食品微生物的檢測(cè)能力驗(yàn)證

舒鵑娟等

能力驗(yàn)證（proficiency testing）即利用實(shí)驗(yàn)室間比對(duì)，按照預(yù)先制定的準(zhǔn)則評(píng)價(jià)參加者的能力。通過(guò)能力驗(yàn)證能夠評(píng)定實(shí)驗(yàn)室從事特定檢測(cè)或測(cè)量的能力，識(shí)別實(shí)驗(yàn)室存在的問(wèn)題并啟動(dòng)改進(jìn)措施，提高實(shí)驗(yàn)室的檢測(cè)能力等。因此，參加能力驗(yàn)證活動(dòng)對(duì)實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制有著非常重要的意義。上海市閘北區(qū)疾病預(yù)防控制中心實(shí)驗(yàn)室已連續(xù)多年參加遼寧出入境檢驗(yàn)檢疫局食品微生物能力驗(yàn)證計(jì)劃，現(xiàn)將從中收獲的一些經(jīng)驗(yàn)教訓(xùn)介紹如下，供同行參考。

1.2.2操作步驟

① 按照PTC-T028參試指導(dǎo)書(shū)的要求進(jìn)行樣品水化。從冰箱取出待測(cè)樣品，待其恢復(fù)至室溫后，無(wú)菌開(kāi)啟裝有樣品的西林瓶，立即加入4 mL生理鹽水進(jìn)行再水化，稀釋液合計(jì)40 mL，待溶解后，吸出放入無(wú)菌瓶中，反復(fù)用余下的稀釋液清洗西林瓶?jī)?nèi)壁，回收清洗液放入上述無(wú)菌瓶中，此溶液即是待測(cè)樣品原液，全過(guò)程20 min內(nèi)完成。將上述制備的40 mL待測(cè)原液按照標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行后續(xù)操作。

② 菌落總數(shù)檢測(cè)。取經(jīng)水化制備的待測(cè)原液25 mL，加入225 mL滅菌生理鹽水混勻，制成10-1稀釋液，取10-1稀釋液1 mL加9 mL滅菌生理鹽水混勻，制成10-2稀釋液，以此類(lèi)推稀釋至10-4。每稀釋1次，換1次無(wú)菌吸管。每個(gè)稀釋度樣液各取1 mL加入到2個(gè)無(wú)菌平皿中，同時(shí)做空白對(duì)照。及時(shí)用15 mL冷卻至45℃左右的平板計(jì)數(shù)瓊脂傾注平皿，搖勻，待培養(yǎng)基凝固后倒置放入培養(yǎng)箱中，36℃培養(yǎng)48 h后進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。

③ 大腸菌群檢測(cè)。采用最可能數(shù)（most probable number，MPN）法進(jìn)行大腸菌群計(jì)數(shù)。將經(jīng)水化的待測(cè)樣品按照菌落總數(shù)檢測(cè)的方法制備10-1～10-6的稀釋液。每個(gè)稀釋度接種3管LST肉湯，每管接種1 mL，36℃培養(yǎng)48 h后，產(chǎn)氣者進(jìn)行復(fù)發(fā)酵試驗(yàn)，接種BGLB肉湯管36℃培養(yǎng)48 h后產(chǎn)氣者計(jì)為大腸菌群陽(yáng)性，記錄每個(gè)稀釋度的BGLB產(chǎn)氣管數(shù)。

④ 金葡菌檢測(cè)。取經(jīng)水化制備的待測(cè)原液25 mL，加入225 mL 7.5%NaC1肉湯制成混懸液，于36℃培養(yǎng)20 h，轉(zhuǎn)種血平板和Baird-Parker平板，于36℃培養(yǎng)24 h，挑取可疑菌落進(jìn)行鑒定。

