少孢根霉發(fā)酵腐乳前酵條件優(yōu)化及發(fā)酵全程質(zhì)構(gòu)的研究

劉 威，曹蕾蕾，陳春雨，葉忠雪，王立群

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)微生物實驗室，黑龍江哈爾濱 150030）

腐乳是具有中國特色的大豆發(fā)酵食品[1]。在其發(fā)酵過程中，前酵為培菌過程，即菌種分泌蛋白酶、脂肪酶等酶系，以利于后酵各酶系的協(xié)同作用[2-3]。腐乳發(fā)酵全過程的一個顯著特征就是產(chǎn)生以蛋白酶為主的酶系，使其具有質(zhì)地細(xì)膩、風(fēng)味獨特、營養(yǎng)豐富、易消化吸收等特點[4]。

然而不同發(fā)酵菌種制得的腐乳質(zhì)地、風(fēng)味和營養(yǎng)等各不相同[5-7]。以少孢根霉為菌種發(fā)酵大豆而成的食品謂之丹貝，因其營養(yǎng)豐富，蛋白利用率高深受東南亞等國人民的青睞。尤其是該菌發(fā)酵的豆制品，使其中的異黃酮大量轉(zhuǎn)化為具有多種抗病、保健功效的生物活性成分——活性異黃酮[8-10]，而且符合現(xiàn)代人們養(yǎng)生保健的理念。劉欣等報道少孢根霉、雅致放射毛霉和五通橋毛霉三菌種發(fā)酵腐乳異黃酮的含量，以少孢根霉聚首[11]，說明該菌種發(fā)酵制得的腐乳營養(yǎng)品位上成；孫興民等對少孢根霉RT-3株發(fā)酵腐乳的前酵工藝、蛋白酶活力和氨基酸態(tài)氮的含量測定等進(jìn)行了報道[12]；本研究則以少孢根霉GIM3.381為菌種發(fā)酵腐乳，并以蛋白酶活力為該菌發(fā)酵代謝各指標(biāo)的表征指標(biāo)，對其發(fā)酵工藝的前酵給予探索、優(yōu)化；對發(fā)酵全程的質(zhì)構(gòu)特性、成熟期的主要參數(shù)亦予檢測。此為開發(fā)該菌發(fā)酵、且兼?zhèn)錉I養(yǎng)保健雙重功效的豆類制品奠定研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

少孢根霉GIM3.381 購于廣東省微生物研究所菌種保藏中心；新鮮北大荒老豆腐、黃酒、食鹽、紅曲米、面糕曲、馬鈴薯及糖精 市售；葡萄糖、氯化鈉、干酪素、氫氧化鈉、三氯乙酸、乳酸、碳酸鈉、硝酸銀、鉻酸鉀、甲醛、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、福林酚試劑、瓊脂 天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司，分析純。

TE124S型電子天平 北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；HWS24型電熱恒溫水浴鍋、GRX-9073A型空氣消毒箱、DHP-9162型電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海一恒科技有限公司；PB-10型pH計 北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；低速自動平衡離心機(jī) 北京醫(yī)用離心機(jī)廠；TGL-16G型臺式離心機(jī) 上海安享科學(xué)儀器廠；722型可見分光光度計 上海元析儀器有限公司；氣動恒溫?fù)u床 上海智誠分析儀器制造有限公司；TA-XT plus型質(zhì)構(gòu)分析儀 英國Stable Micro Systems公司；BCD-256DT型冰箱 青島海爾有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 前酵準(zhǔn)備

1.2.1.1 孢子懸液 少孢根霉在PDA平板上37℃培養(yǎng)3d；無菌水制成107cfu/mL的孢子懸浮液[13]，用于接種。

1.2.1.2 毛坯 豆腐→白坯→酸化→烘干（含水量68%～72%）[14]→接種→培養(yǎng)→毛坯。

1.2.2 前酵的單因素實驗

1.2.2.1 酸化pH的確定 白坯分別以pH1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0和4.5的乳酸酸化，以8%的孢子懸液接種，30℃培養(yǎng)60h。

