蟾毒靈鎮(zhèn)痛作用及其作用機(jī)制探討

楊 光，楊 宇，張玉杰，曾憲陽(yáng)

蟾毒靈鎮(zhèn)痛作用及其作用機(jī)制探討

楊 光，楊 宇，張玉杰，曾憲陽(yáng)

目的 研究蟾毒靈的鎮(zhèn)痛作用及其作用機(jī)制，為其臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。方法 通過(guò)醋酸誘發(fā)小鼠扭體反應(yīng)實(shí)驗(yàn)和小鼠熱板實(shí)驗(yàn)，研究蟾毒靈的鎮(zhèn)痛作用，通過(guò)Griess法和免疫印跡法研究RAW264.7細(xì)胞中NO含量和MAPK/p38/iNOS通路的變化。結(jié)果 蟾毒靈(0.5 mg/kg、1.0 mg/kg)可以劑量依賴性地減少醋酸所致的小鼠扭體數(shù)(P<0.05)，并可顯著提高熱板所致疼痛小鼠痛閾值(P<0.05)。體外研究表明蟾毒靈(0.04 μM, 0.08 μM)可顯著降低脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞的NO含量升高(P<0.05)，并可以抑制RAW264.7細(xì)胞的MAPK/p38/iNOS信號(hào)通路的激活。結(jié)論 蟾毒靈具有一定的鎮(zhèn)痛作用，其鎮(zhèn)痛機(jī)制可能與抑制MAPK/p38/iNOS通路，繼而減少NO的合成和釋放有關(guān)。

蟾毒靈；鎮(zhèn)痛；一氧化氮；MAPK通路

蟾酥為蟾蜍科動(dòng)物中華大蟾蜍(Bufo bufo gargarizans Cantor)和黑眶蟾蜍(Bufo melanost ictus Schneider)耳后腺的分泌物[1]。其性味甘辛、溫，有毒，具有解毒、消腫、醒神、開竅、強(qiáng)心和止痛等作用[2]。近年來(lái)對(duì)蟾酥及有效成分的研究表明，蟾毒靈(Bufalin)是發(fā)揮藥效的主要成分之一[3,4]。本研究針對(duì)蟾毒靈的鎮(zhèn)痛作用進(jìn)行研究，并初步探討了其可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 儀器與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 受試藥與動(dòng)物分組 YLS-6B 智能熱板儀(山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院設(shè)備站)；多功能酶標(biāo)儀(美國(guó)Biotek公司)。蟾毒靈(美國(guó)Sigma公司)；吲哚美辛腸溶片(江蘇亞邦愛普森藥業(yè)有限公司)。L-硝基精氨酸甲酯( L-NAME)，購(gòu)自美國(guó) Sigma 公司；NO試劑盒，購(gòu)自南京建成生物工程研究所。RAW264.7細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)。p38、phosphorate-p38、iNOS、β-actin抗體購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling公司。昆明種小白鼠40只(體重18～20 g，購(gòu)自于中國(guó)醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)，隨機(jī)分為4組，每組10只，分別為空白對(duì)照組(給予相同體積的生理鹽水)，陽(yáng)性對(duì)照吲哚美辛組(10 mg/kg，灌胃給藥)，蟾毒靈各劑量組(0.5 mg/kg、1.0 mg/kg，腹腔注射)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 小鼠醋酸扭體法 4組小鼠給藥后1 h腹腔注射0.7%醋酸溶液0.2 ml/只。觀察并記錄15 min內(nèi)出現(xiàn)扭體反應(yīng)的次數(shù)，計(jì)算扭體抑制率。

扭體抑制率(%)=(空白對(duì)照組扭體均數(shù)-給藥組扭體均數(shù))/空白對(duì)照組扭體均數(shù)×100%[5]。

1.2.2 小鼠熱板法 將小鼠置于55 ℃的熱板上，以放置于熱板上至出現(xiàn)小鼠舔后足所需的時(shí)間(s)為該鼠的正常痛閾值。選擇正常痛閾值在5～30 s內(nèi)的小鼠(喜跳躍的小鼠認(rèn)為不合格)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。給藥前首先重復(fù)測(cè)定小鼠的正常痛閾值，取2次正常痛閾值的平均值為該小鼠的給藥前痛閾值，然后分別腹腔注射給藥，于給藥后30、60、90、120、150 min再測(cè)小鼠的痛閾值，若小鼠60 s內(nèi)仍沒有出現(xiàn)舔后足的現(xiàn)象，則立即將小鼠取出，痛閾值按60 s計(jì)，并按照公式計(jì)算其痛閾提高百分率：

痛閾提高率(%)=(給藥后平均痛閾值-給藥前平均痛閾值)/給藥前平均痛閾值×100%[5]

