靈芝多糖超聲波提取工藝條件的優(yōu)化

李鳳林+呂艷榮+宮敬利+齊俊生

摘要：為確定靈芝（Ganoderma lucidum）多糖超聲波提取最佳工藝條件，通過(guò)單因素試驗(yàn)與正交回歸組合設(shè)計(jì)對(duì)其進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明，靈芝多糖超聲波提取最佳工藝條件為料液比（g/mL）1∶35，超聲功率80 W，超聲溫度50 ℃，超聲時(shí)間35 min，此條件下靈芝多糖實(shí)際提取率為2.06%。

關(guān)鍵詞：靈芝（Ganoderma lucidum）多糖；超聲波提?。徽换貧w組合設(shè)計(jì)；工藝條件

中圖分類(lèi)號(hào)：R284.2 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2014）03-0640-04

靈芝（Ganoderma lucidum）為擔(dān)子菌綱多孔菌科靈芝屬真菌赤芝和紫芝的總稱(chēng)，以子實(shí)體為入藥部位，具有補(bǔ)氣安神、止咳平喘、扶正固本等功效，被《本經(jīng)》稱(chēng)為上品[1]。靈芝的藥用成分非常豐富，已分離得到的有效成分有數(shù)十種之多，其中多糖是靈芝中主要的生理活性物質(zhì)之一，近年來(lái)引起國(guó)內(nèi)外科研工作者極大的關(guān)注?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，靈芝多糖具有抗衰老、抗輻射、抗腫瘤、調(diào)節(jié)心律失常、鎮(zhèn)靜中樞神經(jīng)、鎮(zhèn)痛、強(qiáng)心、擴(kuò)張冠狀動(dòng)脈、降低心肌缺血量、改善心肌微循環(huán)、降血糖、降血壓、抑菌、提高免疫力、促進(jìn)白細(xì)胞再生、保護(hù)肝細(xì)胞等多種生物活性[2-5]。多糖傳統(tǒng)的萃取方法是水提法，存在著費(fèi)時(shí)、耗能高、提取率低等缺點(diǎn)。超聲波提取法是一種有效的新型提取方法，其空化作用能有效破碎細(xì)胞壁或者包埋結(jié)構(gòu)的外層，改變物質(zhì)擴(kuò)散，釋放內(nèi)容物，從而提高提取率。目前，超聲波技術(shù)已在植物多糖提取中被廣泛應(yīng)用，但目前鮮見(jiàn)關(guān)于超聲波提取靈芝多糖的報(bào)道。本研究的目的是驗(yàn)證超聲波法在靈芝多糖提取中應(yīng)用的可行性，力求尋找出一種高效的提取方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料 靈芝子實(shí)體采于吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院與吉林市匯豐科技開(kāi)發(fā)有限責(zé)任公司合作基地（吉林市豐滿(mǎn)區(qū)江南鄉(xiāng)），為目前已培育定型的新品種（吉農(nóng)匯特1號(hào)）。靈芝子實(shí)體切片后，用中藥粉碎機(jī)粉碎，過(guò)40目篩備用。無(wú)水葡萄糖（分析純）購(gòu)于中國(guó)藥品生物制品檢定所；苯酚、濃硫酸、硝基水楊酸、乙醇等均為分析純，由吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院食品理化實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 儀器與設(shè)備 KQ-100DB型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）， UV-1750型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（島津公司），RE-5299型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠），SHB-III型循環(huán)水式多用真空泵（鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司），YF型中藥粉碎機(jī)（江陰市偉翔藥化機(jī)械廠），DHG-9140A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司），KDC-1044型低速離心機(jī)（科大創(chuàng)新股份有限公司中佳分公司）。

1.2 方法

1.2.1 靈芝多糖超聲波提取方法 稱(chēng)取5.0 g靈芝子實(shí)體細(xì)粉，置于一定比例水中浸泡1 h，然后放在超聲頻率固定為40 kHz的超聲波清洗器中，分別按照不同的萃取條件（不同的超聲功率、溫度及時(shí)間）提取，離心，留取上清液，并減壓濃縮至30 mL，用Sevag法脫蛋白后加入2倍量的無(wú)水乙醇沉淀多糖，過(guò)夜，離心，得沉淀物，依次用無(wú)水乙醇、丙酮、乙醚反復(fù)洗滌沉淀，干燥后稱(chēng)重，即得靈芝粗多糖。