1.2.2.2 接種量的確定 以上確定的pH，分別以6%、8%、10%、12%和14%的孢子懸液接種，30℃培養(yǎng)60h。

1.2.2.3 溫度的確定 以上確定的pH、接種量，分別以20、25、30、37℃培養(yǎng)60h。

1.2.2.4 時間的確定 以上確定的pH、接種量和溫度，分別以12、24、36、48、60h培養(yǎng)。

以上各實驗條件均采用福林酚法測定蛋白酶活力為表證指標(biāo)[15]，并有3次重復(fù)。

1.2.3 前酵的正交實驗 在單因素實驗的基礎(chǔ)上，根據(jù)正交實驗中心組合實驗設(shè)計原理，進(jìn)行L9（34）正交實驗設(shè)計，實驗條件見表1，以蛋白酶活力為表征指標(biāo)，3次重復(fù)，確定前酵最佳工藝條件。

表1 L9（34）正交實驗因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal experimental design

1.2.4 鹽坯的制備 毛坯搓毛，容器內(nèi)按層擺放，每層撒鹽，毛坯∶食鹽為5∶1，腌制得鹽坯。

1.2.5 后酵的制備

1.2.5.1 湯料 配料a：將1.5kg紅曲和0.6kg面糕曲用6.5kg黃酒浸泡2～3d，磨漿，加18kg黃酒攪勻，得染坯紅曲鹵。配料b：3kg紅曲和1.2kg面糕曲用12.5kg黃酒浸泡2～3d，磨漿，加63kg黃酒和15g糖精攪勻，得裝壇紅曲鹵。

1.2.5.2 裝壇 鹽坯用配料a.染色，裝入容器，加配料b.并密封，后酵成熟。

1.2.6 全程質(zhì)構(gòu)及成熟時主要指標(biāo)測定 質(zhì)構(gòu)：TPA下壓法[16]；水分：恒重法[17]；氯化鈉含量：硝酸銀滴定法[17]；氨基酸態(tài)氮含量：甲醛滴定法[18]。以上各實驗3次重復(fù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 前酵的單因素實驗

2.1.1 pH的確定 由圖1可知，隨酸化pH的升高，表征指標(biāo)先升后降。pH1.5～2.5時，攀升急劇，達(dá)最大值；而pH2.5到4.5時，逐漸下降?？梢妏H的高、低均影響菌種代謝及發(fā)酵腐乳的品質(zhì)。從表觀酸化pH指標(biāo)看，2.5時效果最佳，蛋白酶活力達(dá)23.69μg/mL。但此時腐乳白坯的實際pH應(yīng)是大于2.5的，這一點與孫興民等報道少孢根霉最適pH為3.0～4.5[14]相符。所以該菌在此最適pH時生長最旺，發(fā)酵效果最佳，同時，也說明該菌在有雜菌的發(fā)酵條件下具有競爭優(yōu)勢，因而適于生產(chǎn)實際。故確定前酵pH2.5。

圖1 pH與蛋白酶活力的對應(yīng)關(guān)系Fig.1 The corresponding relation of pH and proteinase activity

2.1.2 接種量的確定 由圖2可知，不同接種量時，表征指標(biāo)為先升后降。接種量6%至10%時，指標(biāo)逐漸升高，在10%時達(dá)最高值21.22μg/mL；接種量10%～14%時，指標(biāo)逐漸走低。6%～10%的接種量，指標(biāo)升高，是因為生物群體只有在一定的數(shù)量水平時代謝活力旺盛，才能表現(xiàn)出更適應(yīng)環(huán)境的能力，符合微生物典型生長曲線理論中的接種量要求達(dá)到“一定量”的概念；而接種量10%～14%時，指標(biāo)不升反降，原因應(yīng)是同種菌種間營養(yǎng)競爭所致。所以在實際生產(chǎn)中，不同接種量同樣能達(dá)到最佳效果時應(yīng)遵循接種量少的原則，故確定接種量為10%。