⑤ 沙門(mén)菌檢測(cè)。取經(jīng)水化制備的待測(cè)原液25 mL，加入225 mL BPW制成混懸液，于36℃培養(yǎng)18 h后，分別取1 mL轉(zhuǎn)種TTB 10 mL及SC 10 mL， TTB置42℃培養(yǎng)24 h，SC置36℃培養(yǎng)24 h，分別轉(zhuǎn)種BS平板內(nèi)于36℃培養(yǎng)48 h及沙門(mén)菌屬顯色平板，于36℃培養(yǎng)24 h，挑取可疑菌落進(jìn)行鑒定。

⑥ 單增檢測(cè)。取經(jīng)水化制備的待測(cè)原液25 mL，加入225 mL LB1制成混懸液，于30℃培養(yǎng)24 h后，吸取0.1 mL轉(zhuǎn)種于10 mL LB2中，置30℃培養(yǎng)24 h，轉(zhuǎn)種于PALCAM平板和李斯特菌顯色平板，36℃培養(yǎng)48 h，挑取可疑菌落進(jìn)行鑒定。

⑦ 志賀菌檢測(cè)。取經(jīng)水化制備的待測(cè)原液25 mL，加入225 mL志賀菌增菌液制成混懸液，于41.5℃厭氧培養(yǎng)20 h后轉(zhuǎn)種XLD及MAC平板，于36℃培養(yǎng)24 h，挑取可疑菌落進(jìn)行鑒定。

⑧ 副溶血性弧菌檢測(cè)。取經(jīng)水化制備的待測(cè)原液25 mL，加入225 mL APW制成混懸液，于36℃培養(yǎng)16 h，轉(zhuǎn)種TCBS及弧菌顯色平板，于36℃培養(yǎng)24 h，挑取可疑菌落進(jìn)行鑒定。

3討論

本實(shí)驗(yàn)室參加的7項(xiàng)能力驗(yàn)證試驗(yàn)反饋結(jié)果均為滿(mǎn)意（《食品中微生物學(xué)能力驗(yàn)證計(jì)劃PTC-T028結(jié)果報(bào)告》），表明本實(shí)驗(yàn)室能很好地應(yīng)用國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)（GB 4789，現(xiàn)行有效系列）開(kāi)展相關(guān)項(xiàng)目的檢測(cè)。本次能力驗(yàn)證的定量項(xiàng)目中，菌落總數(shù)和大腸菌群的滿(mǎn)意率分別為90.5%和89.7%；定性項(xiàng)目中金葡菌滿(mǎn)意率最高，78個(gè)結(jié)果反饋僅1個(gè)為不滿(mǎn)意，滿(mǎn)意率為98.7%；副溶血性弧菌滿(mǎn)意率最低，56個(gè)結(jié)果反饋中，49個(gè)為滿(mǎn)意，滿(mǎn)意率為87.5%。此外，組織方將每一個(gè)項(xiàng)目分成不同組別，本實(shí)驗(yàn)室副溶血性弧菌項(xiàng)目被分配到指定值為陽(yáng)性組，有26個(gè)結(jié)果反饋，只有20個(gè)為滿(mǎn)意，滿(mǎn)意率為76.9%。

