑嫻，梁永利，陳建華，任怡欣

（1.包頭輕工職業(yè)技術(shù)學(xué)院，內(nèi)蒙古包頭 014035；2.南昌大學(xué)理學(xué)院，江西南昌 330031）

胡蘆巴為豆科植物胡蘆巴屬胡蘆巴（Trigonella foenum-graecumL.）的種子，在我國(guó)主產(chǎn)于貴州、江西、河北、安徽、四川、新疆等地，且南北各地均有栽培。干燥的胡蘆巴種子有溫腎、祛寒、止痛的功效，主治腎藏虛冷、小腹冷痛、小腸疝氣、寒濕腳氣等癥[1]。胡蘆巴的主要化學(xué)成分為甾體皂苷、黃酮及其苷、三萜、生物堿、香豆素、有機(jī)酸及油脂等，其中甾體皂苷是其主要成分[2]。原薯蕷皂苷（protodioscin）屬于甾體皂苷，Hiroshige等[3]在胡蘆巴中發(fā)現(xiàn)含有原薯蕷皂苷，該有效成分具有增強(qiáng)性功能、降血脂、對(duì)癌細(xì)胞有毒殺和抗白血病等作用[4-7]。

大孔吸附樹脂是一種有機(jī)高聚物吸附劑，具有選擇性好、吸附容量大、解吸容易、再生簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)?；诖罂孜綐渲奶攸c(diǎn)，選用大孔吸附樹脂來分離純化胡蘆巴中原薯蕷皂苷，通過對(duì)大孔吸附樹脂富集、純化胡蘆巴中原薯蕷皂苷工藝條件與參數(shù)的研究，探索其分離純化的最優(yōu)工藝參數(shù)，從而確定富集、純化胡蘆巴中原薯蕷皂苷的可行工藝路線。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

胡蘆巴（Trigonella foenum-graecumL.）藥材 購(gòu)自江西省藥材公司（產(chǎn)地貴州），原薯蕷皂苷標(biāo)準(zhǔn)品（含量≥98%）購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢驗(yàn)所；甲醇、乙腈 色譜純；其他試劑 分析純；水 二次重蒸餾水；D-101、DB-301、HP-20、HPD-400A、HPD-500、HPD-l00、HPD-600型大孔吸附樹脂 購(gòu)自河北滄州寶恩化工有限公司；YWD-06、YWD-01B、NKA-9型大孔吸附樹脂 購(gòu)自中國(guó)滄州遠(yuǎn)威化工有限公司。

2695型高效液相色譜儀 美國(guó)Waters公司；Waters2996型二極管陣列檢測(cè)器，Gold SpectrumLab 54型紫外可見分光光度計(jì) 上海棱光技術(shù)有限公司；KQ2200E型超聲儀 昆山市超聲儀器有限公司；RE-52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器廠；Sartorius型十萬分之一電子天平 德國(guó)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 葫蘆巴粗提液的制備 實(shí)驗(yàn)中的胡蘆巴取當(dāng)年生原藥材，去雜、洗凈、低溫干燥至恒重，取出置于干燥器內(nèi)冷卻，用粉碎機(jī)粉碎，過40目網(wǎng)篩，分裝備用（置于陰涼干燥處密封，供研究提取分離用）。

稱取已干燥至恒重的胡蘆巴粉適量，用正己烷進(jìn)行索氏脫脂2h，用75%的乙醇溶液超聲提取3次，每次15min，把提取液過濾，合并濾液，濾液再高速離心、濾過，將過濾液減壓濃縮，濃縮液移入容量瓶，并用75%的乙醇溶液定容至250mL備用[8]。

1.2.2 葫蘆巴中原薯蕷皂苷的含量測(cè)定[8]

1.2.2.1 色譜條件 Lichrospher C18柱（4.6mm×250mm，5μm）；流動(dòng)相：乙腈-水（8∶92）；柱溫：30℃；流速：0.5mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：203nm。

1.2.2.2 校準(zhǔn)曲線和線性范圍考察 稱取50℃干燥2h的原薯蕷皂苷標(biāo)準(zhǔn)品2.70mg，置于25mL棕色容量瓶中，用流動(dòng)相超聲溶解，并定容至刻度，搖勻，即得標(biāo)準(zhǔn)品溶液（0.108mg·mL-1）。依次精密吸取標(biāo)準(zhǔn)品溶液1、2、4、6、10、12μL進(jìn)樣，記錄峰面積，以峰面積值Y對(duì)原薯蕷皂甙的進(jìn)樣濃度X（mg·mL-1）進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為Y=11582.93X-16.73，r=0.9999。