1.2.2 靈芝多糖提取率的測(cè)定 多糖含量的測(cè)定采用苯酚-硫酸法。以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)品，480 nm波長(zhǎng)下測(cè)定其吸光度，以葡萄糖溶液濃度（C，mg/mL）作橫坐標(biāo)，以吸光度（A）作縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。用最小二乘法進(jìn)行線性回歸，得葡萄糖溶液濃度與吸光度關(guān)系曲線的回歸方程：A=7.025C-0.004 9。R2=0.998 8，說(shuō)明葡萄糖在規(guī)定范圍內(nèi)與吸光度呈良好的線性關(guān)系。

稱(chēng)取靈芝粗多糖干品2.0 mg， 用去離子水定容于50 mL容量瓶中，然后精確吸取樣品溶液1.0 mL， 加入5%的苯酚溶液1.6 mL 及濃硫酸7.0 mL， 充分搖勻， 室溫放置25 min 后于480 nm 測(cè)其吸光度。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線及回歸方程計(jì)算即得其多糖含量。靈芝多糖提取率（K）按下式計(jì)算：

式中，m為靈芝多糖質(zhì)量（mg）；M為靈芝子實(shí)體細(xì)粉質(zhì)量（mg）。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

針對(duì)影響靈芝多糖超聲波提取效果的料液比、超聲功率、超聲溫度及超聲時(shí)間等條件，分別做單因素試驗(yàn)，然后采用正交回歸組合設(shè)計(jì)（表1）試驗(yàn)優(yōu)化靈芝多糖超波聲提取工藝條件。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用DPS 3.01處理軟件對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 料液比對(duì)靈芝多糖提取率的影響

稱(chēng)取5.0 g靈芝子實(shí)體細(xì)粉，分別按料液比（g/mL，下同）1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50加入水浸泡1 h，然后在超聲功率70 W，超聲溫度50 ℃，超聲時(shí)間30 min條件下提取靈芝多糖，其結(jié)果見(jiàn)圖1。由圖1可見(jiàn)，隨著溶劑比例的加大，靈芝多糖提取率逐漸上升，但當(dāng)溶劑的比例超過(guò)30之后，靈芝多糖的提取率趨于平穩(wěn)。分析其原因可能是由于在料液比達(dá)到1∶30時(shí)，多糖已大部分被提取出來(lái)。從能耗角度考慮，料液比選擇1∶30較為適宜。

2.2 超聲功率對(duì)靈芝多糖提取率的影響

稱(chēng)取5.0 g靈芝子實(shí)體細(xì)粉，按料液比1∶30浸泡1 h，分別設(shè)定超聲功率為50、60、70、80、90 W，在超聲溫度50 ℃，超聲時(shí)間30 min條件下提取靈芝多糖，其結(jié)果見(jiàn)圖2。由圖2可見(jiàn)，隨著超聲功率的加大，靈芝多糖提取率逐漸上升，但超聲功率超過(guò)80 W之后提取率反而下降。分析其原因可能是由于較高的超聲功率加快多糖糖苷鍵的斷裂而導(dǎo)致其降解，所以超聲功率選擇80 W左右較為適宜。

2.3 超聲溫度對(duì)靈芝多糖提取率的影響

稱(chēng)取5.0 g靈芝子實(shí)體細(xì)粉，按料液比1∶30浸泡1 h，分別設(shè)定超聲溫度30、40、50、60、70 ℃，在超聲功率70 W，超聲時(shí)間30 min條件下提取靈芝多糖，其結(jié)果見(jiàn)圖3。由圖3可見(jiàn)，隨著超聲溫度的升高，靈芝多糖提取率逐漸上升，但超聲溫度超過(guò)50 ℃之后提取率反而逐漸下降。分析其原因可能是由于較高的超聲溫度與超聲波機(jī)械的協(xié)同作用下能使多糖的某些結(jié)構(gòu)被破壞而降低了其提取率，所以超聲溫度選擇50 ℃左右較為適宜。