1.2.3 NO的檢測(cè) RAW264.7細(xì)胞按2×105/孔接種于96孔板中，每孔100 μl，貼壁4 h后，加入蟾毒靈(0.04 μM，0.08 μM)，正常對(duì)照孔或模型對(duì)照孔加入等體積的培養(yǎng)液，孵育2 h，再加入50 μl終濃度為10 μg/L的脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)刺激(正常對(duì)照孔加入等體積培養(yǎng)液)24 h，Griess法測(cè)定上清中NO的含量，用以反映NO水平。L-NAME(終濃度為200 μM)作為陽(yáng)性對(duì)照藥物。

1.2.4 免疫印跡 實(shí)驗(yàn)分4組：對(duì)照組、LPS組、蟾毒靈(0.04、0.08 μM)+ LPS組, 蟾毒靈預(yù)先加入RAW264.7細(xì)胞作用2 h，加入LPS 10μg/L作用24 h，棄去上清，磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered solution ，PBS)洗滌2次，加入預(yù)冷的細(xì)胞裂解液，然后提取蛋白。蛋白定量后取20 μg蛋白質(zhì)進(jìn)行10%SDS-PAGE，轉(zhuǎn)PVDF膜后，用脫脂奶粉室溫封閉60 min，加入一抗過(guò)夜，然后二抗37 ℃孵育1 h。加入化學(xué)發(fā)光試劑(electrochemiluminescence， ECL)顯色液，置于凝膠成像儀中觀察并分析結(jié)果，CCD自動(dòng)獲取圖像，同時(shí)小鼠β-actin作為內(nèi)參照[6]。

方差分析判斷總體顯著性差異，組間資料采用LSD 或Games-Howell檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 扭體反應(yīng)結(jié)果 蟾毒靈(0.5、1.0 mg/kg)給藥1 h后，可以劑量依賴性地減少醋酸所致的小鼠扭體數(shù)(P<0.05)，其中低劑量組的抑制率為30.8%，高劑量組的抑制率可達(dá)到48.0%。高劑量的鎮(zhèn)痛作用與陽(yáng)性藥吲哚美辛(抑制率為51.4%)基本相當(dāng)(表 1)。

表1 蟾毒靈對(duì)實(shí)驗(yàn)小鼠扭體反應(yīng)的影響 ±s)

注：與對(duì)照組相比,①P<0.05

2.2 熱板實(shí)驗(yàn)結(jié)果 蟾毒靈(0.5、 1.0 mg/kg)給藥后30 min可以提高小鼠的痛閾值(P<0.05)，痛閾值提高百分率分別為38.3%和50%。90 min時(shí)達(dá)到峰值，痛閾值提高百分率分別為82.8%和117.7%。鎮(zhèn)痛效果持續(xù)到給藥后120 min，痛閾值提高百分率分別為46.4%和83.3%(表2)。與陽(yáng)性藥吲哚美辛比，其強(qiáng)度稍弱，但作用維持時(shí)間長(zhǎng)。結(jié)果提示，蟾毒靈對(duì)熱板所致疼痛鎮(zhèn)痛作用強(qiáng)。

表2 蟾毒靈給藥前、后不同時(shí)間對(duì)實(shí)驗(yàn)小鼠痛閾值的影響 ±s)

注：與對(duì)照組比較,①P<0.05

2.3 蟾毒靈對(duì)巨噬細(xì)胞RAW264.7細(xì)胞NO釋放的影響 在10 μg/L的LPS刺激下，RAW264.7細(xì)胞釋放NO的量增加,與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，表明LPS能明顯誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞釋放NO，而蟾毒靈對(duì)激活狀態(tài)RAW264.7細(xì)胞NO釋放有抑制作用，并呈良好的劑量依賴關(guān)系(表3)。

表3 蟾毒靈對(duì)RAW264.7細(xì)胞一氧化氮(NO)釋放的影響 ；μM)

注：與對(duì)照組比較①P<0.05; 與LPS組比較,②P<0.05

2.4 對(duì)巨噬細(xì)胞RAW264.7細(xì)胞MAPK/p38/iNOS通路的影響 在10 μg/L的LPS刺激下，RAW264.7細(xì)胞p38磷酸化增加，iNOS表達(dá)上調(diào)，表明LPS能激活RAW264.7細(xì)胞MAPK/p38/iNOS通路，加入蟾毒靈后可以劑量依賴性的抑制p38激活，并下調(diào)iNOS的表達(dá)水平。蟾毒靈對(duì)激活MAPK/p38/iNOS通路有抑制作用，并呈劑量依賴關(guān)系(圖1)。

圖1 蟾毒靈對(duì)RAW264.7細(xì)胞MAPK/p38/iNOS

3 討 論

蟾毒靈是從蟾酥中分離得到的活性較高的單體成分，近年來(lái)報(bào)道顯示其具有顯著的抗腫瘤活性作用[2,3]。有報(bào)道蟾毒靈能夠顯著抑制醋酸引起的小鼠扭體次數(shù)，還可明顯延長(zhǎng)熱刺激所致小鼠痛覺反應(yīng)時(shí)間，這說(shuō)明蟾毒靈具有一定的鎮(zhèn)痛作用[4]。然而，目前對(duì)其鎮(zhèn)痛機(jī)制至今還不是很清楚。