圖2 接種量與蛋白酶活力的對應(yīng)關(guān)系Fig.2 The corresponding relation of inoculation amount and proteinase activity

2.1.3 溫度的確定 各溫度的表征指標(biāo)圖3所示。由本室以往研究及相關(guān)報道[14，19]可知，少孢根霉屬于溫性真菌，最適溫度37℃，但本實驗數(shù)據(jù)卻以20℃為佳。分析認(rèn)為：在溫度較高或最適溫度時，菌株代謝快、代時短，菌種易老化。相反，生產(chǎn)實踐中的一些酶促反應(yīng)溫度往往在亞適溫度下、酶促反應(yīng)速率較緩時表現(xiàn)出最佳的發(fā)酵效果，即獲得性狀良好的產(chǎn)品。同時本實驗也再一次認(rèn)證了：在發(fā)酵實踐中，微生物最適生長溫度不一定是其產(chǎn)生代謝產(chǎn)物的最適溫度的理念。為此，所試菌株發(fā)酵腐乳的前酵溫度為20℃。

圖3 溫度與蛋白酶活力的對應(yīng)關(guān)系Fig.3 The corresponding relation of fermentation temperature and proteinase activity

2.1.4 前酵時間的確定 在優(yōu)化了pH、接種量、溫度三個條件后又對該菌的前酵時間進(jìn)行探測，結(jié)果由圖4可知，表征指標(biāo)先升后降。12～36h指標(biāo)緩慢上升，36～48h升高明顯，說明發(fā)酵菌群體代謝活躍，是發(fā)酵的鼎盛時期；48h時，最大值為22.06μg/mL。從外觀形狀上看，48h的菌絲潔白致密，性狀良好。然而，時間在48～60h，不但表征指標(biāo)下降，毛坯表面也出現(xiàn)黑色孢子，性狀不佳，并伴有不良?xì)馕?，對此認(rèn)為是酶系作用時間過長、分解過盛、坯體腐敗變質(zhì)所致。因此確定前酵時間48h。

圖4 時間與蛋白酶活力的對應(yīng)關(guān)系Fig.4 The corresponding relation of fermentation time and proteinase activity

2.2 正交實驗結(jié)果與分析

用L9（34）正交表安排實驗，實驗結(jié)果見表2，方差分析見表3。

根據(jù)表2極差R的大小得出：4個因素對蛋白酶活力影響為D＞B＞A＞C，即接種量＞時間＞溫度＞pH，由表3看出，因素接種量對蛋白酶活力影響顯著（p＜0.05），由表2可知，因素pH對蛋白酶活力影響較小，故表3中未列出。理論最佳發(fā)酵條件A1B2C2D2，即發(fā)酵溫度20℃，時間48h，pH2.5，接種量10%，蛋白酶活力為22.06μg/mL。

表2 L9（34）正交實驗結(jié)果與分析見表Table 2 The results and analysis of orthogonal experimental

表3 方差分析Table 3 Variance analysis of regression model

2.3 發(fā)酵過程中質(zhì)構(gòu)及成熟時主要指標(biāo)測定

2.3.1 硬度的變化 由圖5可知，腐乳發(fā)酵過程中，硬度先增后減。前酵階段，少孢根霉形成的菌絲將毛坯緊密包裹，硬度由白坯1199.9g升高至1203.6g；鹽制階段，食鹽進(jìn)入坯體，部分水分被析出，硬度增加顯著，鹽坯第7d時，硬度達(dá)到最大值為2535.5g；后酵階段中前40d，腐乳硬度迅速減小，40～60d變化不明顯，并在50d時變化趨于穩(wěn)定。后酵前40d的一段時間湯料不斷向坯體浸透，硬度迅速減?。坏?0d后坯體與湯料的鹽度接近，湯料向坯體滲透減少，故硬度變化不明顯，50d時硬度較白坯下降75.5%。