在參加能力驗(yàn)證活動(dòng)時(shí)，需要注意以下幾方面：

實(shí)驗(yàn)前要仔細(xì)閱讀參試指導(dǎo)書(shū)，按照其要求對(duì)樣品進(jìn)行前處理。對(duì)于定量項(xiàng)目來(lái)說(shuō)，西林瓶中的樣品是一個(gè)不可分割的整體，應(yīng)全部溶解用于檢測(cè)，不能只取一部分進(jìn)行檢測(cè)而造成結(jié)果不準(zhǔn)確。樣品打開(kāi)后應(yīng)立即水化，否則會(huì)導(dǎo)致樣品吸潮溶解困難，影響準(zhǔn)確計(jì)數(shù)。在樣品稀釋過(guò)程中要充分混勻，以免影響計(jì)數(shù)結(jié)果的準(zhǔn)確性。采用傾注法對(duì)樣品計(jì)數(shù)的項(xiàng)目，在傾注培養(yǎng)基后應(yīng)搖動(dòng)平板以保證細(xì)菌均勻分布，以免造成蔓延生長(zhǎng)影響計(jì)數(shù)結(jié)果。由于MPN法是基于泊松分布的一種間接計(jì)數(shù)方法，其計(jì)數(shù)原理是將待測(cè)樣品作一系列稀釋?zhuān)恢毕♂尩綄⑸倭康南♂屢航臃N到新鮮培養(yǎng)基中沒(méi)有或極少出現(xiàn)細(xì)菌生長(zhǎng)繁殖，然后根據(jù)沒(méi)有生長(zhǎng)的最低稀釋度與出現(xiàn)生長(zhǎng)的最高稀釋度，采用“最可能數(shù)”理論，查MPN表計(jì)算得出樣品單位體積中細(xì)菌數(shù)的近似值。所以采用MPN法對(duì)樣品計(jì)數(shù)的項(xiàng)目在操作時(shí)應(yīng)稀釋足夠的倍數(shù)，以達(dá)到出現(xiàn)生長(zhǎng)的最高稀釋度，并謹(jǐn)慎選擇計(jì)數(shù)的稀釋度，即選擇的3個(gè)稀釋度既要包括所有重復(fù)都有菌液生長(zhǎng)的最高稀釋度，又要包括出現(xiàn)生長(zhǎng)的最高稀釋度，否則會(huì)影響MPN法的計(jì)數(shù)結(jié)果。

對(duì)于定性項(xiàng)目來(lái)說(shuō)，保證培養(yǎng)基的質(zhì)量，選擇適合的培養(yǎng)基，檢測(cè)人員的操作水平和經(jīng)驗(yàn)判斷都非常重要。每批次培養(yǎng)基應(yīng)做好質(zhì)控，并在有效期內(nèi)使用。在首次分離培養(yǎng)時(shí)，建議使用弱選擇性培養(yǎng)基，這是因?yàn)槔鋬龈稍镞^(guò)程可能造成細(xì)胞內(nèi)核酸的損傷而誘導(dǎo)突變體的產(chǎn)生，可能導(dǎo)致目標(biāo)菌在強(qiáng)選擇性培養(yǎng)基上也無(wú)法生長(zhǎng)。建議使用顯色培養(yǎng)基，更方便有效地將目標(biāo)菌和雜菌區(qū)分開(kāi)來(lái)。在劃線分離時(shí)，要盡可能多的分出單個(gè)菌落。能準(zhǔn)確識(shí)別選擇性平板上的可疑菌落，進(jìn)行后續(xù)鑒定時(shí)，應(yīng)挑取盡可能多的可疑菌落，以免因挑取的菌落數(shù)量太少?zèng)]有取到目標(biāo)菌而造成假陰性。認(rèn)真完成所有的鑒別試驗(yàn)再做出判斷，以免因判斷依據(jù)不足而影響檢測(cè)結(jié)果。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，應(yīng)設(shè)置陰、陽(yáng)性對(duì)照，避免假陰性或假陽(yáng)性結(jié)果出現(xiàn)而影響結(jié)果判斷。

綜上所述，能力驗(yàn)證是證明實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)能力的一種科學(xué)有效的技術(shù)手段，是對(duì)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)能力和管理狀況進(jìn)行考核的客觀方法，是實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制的重要手段，對(duì)實(shí)驗(yàn)室資質(zhì)認(rèn)定工作有效性的后續(xù)監(jiān)督有著非常重要的作用。實(shí)驗(yàn)室能力驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，與實(shí)驗(yàn)室的工作技術(shù)水平直接相關(guān)。參加能力驗(yàn)證計(jì)劃獲得滿(mǎn)意結(jié)果，能增強(qiáng)客戶(hù)及相關(guān)方對(duì)實(shí)驗(yàn)室出具可靠數(shù)據(jù)的信心。通過(guò)能力驗(yàn)證活動(dòng)，實(shí)驗(yàn)室能了解自身不足，有利于督促其加強(qiáng)自身能力建設(shè)，提高實(shí)驗(yàn)室人員檢測(cè)技術(shù)水平，增加檢測(cè)結(jié)果的正確性和可靠性。