1.2.3 大孔吸附樹脂的篩選 通過比較10種大孔吸附樹脂的靜態(tài)吸附和解吸的性能篩選出適合于純化原薯蕷皂苷的樹脂。精密稱取各種型號(hào)已干燥至恒重的樹脂0.5g，置于錐形瓶中，加入原薯蕷皂苷提取液25mL，放入恒溫（25℃）搖床中振蕩24h。把經(jīng)過吸附后的提取液過濾，然后用高效液相色譜測(cè)定濾液中原薯蕷皂苷的濃度，從而測(cè)定各種型號(hào)大孔吸附樹脂的吸附量。將吸附平衡后的樹脂轉(zhuǎn)移至色譜柱中，用4BV的70%乙醇解吸，然后用高效液相色譜測(cè)定解吸液中原薯蕷皂苷的濃度。大孔吸附樹脂的吸附量，吸附率和解吸率按下式進(jìn)行計(jì)算。

式中：C0—起始溶液中原薯蕷皂苷的質(zhì)量濃度，mg/mL；C1—洗脫液中原薯蕷皂苷的質(zhì)量濃度，mg/mL；Ce—吸附平衡時(shí)溶液中原薯蕷皂苷的質(zhì)量濃度，mg/mL；V—葫蘆巴提取液體積，mL；m—樹脂質(zhì)量，g。

1.2.4 動(dòng)態(tài)吸附條件的確定 把通過靜態(tài)與解吸實(shí)驗(yàn)篩選出的大孔樹脂進(jìn)行濕法裝柱，分別考察上柱吸附體積流量、樹脂藥材比、樹脂柱徑高比等因素，收集不同因素下的各洗脫液，通過測(cè)定洗脫液中原薯蕷皂苷的濃度，計(jì)算出原薯蕷皂苷的吸附量，以吸附率為指標(biāo)確定最佳吸附條件。

1.2.4.1 上柱吸附體積流量的確定 精密吸取10mL原薯蕷皂苷提取液分別以2、4、6、8、10BV/h的體積流量上柱吸附，收集流出液，靜置1h。然后用3BV的水以8BV/h的流速進(jìn)行清洗，收集流出液。合并2次的流出液，測(cè)定原薯蕷皂苷的質(zhì)量濃度，根據(jù)式（2）計(jì)算原薯蕷皂苷的吸附率。

1.2.4.2 樹脂藥材質(zhì)量比的確定 調(diào)整胡蘆巴提取液的上柱量，使干樹脂藥材質(zhì)量比分別為1∶1，2∶1，4∶1，8∶1和16∶1（質(zhì)量比的單位為g/g），以70%乙醇作為洗脫劑，用3BV（樹脂床體積數(shù)）70%乙醇，在10BV/h下進(jìn)行解吸，收集洗脫液，測(cè)定洗脫液中原薯蕷皂苷的質(zhì)量濃度，根據(jù)式（2）計(jì)算原薯蕷皂苷的吸附率。

1.2.4.3 樹脂柱徑高比的確定 取HP-20型干樹脂濕法裝柱，使徑高比分別為1∶3、1∶6、1∶9、1∶12，1∶15，樹脂藥材質(zhì)量比為8∶1，精密吸取胡蘆巴提取液上柱，用70%乙醇液洗脫，收集洗脫液，測(cè)定原薯蕷皂苷的質(zhì)量濃度，根據(jù)式（2）計(jì)算原薯蕷皂苷的吸附率。

1.2.5 動(dòng)態(tài)解吸條件的確定 把通過靜態(tài)與解吸實(shí)驗(yàn)篩選出的大孔樹脂進(jìn)行濕法裝柱，分別考察不同洗脫劑、洗脫劑用量、不同體積分?jǐn)?shù)的洗脫劑、洗脫劑體積流量等因素，收集不同因素下的各洗脫液，通過測(cè)定洗脫液中原薯蕷皂苷的濃度，計(jì)算出原薯蕷皂苷的解吸率，以吸附量為指標(biāo)確定最佳解吸條件。

1.2.5.1 洗脫劑體系的確定 最常用的洗脫劑是水、甲醇、乙醇、丙酮、醋酸乙酯以及它們的混合液等，所以考慮水、甲醇、乙醇、丙酮、醋酸乙酯以及它們的混合液來選擇。精密吸取胡蘆巴提取液裝柱、上樣，然后分別用3BV樹脂床體積數(shù)的水、甲醇、乙醇、丙酮、醋酸乙酯、70%甲醇、70%乙醇溶液分別以10BV/h的流速進(jìn)行解吸，收集洗脫液，測(cè)定原薯蕷皂苷的質(zhì)量濃度，根據(jù)式（3）計(jì)算原薯蕷皂苷的解吸率。