2.4 超聲時(shí)間對(duì)靈芝多糖提取率的影響

稱(chēng)取5.0 g靈芝子實(shí)體細(xì)粉，按料液比1∶30浸泡1 h，分別設(shè)定超聲時(shí)間10、20、30、40、50 min，在超聲功率70 W，超聲溫度50 ℃情況下提取靈芝多糖，其結(jié)果見(jiàn)圖4。由圖4可見(jiàn)，隨著超聲時(shí)間的延長(zhǎng)，靈芝多糖提取率逐漸上升，但超聲時(shí)間超過(guò)30 min之后提取率反而逐漸下降。分析其原因可能是由于前期超聲波對(duì)細(xì)胞壁的破壞，細(xì)胞內(nèi)部的多糖物質(zhì)向外擴(kuò)散，從而釋放更多的多糖；后期由于處理時(shí)間的延長(zhǎng)，超聲波本身對(duì)多糖有降解作用，其結(jié)構(gòu)被破壞，所以超聲時(shí)間選擇30 min左右較為適宜。

2.5 正交回歸組合設(shè)計(jì)試驗(yàn)結(jié)果

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，以多糖提取率為指標(biāo)，采用正交回歸組合設(shè)計(jì)優(yōu)化靈芝多糖超聲波提取工藝，其結(jié)果見(jiàn)表2。對(duì)結(jié)果的方差分析見(jiàn)表3。由表2結(jié)果可計(jì)算出擬合方程的各項(xiàng)系數(shù)，從而得到回歸方程：y=2.062 86+0.078 33 x1-0.040 00 x2+0.011 67 x3+0.087 50 x4-0.067 80 x12-0.072 80 x22-0.070 30 x32-0.061 55 x42+0.006 25 x1x2-0.008 75 x1x3+0.003 75 x1x4-0.028 75 x2x3-0.016 25 x2x4-0.006 25 x3x4。由表3可見(jiàn)，F(xiàn)2=16.166>F0.05（14，16）=2.35，說(shuō)明回歸顯著，方程擬合良好；F1=3.884

以下是α=0.10顯著水平剔除不顯著項(xiàng)后，簡(jiǎn)化后的回歸方程：y=2.062 86+0.078 33 x1-0.040 00 x2+0.087 50 x4-0.067 80 x12-0.072 80 x22-0.070 30 x32-0.061 55 x42-0.028 75 x2x3-0.016 25 x2x4。最高值的各個(gè)因素組合x(chóng)1為1水平，x2為0水平，x3為0水平，x4為1水平，ymax=2.10，即優(yōu)化靈芝多糖超聲波提取工藝條件為料液比1∶35，超聲功率80 W，超聲溫度50 ℃，超聲時(shí)間35 min，此條件下靈芝多糖理論提取率為2.10%，用此條件重新進(jìn)行驗(yàn)證，得靈芝多糖實(shí)際提取率為2.06%，與理論值較接近，進(jìn)一步驗(yàn)證了本試驗(yàn)結(jié)果擬合得出的回歸方程可以較好地應(yīng)用于靈芝多糖的提取。

3 小結(jié)

1）在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，運(yùn)用正交回歸組合設(shè)計(jì)的理論與方法，通過(guò)DPS 3.01處理軟件分析確定靈芝多糖超聲波提取的最佳工藝條件為：料液比1∶35，超聲功率80 W，超聲溫度50 ℃，超聲時(shí)間35 min，此條件下靈芝多糖實(shí)際提取率為2.06%，與理論值較為接近，說(shuō)明此回歸模型是可靠的。

2）采用超聲波輔助提取靈芝多糖具有時(shí)間短、溫度低、提取率高、工藝簡(jiǎn)單等特點(diǎn)，該工藝可為靈芝多糖的工業(yè)化生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

參考文獻(xiàn)：

[1] 趙東旭，楊新林，王幫武，等.靈芝研究的若干進(jìn)展[J]. 食用菌學(xué)報(bào)，1999，6（3）：59-64.