4參考文獻(xiàn)

[1]中國(guó)合格評(píng)定國(guó)家認(rèn)可委員會(huì).能力驗(yàn)證規(guī)則＼[S＼].2010.

[2]食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn)大腸菌群計(jì)數(shù). GB 4789.3—2010＼[S＼].

[3]McCrady MH.The numerical interpretation of fermentation- tube results＼[J＼].Infect Dis，1915，17：183-212.

[4]孫慧，李天添.大腸菌群MPN計(jì)數(shù)法與CFU計(jì)數(shù)法相關(guān)性初探＼[J＼].釀酒，2012，39（3）：93-94.

[5]黃瑤，崔邦炳，黃翠姬，等.利用真空冷凍干燥法保藏幾種常見(jiàn)細(xì)菌的研究＼[J＼].廣西工學(xué)院學(xué)報(bào)，2006，17（2）：20-22.

能力驗(yàn)證（proficiency testing）即利用實(shí)驗(yàn)室間比對(duì)，按照預(yù)先制定的準(zhǔn)則評(píng)價(jià)參加者的能力。通過(guò)能力驗(yàn)證能夠評(píng)定實(shí)驗(yàn)室從事特定檢測(cè)或測(cè)量的能力，識(shí)別實(shí)驗(yàn)室存在的問(wèn)題并啟動(dòng)改進(jìn)措施，提高實(shí)驗(yàn)室的檢測(cè)能力等。因此，參加能力驗(yàn)證活動(dòng)對(duì)實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制有著非常重要的意義。上海市閘北區(qū)疾病預(yù)防控制中心實(shí)驗(yàn)室已連續(xù)多年參加遼寧出入境檢驗(yàn)檢疫局食品微生物能力驗(yàn)證計(jì)劃，現(xiàn)將從中收獲的一些經(jīng)驗(yàn)教訓(xùn)介紹如下，供同行參考。

1.2.2操作步驟

① 按照PTC-T028參試指導(dǎo)書(shū)的要求進(jìn)行樣品水化。從冰箱取出待測(cè)樣品，待其恢復(fù)至室溫后，無(wú)菌開(kāi)啟裝有樣品的西林瓶，立即加入4 mL生理鹽水進(jìn)行再水化，稀釋液合計(jì)40 mL，待溶解后，吸出放入無(wú)菌瓶中，反復(fù)用余下的稀釋液清洗西林瓶?jī)?nèi)壁，回收清洗液放入上述無(wú)菌瓶中，此溶液即是待測(cè)樣品原液，全過(guò)程20 min內(nèi)完成。將上述制備的40 mL待測(cè)原液按照標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行后續(xù)操作。

② 菌落總數(shù)檢測(cè)。取經(jīng)水化制備的待測(cè)原液25 mL，加入225 mL滅菌生理鹽水混勻，制成10-1稀釋液，取10-1稀釋液1 mL加9 mL滅菌生理鹽水混勻，制成10-2稀釋液，以此類(lèi)推稀釋至10-4。每稀釋1次，換1次無(wú)菌吸管。每個(gè)稀釋度樣液各取1 mL加入到2個(gè)無(wú)菌平皿中，同時(shí)做空白對(duì)照。及時(shí)用15 mL冷卻至45℃左右的平板計(jì)數(shù)瓊脂傾注平皿，搖勻，待培養(yǎng)基凝固后倒置放入培養(yǎng)箱中，36℃培養(yǎng)48 h后進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。