醋酸扭體法和熱板法是兩個(gè)經(jīng)典的評(píng)價(jià)鎮(zhèn)痛藥效果的實(shí)驗(yàn)方法。本研究采用兩種方法，對(duì)不同劑量的蟾毒靈進(jìn)行了鎮(zhèn)痛藥效評(píng)價(jià)，以期進(jìn)一步證明蟾毒靈的鎮(zhèn)痛藥理效果。醋酸扭體實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，蟾毒靈給藥后，可以劑量依賴性的減少醋酸所致的小鼠扭體數(shù)，高劑量的鎮(zhèn)痛作用與陽(yáng)性藥吲哚美辛基本相當(dāng)。熱板實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，蟾毒靈給藥后短時(shí)間內(nèi)即可提高小鼠的痛閾值，鎮(zhèn)痛效果持續(xù)到給藥后120 min，與陽(yáng)性藥吲哚美辛比其強(qiáng)度稍弱，但作用維持時(shí)間長(zhǎng)。本研究結(jié)果提示蟾毒靈具有良好的鎮(zhèn)痛作用，且具有作用維持時(shí)間長(zhǎng)的藥理特點(diǎn)。

NO是一種重要的信息傳遞物質(zhì)和神經(jīng)遞質(zhì)，近年來(lái)的研究表明NO參與痛覺調(diào)制，并可促進(jìn)疼痛傳入和致痛介質(zhì)的釋放，同時(shí)還可以促進(jìn)脊髓痛覺過(guò)敏形成和腦內(nèi)痛覺信息的加工[7-9]。本研究結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，蟾毒靈可以劑量依賴性的抑制LPS誘導(dǎo)的NO釋放，這就提示蟾毒靈可能通過(guò)抑制NO的釋放，達(dá)到抑制疼痛傳入和致痛介質(zhì)的釋放過(guò)程，繼而減輕疼痛癥狀。MAPK/p38信號(hào)通路是細(xì)胞內(nèi)重要的信號(hào)通路，除了參與細(xì)胞的增殖、分化外，還參與炎性遞質(zhì)的釋放，而細(xì)胞內(nèi)負(fù)責(zé)合成NO的誘導(dǎo)性一氧化氮合酶(iNOS)就是其重要的靶基因[10,11]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，炎性介導(dǎo)物質(zhì)LPS可以誘導(dǎo)MAPK/p38信號(hào)通路激活，繼而促進(jìn)iNOS表達(dá)增加。而蟾毒靈可以劑量依賴性的抑制LPS誘導(dǎo)的p38磷酸化及iNOS的表達(dá)，這說(shuō)明抑制MAPK/p38通路可能是蟾毒靈減輕疼痛作用的上游靶點(diǎn)。

綜上所述，可以發(fā)現(xiàn)蟾毒靈對(duì)兩種不同的致痛方法誘發(fā)的疼痛均有較強(qiáng)的鎮(zhèn)痛作用，表明其鎮(zhèn)痛機(jī)制是多方面的，可能與抑制MAPK/p38/iNOS通路，繼而抑制NO釋放相關(guān)，但其確切的鎮(zhèn)痛機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

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(2013-10-11收稿 2013-12-20修回)

(責(zé)任編輯 郭 青)

A study on analgesic effect of bufalin and its underlying mechanisms

YANG Guang，YANG Yu，ZHANG Yujie, and ZENG Xianyang.

Department of Anesthesiology ,Liaoning Provincial Corps Hospital of Chinese People’s Armed Police Forces. Shenyang 110034, China

Objective To investigate the analgesic effect of bufalin and its underlying mechanisms. Methods The analgesic effect of bufalin was studied by the acetic acid-induced writhing response and hot plate test. The contents of NO and the activation of MAPK/p38/iNOS pathway in LPS-induced RAW264.3 were measured by Griess assay and Western blotting, respectively. Results Bufalin (0.5， 1.0 mg/kg) showed a significant inhibition of acetic acid-induced writhing response and prolonging of licking time in hot plate test at a dose-dependent manner (P<0.05). Bufalin (0.04, 0.08 μM) significantly reduced the contents of NO and inhibited the activation of MAPK/p38/iNOS in RAW264.7 cells. Conclusions The analgesic of bufalin is related to suppressing the activation of MAPK/p38/iNOS pathway and subsequently reducing the synthesis and releases of excessive NO.

bufalin；analgesia；NO；MAPK pathway

楊 光，本科學(xué)歷，主任醫(yī)師，E-mail: 2000volare@sina.com

110034沈陽(yáng)，武警遼寧總隊(duì)醫(yī)院麻醉科

楊 宇，E-mail: 2000volare@sina.com

R971.1