圖5 腐乳發(fā)酵過程中硬度的變化Fig.5 Hardness change during sufu processing

2.3.2 彈性的變化 由圖6可知，發(fā)酵過程中，彈性逐漸減小。前酵階段，少孢根霉菌絲將毛坯緊密包裹，使坯體結(jié)構(gòu)致密，故彈性變化幅度較小，僅由白坯時0.89降至0.86；鹽制階段，彈性減小但不明顯，主要由于食鹽的加入使坯體硬度增加，導(dǎo)致彈性略降；后酵階段前40d，由于酶系的作用使大分子物質(zhì)逐漸降解為小分子，坯體逐漸疏松，彈性逐漸減小，40～60d時，酶系作用基本完全，故彈性變化不明顯，并在50d時趨于穩(wěn)定，此時彈性較白坯下降42.2%。

圖6 腐乳發(fā)酵過程中彈性的變化Fig.6 Springiness change during sufu processing

2.3.3 黏著性的變化 由圖7可知，發(fā)酵過程中，黏著性逐漸升高。前酵階段，少孢根霉分泌的酶系將部分大分子物質(zhì)分解成小分子，黏著性緩慢上升，由白坯的161.7J升高到165.2J；鹽制至后酵階段，酶系作用持續(xù)進(jìn)行，腐乳中蛋白質(zhì)逐漸至完全發(fā)生降解，黏著性持續(xù)上升，至后酵50d時黏著性較白坯升高42.5%。

圖7 腐乳發(fā)酵過程中黏著性變化Fig.7 Adhesiveness change during sufu processing

腐乳在后酵50d時質(zhì)構(gòu)變化趨于穩(wěn)定，酒精味道消失，質(zhì)地細(xì)膩，推測腐乳已成熟，此時測其氨基酸態(tài)氮、水分和氯化鈉含量分別為1.76g/100g、66.1%和8.9g/100g。據(jù)余若黔等報道氨基酸態(tài)氮含量≥1.5%時腐乳即成熟[20]，并且根據(jù)國標(biāo)：成熟的紅方腐乳水分含量≤72%，氯化鈉含量≥6.5g/100g[15]，由以上可知，后酵50d達(dá)腐乳成熟標(biāo)準(zhǔn)。

腐乳發(fā)酵過程中：一方面以蛋白酶活力為表征指標(biāo)優(yōu)化出前酵最佳工藝，在后酵過程中以蛋白酶為主的酶系分解坯體中的蛋白質(zhì)、脂肪等化學(xué)物質(zhì)，從而使白坯向腐乳的轉(zhuǎn)變得以完成；另一方面從硬度、彈性較大的白坯到質(zhì)地細(xì)膩、入口無渣的腐乳，體現(xiàn)出發(fā)酵過程是理化性質(zhì)的變化引起質(zhì)構(gòu)的變化，而理化性質(zhì)的變化是以蛋白酶為主的酶系所決定的，可見整個實驗中各指標(biāo)間的變化相互影響、關(guān)系密切。

3 結(jié)論

3.1 少孢根霉GIM3.381發(fā)酵腐乳前酵最佳工藝：溫度20℃，時間48h，pH2.5，接種量10%，蛋白酶活力為22.10μg/mL。

3.2 腐乳發(fā)酵過程中，坯體的質(zhì)構(gòu)變化為：硬度先增后減、彈性逐漸降低、黏著性逐漸升高。

3.3 腐乳后酵50d成熟，此時硬度較白坯下降75.5%、彈性下降42.2%、黏著性升高42.5%；同時水分、氯化鈉和氨基酸態(tài)氮含量分別為66.1%、8.9g/100g和1.76g/100g。

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