③ 大腸菌群檢測(cè)。采用最可能數(shù)（most probable number，MPN）法進(jìn)行大腸菌群計(jì)數(shù)。將經(jīng)水化的待測(cè)樣品按照菌落總數(shù)檢測(cè)的方法制備10-1～10-6的稀釋液。每個(gè)稀釋度接種3管LST肉湯，每管接種1 mL，36℃培養(yǎng)48 h后，產(chǎn)氣者進(jìn)行復(fù)發(fā)酵試驗(yàn)，接種BGLB肉湯管36℃培養(yǎng)48 h后產(chǎn)氣者計(jì)為大腸菌群陽(yáng)性，記錄每個(gè)稀釋度的BGLB產(chǎn)氣管數(shù)。

④ 金葡菌檢測(cè)。取經(jīng)水化制備的待測(cè)原液25 mL，加入225 mL 7.5%NaC1肉湯制成混懸液，于36℃培養(yǎng)20 h，轉(zhuǎn)種血平板和Baird-Parker平板，于36℃培養(yǎng)24 h，挑取可疑菌落進(jìn)行鑒定。

⑤ 沙門(mén)菌檢測(cè)。取經(jīng)水化制備的待測(cè)原液25 mL，加入225 mL BPW制成混懸液，于36℃培養(yǎng)18 h后，分別取1 mL轉(zhuǎn)種TTB 10 mL及SC 10 mL， TTB置42℃培養(yǎng)24 h，SC置36℃培養(yǎng)24 h，分別轉(zhuǎn)種BS平板內(nèi)于36℃培養(yǎng)48 h及沙門(mén)菌屬顯色平板，于36℃培養(yǎng)24 h，挑取可疑菌落進(jìn)行鑒定。

⑥ 單增檢測(cè)。取經(jīng)水化制備的待測(cè)原液25 mL，加入225 mL LB1制成混懸液，于30℃培養(yǎng)24 h后，吸取0.1 mL轉(zhuǎn)種于10 mL LB2中，置30℃培養(yǎng)24 h，轉(zhuǎn)種于PALCAM平板和李斯特菌顯色平板，36℃培養(yǎng)48 h，挑取可疑菌落進(jìn)行鑒定。

⑦ 志賀菌檢測(cè)。取經(jīng)水化制備的待測(cè)原液25 mL，加入225 mL志賀菌增菌液制成混懸液，于41.5℃厭氧培養(yǎng)20 h后轉(zhuǎn)種XLD及MAC平板，于36℃培養(yǎng)24 h，挑取可疑菌落進(jìn)行鑒定。

⑧ 副溶血性弧菌檢測(cè)。取經(jīng)水化制備的待測(cè)原液25 mL，加入225 mL APW制成混懸液，于36℃培養(yǎng)16 h，轉(zhuǎn)種TCBS及弧菌顯色平板，于36℃培養(yǎng)24 h，挑取可疑菌落進(jìn)行鑒定。

3討論

本實(shí)驗(yàn)室參加的7項(xiàng)能力驗(yàn)證試驗(yàn)反饋結(jié)果均為滿(mǎn)意（《食品中微生物學(xué)能力驗(yàn)證計(jì)劃PTC-T028結(jié)果報(bào)告》），表明本實(shí)驗(yàn)室能很好地應(yīng)用國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)（GB 4789，現(xiàn)行有效系列）開(kāi)展相關(guān)項(xiàng)目的檢測(cè)。本次能力驗(yàn)證的定量項(xiàng)目中，菌落總數(shù)和大腸菌群的滿(mǎn)意率分別為90.5%和89.7%；定性項(xiàng)目中金葡菌滿(mǎn)意率最高，78個(gè)結(jié)果反饋僅1個(gè)為不滿(mǎn)意，滿(mǎn)意率為98.7%；副溶血性弧菌滿(mǎn)意率最低，56個(gè)結(jié)果反饋中，49個(gè)為滿(mǎn)意，滿(mǎn)意率為87.5%。此外，組織方將每一個(gè)項(xiàng)目分成不同組別，本實(shí)驗(yàn)室副溶血性弧菌項(xiàng)目被分配到指定值為陽(yáng)性組，有26個(gè)結(jié)果反饋，只有20個(gè)為滿(mǎn)意，滿(mǎn)意率為76.9%。