1.2.5.2 洗脫劑用量的確定 精密吸取胡蘆巴提取液上樣，然后用70%乙醇，以10BV/h的速度洗脫，按樹脂床體積1、2、3、4、5BV的70%乙醇洗脫劑分別收集洗脫液，測(cè)定洗脫液中原薯蕷皂苷的質(zhì)量濃度，根據(jù)式（3）計(jì)算原薯蕷皂苷的解吸率。

1.2.5.3 洗脫劑濃度的確定 精密吸取胡蘆巴提取液上樣，然后分別用15%、30%、50%、70%、90%乙醇溶液以10BV/h的流速進(jìn)行解吸，收集洗脫液，測(cè)定原薯蕷皂苷的質(zhì)量濃度，根據(jù)式（3）計(jì)算原薯蕷皂苷的解吸率。

1.2.5.4 洗脫劑體積流量的確定 精密吸取胡蘆巴提取液上樣，以3BV的70%乙醇溶液作為洗脫劑，分別以4、8、10、12、15BV/h的流速進(jìn)行解吸，收集洗脫液，測(cè)定，根據(jù)式（3）計(jì)算原薯蕷皂苷的解吸率。

2 結(jié)果與分析

2.1 大孔吸附樹脂的篩選

通過靜態(tài)吸附與解吸實(shí)驗(yàn)測(cè)定了10種大孔樹脂對(duì)原薯蕷皂苷的的吸附量和解吸率，吸附量和解吸率的按照1.2.3項(xiàng)下式（1）和式（2）計(jì)算，結(jié)果見表1。

從表1可看出，不同廠家不同型號(hào)的大孔吸附樹脂對(duì)原薯蕷皂苷的吸附量與解吸率均不同，其中HP-20型大孔吸附樹脂吸附量最大，且解吸率也最高，故選用HP-20型大孔吸附樹脂作為胡蘆巴中原薯蕷皂苷的純化樹脂。

表1 不同類型大孔樹脂對(duì)原薯蕷皂苷的靜態(tài)吸附量及解吸率Table 1 Static adsorption of protodioscin capacity and desorption rate of different types of macroporous resin

2.2 動(dòng)態(tài)吸附條件的確定

2.2.1 上柱吸附體積流量的確定 上柱吸附體積流量是影響吸附率的重要因素，原薯蕷皂苷在樹脂床上的吸附需要有一個(gè)過程，若藥液的上柱吸附體積流量過快，部分原薯蕷皂苷未及吸附就會(huì)泄漏，因此應(yīng)適當(dāng)控制吸附體積流量，實(shí)際實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖1，圖1表明當(dāng)吸附體積流量小于4BV/h時(shí)，原薯蕷皂苷吸附率均較高，考慮時(shí)間因素，綜合考慮最后選擇吸附體積流量為4BV/h，當(dāng)吸附體積流量為4BV/h時(shí)，可保證原薯蕷皂苷在樹脂上有較高的吸附率。

圖1 上柱吸附體積流量對(duì)吸附率的影響Fig.1 Effect of column adsorption volume flow on adsorption rate

2.2.2 樹脂藥材質(zhì)量比的確定 樹脂藥材比是影響原薯蕷皂苷轉(zhuǎn)移率的重要因素，樹脂藥材質(zhì)量比值過小，會(huì)引起藥量超載，使藥物泄漏流失。樹脂藥材質(zhì)量比值過大，能充分吸附原薯蕷皂甙，但卻沒有充分利用樹脂的吸附能力，實(shí)際實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖2。圖2表明，樹脂藥材質(zhì)量比在16∶1～4∶1時(shí)，吸附率均較高，考慮到樹脂藥材質(zhì)量比越小，上柱時(shí)間越長(zhǎng)，增加成本，為減少上柱時(shí)間，綜合考慮確定樹脂藥材質(zhì)量比為8∶1。

2.2.3 樹脂柱徑高比的確定 通過實(shí)驗(yàn)得出樹脂徑高比對(duì)吸附率影響的實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖3，可以看出樹脂的徑高比對(duì)吸附率亦有較大影響，在樹脂柱直徑一定的條件下，樹脂高度越高，柱效越高，在一定的上樣量的情況下，隨柱長(zhǎng)的增加，吸附率增加，柱分離次數(shù)增加，太低則柱效過低，吸附路徑過短，則會(huì)容易造成泄漏。從圖3可看出，樹脂柱徑高比在1∶9～1∶15時(shí)，原薯蕷皂苷的吸附率均較高，從工業(yè)化生產(chǎn)的成本考慮，樹脂徑高比確定為1∶12較為妥當(dāng)。

圖2 樹脂藥材質(zhì)量比對(duì)吸附率的影響Fig.2 Effect of the mass ratio between resin and herbs on adsorption rate

圖3 樹脂徑高比對(duì)吸附率的影響Fig.3 Effect of the ratio between diameter and height on adsorption rate