[2] ZHANG G L， WANG Y H， NI W， et al. Hepatoprotective role of ganoderma lucidum polysaccharide against BCG-induced immune liver injury in mice[J]. World J Gastroenterol，2002，8（4）：728-733.

[3] 白 丹，常迺滔，李大海，等.靈芝多糖抑菌活性初探[J].華北農(nóng)學(xué)報(bào)，2008（S1）：282-285.

[4] 毛 健，馬海樂(lè).靈芝多糖的研究進(jìn)展[J].食品科學(xué)，2010，31（1）：295-298.

[5] LI F L， ZHANG Y M， ZHONG Z J. Antihyperglycemic effect of Ganoderma lucidum polysaccharides on streptozotocin-induced diabetic mice[J]. International Journal of Molecular Sciences，2011，12（9）：6135-6145.

2.4 超聲時(shí)間對(duì)靈芝多糖提取率的影響

稱(chēng)取5.0 g靈芝子實(shí)體細(xì)粉，按料液比1∶30浸泡1 h，分別設(shè)定超聲時(shí)間10、20、30、40、50 min，在超聲功率70 W，超聲溫度50 ℃情況下提取靈芝多糖，其結(jié)果見(jiàn)圖4。由圖4可見(jiàn)，隨著超聲時(shí)間的延長(zhǎng)，靈芝多糖提取率逐漸上升，但超聲時(shí)間超過(guò)30 min之后提取率反而逐漸下降。分析其原因可能是由于前期超聲波對(duì)細(xì)胞壁的破壞，細(xì)胞內(nèi)部的多糖物質(zhì)向外擴(kuò)散，從而釋放更多的多糖；后期由于處理時(shí)間的延長(zhǎng)，超聲波本身對(duì)多糖有降解作用，其結(jié)構(gòu)被破壞，所以超聲時(shí)間選擇30 min左右較為適宜。

2.5 正交回歸組合設(shè)計(jì)試驗(yàn)結(jié)果

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，以多糖提取率為指標(biāo)，采用正交回歸組合設(shè)計(jì)優(yōu)化靈芝多糖超聲波提取工藝，其結(jié)果見(jiàn)表2。對(duì)結(jié)果的方差分析見(jiàn)表3。由表2結(jié)果可計(jì)算出擬合方程的各項(xiàng)系數(shù)，從而得到回歸方程：y=2.062 86+0.078 33 x1-0.040 00 x2+0.011 67 x3+0.087 50 x4-0.067 80 x12-0.072 80 x22-0.070 30 x32-0.061 55 x42+0.006 25 x1x2-0.008 75 x1x3+0.003 75 x1x4-0.028 75 x2x3-0.016 25 x2x4-0.006 25 x3x4。由表3可見(jiàn)，F(xiàn)2=16.166>F0.05（14，16）=2.35，說(shuō)明回歸顯著，方程擬合良好；F1=3.884

以下是α=0.10顯著水平剔除不顯著項(xiàng)后，簡(jiǎn)化后的回歸方程：y=2.062 86+0.078 33 x1-0.040 00 x2+0.087 50 x4-0.067 80 x12-0.072 80 x22-0.070 30 x32-0.061 55 x42-0.028 75 x2x3-0.016 25 x2x4。最高值的各個(gè)因素組合x(chóng)1為1水平，x2為0水平，x3為0水平，x4為1水平，ymax=2.10，即優(yōu)化靈芝多糖超聲波提取工藝條件為料液比1∶35，超聲功率80 W，超聲溫度50 ℃，超聲時(shí)間35 min，此條件下靈芝多糖理論提取率為2.10%，用此條件重新進(jìn)行驗(yàn)證，得靈芝多糖實(shí)際提取率為2.06%，與理論值較接近，進(jìn)一步驗(yàn)證了本試驗(yàn)結(jié)果擬合得出的回歸方程可以較好地應(yīng)用于靈芝多糖的提取。

3 小結(jié)

1）在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，運(yùn)用正交回歸組合設(shè)計(jì)的理論與方法，通過(guò)DPS 3.01處理軟件分析確定靈芝多糖超聲波提取的最佳工藝條件為：料液比1∶35，超聲功率80 W，超聲溫度50 ℃，超聲時(shí)間35 min，此條件下靈芝多糖實(shí)際提取率為2.06%，與理論值較為接近，說(shuō)明此回歸模型是可靠的。