在參加能力驗(yàn)證活動(dòng)時(shí)，需要注意以下幾方面：

實(shí)驗(yàn)前要仔細(xì)閱讀參試指導(dǎo)書(shū)，按照其要求對(duì)樣品進(jìn)行前處理。對(duì)于定量項(xiàng)目來(lái)說(shuō)，西林瓶中的樣品是一個(gè)不可分割的整體，應(yīng)全部溶解用于檢測(cè)，不能只取一部分進(jìn)行檢測(cè)而造成結(jié)果不準(zhǔn)確。樣品打開(kāi)后應(yīng)立即水化，否則會(huì)導(dǎo)致樣品吸潮溶解困難，影響準(zhǔn)確計(jì)數(shù)。在樣品稀釋過(guò)程中要充分混勻，以免影響計(jì)數(shù)結(jié)果的準(zhǔn)確性。采用傾注法對(duì)樣品計(jì)數(shù)的項(xiàng)目，在傾注培養(yǎng)基后應(yīng)搖動(dòng)平板以保證細(xì)菌均勻分布，以免造成蔓延生長(zhǎng)影響計(jì)數(shù)結(jié)果。由于MPN法是基于泊松分布的一種間接計(jì)數(shù)方法，其計(jì)數(shù)原理是將待測(cè)樣品作一系列稀釋?zhuān)恢毕♂尩綄⑸倭康南♂屢航臃N到新鮮培養(yǎng)基中沒(méi)有或極少出現(xiàn)細(xì)菌生長(zhǎng)繁殖，然后根據(jù)沒(méi)有生長(zhǎng)的最低稀釋度與出現(xiàn)生長(zhǎng)的最高稀釋度，采用“最可能數(shù)”理論，查MPN表計(jì)算得出樣品單位體積中細(xì)菌數(shù)的近似值。所以采用MPN法對(duì)樣品計(jì)數(shù)的項(xiàng)目在操作時(shí)應(yīng)稀釋足夠的倍數(shù)，以達(dá)到出現(xiàn)生長(zhǎng)的最高稀釋度，并謹(jǐn)慎選擇計(jì)數(shù)的稀釋度，即選擇的3個(gè)稀釋度既要包括所有重復(fù)都有菌液生長(zhǎng)的最高稀釋度，又要包括出現(xiàn)生長(zhǎng)的最高稀釋度，否則會(huì)影響MPN法的計(jì)數(shù)結(jié)果。

對(duì)于定性項(xiàng)目來(lái)說(shuō)，保證培養(yǎng)基的質(zhì)量，選擇適合的培養(yǎng)基，檢測(cè)人員的操作水平和經(jīng)驗(yàn)判斷都非常重要。每批次培養(yǎng)基應(yīng)做好質(zhì)控，并在有效期內(nèi)使用。在首次分離培養(yǎng)時(shí)，建議使用弱選擇性培養(yǎng)基，這是因?yàn)槔鋬龈稍镞^(guò)程可能造成細(xì)胞內(nèi)核酸的損傷而誘導(dǎo)突變體的產(chǎn)生，可能導(dǎo)致目標(biāo)菌在強(qiáng)選擇性培養(yǎng)基上也無(wú)法生長(zhǎng)。建議使用顯色培養(yǎng)基，更方便有效地將目標(biāo)菌和雜菌區(qū)分開(kāi)來(lái)。在劃線分離時(shí)，要盡可能多的分出單個(gè)菌落。能準(zhǔn)確識(shí)別選擇性平板上的可疑菌落，進(jìn)行后續(xù)鑒定時(shí)，應(yīng)挑取盡可能多的可疑菌落，以免因挑取的菌落數(shù)量太少?zèng)]有取到目標(biāo)菌而造成假陰性。認(rèn)真完成所有的鑒別試驗(yàn)再做出判斷，以免因判斷依據(jù)不足而影響檢測(cè)結(jié)果。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，應(yīng)設(shè)置陰、陽(yáng)性對(duì)照，避免假陰性或假陽(yáng)性結(jié)果出現(xiàn)而影響結(jié)果判斷。