2.3 動(dòng)態(tài)解吸條件的確定

2.3.1 洗脫劑體系的確定 通過不同洗脫劑對(duì)原薯蕷皂苷的解吸率的實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖4，由圖4可看出，采用乙醇、甲醇-水、乙醇-水、丙酮體系對(duì)原薯蕷皂苷均有比較好的洗脫效果。其中丙酮、70%甲醇和70%乙醇的洗脫效果更好，但考慮到丙酮的的成本和其揮發(fā)性，還有甲醇的毒性，實(shí)際工作的安全、成本等問題，最后確定以70%乙醇-水作為洗脫劑體系。

圖4 洗脫劑體系對(duì)解吸率的影響Fig.4 The influence of eluent system on desorption rate

2.3.2 洗脫劑用量的確定 洗脫劑用量也是影響解吸率的重要因素，洗脫劑用量少，不能充分把原薯蕷皂苷洗脫下來，反之洗脫劑用量太多，會(huì)使工業(yè)生產(chǎn)成本增大。洗脫劑用量對(duì)解吸率的影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖5，從圖5可以看出，當(dāng)洗脫劑用量為3、4、5BV時(shí)，都可基本將提取液中原薯蕷皂苷洗脫干凈，綜合考慮時(shí)間和成本，選擇3BV的洗脫劑作為到達(dá)終點(diǎn)時(shí)洗脫劑的用量。

圖5 洗脫劑用量對(duì)解吸率的影響Fig.5 Effct of dosage of eluenton on desorption rate

2.3.3 洗脫劑濃度的確定 乙醇溶液濃度對(duì)解吸率的影響結(jié)果見圖6，圖6表明隨著洗脫劑中乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大，原薯蕷皂苷的解吸率逐漸增大，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)大于70%時(shí)具有較高的洗脫能力，但同時(shí)觀察到隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加，洗脫液顏色明顯變深，說明已將許多有色雜質(zhì)洗下，因此，在保證解吸率較高的條件下，應(yīng)選用較低體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶液，減少脂溶性雜質(zhì)，提高洗脫液中原薯蕷皂苷的純度。另外考慮到體積分?jǐn)?shù)太低，洗脫速度過慢，洗脫劑用量大，同時(shí)鑒于洗脫終點(diǎn)檢查的靈敏度，可能會(huì)造成洗脫不完全，因此，應(yīng)選擇一個(gè)適中的體積分?jǐn)?shù)，綜合考慮，選擇以70%乙醇作為洗脫劑較為妥當(dāng)。

圖6 乙醇溶液濃度對(duì)解吸率的影響Fig.6 Effct of ethanol solution concentration on desorption rate

2.3.4 洗脫劑體積流量的確定 洗脫劑體積流量的對(duì)解吸率影響的實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖7，由圖7表明，表明洗脫劑體積流量4～10BV/h轉(zhuǎn)移效果均較好，基本能將原薯蕷皂苷洗脫干凈。但同時(shí)考慮到洗脫劑流速過快會(huì)導(dǎo)致原薯蕷皂苷來不及解吸而造成損失，過慢會(huì)導(dǎo)致洗脫時(shí)間更長(zhǎng)，綜合考慮，原薯蕷皂苷的洗脫流速選擇在10BV/h。

圖7 洗脫劑體積流量對(duì)解吸率的影響Fig.7 Effct of eluent volume flow on desorption rate

3 結(jié)論與討論

原薯蕷皂苷在植物中的含量很低，文獻(xiàn)報(bào)道中提取分離的主要辦法是用有機(jī)溶劑提取后，再用硅膠柱和甲醇-氯仿作為洗脫劑，反復(fù)進(jìn)行層析分離得到原薯蕷皂苷[9-11]。大孔吸附樹脂用于原薯蕷皂苷的純化，國(guó)內(nèi)還未見有文獻(xiàn)報(bào)道，是一個(gè)值得研究的課題。

HP-20型大孔吸附樹脂是高多孔性苯乙烯型樹脂，具有很好的吸附和脫附性能，鄧潔紅等篩選出HP-20樹脂作為對(duì)刺葡萄皮色素的最佳樹脂[12]，龔志華等大孔吸附樹脂分離純化兒茶素EGCg，EGCg的純度和得率分別達(dá)68.32%和72.08%[13]。

本實(shí)驗(yàn)比較多種型號(hào)大孔吸附樹脂的靜態(tài)飽和吸附量和解吸率，篩選出最佳的大孔吸附樹脂是HP-20型，HP-20型大孔吸附樹脂純化原薯蕷皂苷的最佳工藝為：上柱吸附體積流量為4BV/h，樹脂藥材質(zhì)量比為8∶1，樹脂柱徑高比在1∶12，以70%乙醇-水體系作為洗脫劑，洗脫劑用量為3BV，洗脫劑流量為10BV/h。

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