2）采用超聲波輔助提取靈芝多糖具有時(shí)間短、溫度低、提取率高、工藝簡(jiǎn)單等特點(diǎn)，該工藝可為靈芝多糖的工業(yè)化生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

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2.4 超聲時(shí)間對(duì)靈芝多糖提取率的影響

稱(chēng)取5.0 g靈芝子實(shí)體細(xì)粉，按料液比1∶30浸泡1 h，分別設(shè)定超聲時(shí)間10、20、30、40、50 min，在超聲功率70 W，超聲溫度50 ℃情況下提取靈芝多糖，其結(jié)果見(jiàn)圖4。由圖4可見(jiàn)，隨著超聲時(shí)間的延長(zhǎng)，靈芝多糖提取率逐漸上升，但超聲時(shí)間超過(guò)30 min之后提取率反而逐漸下降。分析其原因可能是由于前期超聲波對(duì)細(xì)胞壁的破壞，細(xì)胞內(nèi)部的多糖物質(zhì)向外擴(kuò)散，從而釋放更多的多糖；后期由于處理時(shí)間的延長(zhǎng)，超聲波本身對(duì)多糖有降解作用，其結(jié)構(gòu)被破壞，所以超聲時(shí)間選擇30 min左右較為適宜。

2.5 正交回歸組合設(shè)計(jì)試驗(yàn)結(jié)果

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，以多糖提取率為指標(biāo)，采用正交回歸組合設(shè)計(jì)優(yōu)化靈芝多糖超聲波提取工藝，其結(jié)果見(jiàn)表2。對(duì)結(jié)果的方差分析見(jiàn)表3。由表2結(jié)果可計(jì)算出擬合方程的各項(xiàng)系數(shù)，從而得到回歸方程：y=2.062 86+0.078 33 x1-0.040 00 x2+0.011 67 x3+0.087 50 x4-0.067 80 x12-0.072 80 x22-0.070 30 x32-0.061 55 x42+0.006 25 x1x2-0.008 75 x1x3+0.003 75 x1x4-0.028 75 x2x3-0.016 25 x2x4-0.006 25 x3x4。由表3可見(jiàn)，F(xiàn)2=16.166>F0.05（14，16）=2.35，說(shuō)明回歸顯著，方程擬合良好；F1=3.884

以下是α=0.10顯著水平剔除不顯著項(xiàng)后，簡(jiǎn)化后的回歸方程：y=2.062 86+0.078 33 x1-0.040 00 x2+0.087 50 x4-0.067 80 x12-0.072 80 x22-0.070 30 x32-0.061 55 x42-0.028 75 x2x3-0.016 25 x2x4。最高值的各個(gè)因素組合x(chóng)1為1水平，x2為0水平，x3為0水平，x4為1水平，ymax=2.10，即優(yōu)化靈芝多糖超聲波提取工藝條件為料液比1∶35，超聲功率80 W，超聲溫度50 ℃，超聲時(shí)間35 min，此條件下靈芝多糖理論提取率為2.10%，用此條件重新進(jìn)行驗(yàn)證，得靈芝多糖實(shí)際提取率為2.06%，與理論值較接近，進(jìn)一步驗(yàn)證了本試驗(yàn)結(jié)果擬合得出的回歸方程可以較好地應(yīng)用于靈芝多糖的提取。

3 小結(jié)

1）在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，運(yùn)用正交回歸組合設(shè)計(jì)的理論與方法，通過(guò)DPS 3.01處理軟件分析確定靈芝多糖超聲波提取的最佳工藝條件為：料液比1∶35，超聲功率80 W，超聲溫度50 ℃，超聲時(shí)間35 min，此條件下靈芝多糖實(shí)際提取率為2.06%，與理論值較為接近，說(shuō)明此回歸模型是可靠的。

2）采用超聲波輔助提取靈芝多糖具有時(shí)間短、溫度低、提取率高、工藝簡(jiǎn)單等特點(diǎn)，該工藝可為靈芝多糖的工業(yè)化生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

參考文獻(xiàn)：

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