綜上所述，能力驗(yàn)證是證明實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)能力的一種科學(xué)有效的技術(shù)手段，是對(duì)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)能力和管理狀況進(jìn)行考核的客觀方法，是實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制的重要手段，對(duì)實(shí)驗(yàn)室資質(zhì)認(rèn)定工作有效性的后續(xù)監(jiān)督有著非常重要的作用。實(shí)驗(yàn)室能力驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，與實(shí)驗(yàn)室的工作技術(shù)水平直接相關(guān)。參加能力驗(yàn)證計(jì)劃獲得滿(mǎn)意結(jié)果，能增強(qiáng)客戶(hù)及相關(guān)方對(duì)實(shí)驗(yàn)室出具可靠數(shù)據(jù)的信心。通過(guò)能力驗(yàn)證活動(dòng)，實(shí)驗(yàn)室能了解自身不足，有利于督促其加強(qiáng)自身能力建設(shè)，提高實(shí)驗(yàn)室人員檢測(cè)技術(shù)水平，增加檢測(cè)結(jié)果的正確性和可靠性。

4參考文獻(xiàn)

[1]中國(guó)合格評(píng)定國(guó)家認(rèn)可委員會(huì).能力驗(yàn)證規(guī)則＼[S＼].2010.

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能力驗(yàn)證（proficiency testing）即利用實(shí)驗(yàn)室間比對(duì)，按照預(yù)先制定的準(zhǔn)則評(píng)價(jià)參加者的能力。通過(guò)能力驗(yàn)證能夠評(píng)定實(shí)驗(yàn)室從事特定檢測(cè)或測(cè)量的能力，識(shí)別實(shí)驗(yàn)室存在的問(wèn)題并啟動(dòng)改進(jìn)措施，提高實(shí)驗(yàn)室的檢測(cè)能力等。因此，參加能力驗(yàn)證活動(dòng)對(duì)實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制有著非常重要的意義。上海市閘北區(qū)疾病預(yù)防控制中心實(shí)驗(yàn)室已連續(xù)多年參加遼寧出入境檢驗(yàn)檢疫局食品微生物能力驗(yàn)證計(jì)劃，現(xiàn)將從中收獲的一些經(jīng)驗(yàn)教訓(xùn)介紹如下，供同行參考。

1.2.2操作步驟

① 按照PTC-T028參試指導(dǎo)書(shū)的要求進(jìn)行樣品水化。從冰箱取出待測(cè)樣品，待其恢復(fù)至室溫后，無(wú)菌開(kāi)啟裝有樣品的西林瓶，立即加入4 mL生理鹽水進(jìn)行再水化，稀釋液合計(jì)40 mL，待溶解后，吸出放入無(wú)菌瓶中，反復(fù)用余下的稀釋液清洗西林瓶?jī)?nèi)壁，回收清洗液放入上述無(wú)菌瓶中，此溶液即是待測(cè)樣品原液，全過(guò)程20 min內(nèi)完成。將上述制備的40 mL待測(cè)原液按照標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行后續(xù)操作。

② 菌落總數(shù)檢測(cè)。取經(jīng)水化制備的待測(cè)原液25 mL，加入225 mL滅菌生理鹽水混勻，制成10-1稀釋液，取10-1稀釋液1 mL加9 mL滅菌生理鹽水混勻，制成10-2稀釋液，以此類(lèi)推稀釋至10-4。每稀釋1次，換1次無(wú)菌吸管。每個(gè)稀釋度樣液各取1 mL加入到2個(gè)無(wú)菌平皿中，同時(shí)做空白對(duì)照。及時(shí)用15 mL冷卻至45℃左右的平板計(jì)數(shù)瓊脂傾注平皿，搖勻，待培養(yǎng)基凝固后倒置放入培養(yǎng)箱中，36℃培養(yǎng)48 h后進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。

③ 大腸菌群檢測(cè)。采用最可能數(shù)（most probable number，MPN）法進(jìn)行大腸菌群計(jì)數(shù)。將經(jīng)水化的待測(cè)樣品按照菌落總數(shù)檢測(cè)的方法制備10-1～10-6的稀釋液。每個(gè)稀釋度接種3管LST肉湯，每管接種1 mL，36℃培養(yǎng)48 h后，產(chǎn)氣者進(jìn)行復(fù)發(fā)酵試驗(yàn)，接種BGLB肉湯管36℃培養(yǎng)48 h后產(chǎn)氣者計(jì)為大腸菌群陽(yáng)性，記錄每個(gè)稀釋度的BGLB產(chǎn)氣管數(shù)。

④ 金葡菌檢測(cè)。取經(jīng)水化制備的待測(cè)原液25 mL，加入225 mL 7.5%NaC1肉湯制成混懸液，于36℃培養(yǎng)20 h，轉(zhuǎn)種血平板和Baird-Parker平板，于36℃培養(yǎng)24 h，挑取可疑菌落進(jìn)行鑒定。

⑤ 沙門(mén)菌檢測(cè)。取經(jīng)水化制備的待測(cè)原液25 mL，加入225 mL BPW制成混懸液，于36℃培養(yǎng)18 h后，分別取1 mL轉(zhuǎn)種TTB 10 mL及SC 10 mL， TTB置42℃培養(yǎng)24 h，SC置36℃培養(yǎng)24 h，分別轉(zhuǎn)種BS平板內(nèi)于36℃培養(yǎng)48 h及沙門(mén)菌屬顯色平板，于36℃培養(yǎng)24 h，挑取可疑菌落進(jìn)行鑒定。

⑥ 單增檢測(cè)。取經(jīng)水化制備的待測(cè)原液25 mL，加入225 mL LB1制成混懸液，于30℃培養(yǎng)24 h后，吸取0.1 mL轉(zhuǎn)種于10 mL LB2中，置30℃培養(yǎng)24 h，轉(zhuǎn)種于PALCAM平板和李斯特菌顯色平板，36℃培養(yǎng)48 h，挑取可疑菌落進(jìn)行鑒定。

⑦ 志賀菌檢測(cè)。取經(jīng)水化制備的待測(cè)原液25 mL，加入225 mL志賀菌增菌液制成混懸液，于41.5℃厭氧培養(yǎng)20 h后轉(zhuǎn)種XLD及MAC平板，于36℃培養(yǎng)24 h，挑取可疑菌落進(jìn)行鑒定。

⑧ 副溶血性弧菌檢測(cè)。取經(jīng)水化制備的待測(cè)原液25 mL，加入225 mL APW制成混懸液，于36℃培養(yǎng)16 h，轉(zhuǎn)種TCBS及弧菌顯色平板，于36℃培養(yǎng)24 h，挑取可疑菌落進(jìn)行鑒定。

3討論

本實(shí)驗(yàn)室參加的7項(xiàng)能力驗(yàn)證試驗(yàn)反饋結(jié)果均為滿(mǎn)意（《食品中微生物學(xué)能力驗(yàn)證計(jì)劃PTC-T028結(jié)果報(bào)告》），表明本實(shí)驗(yàn)室能很好地應(yīng)用國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)（GB 4789，現(xiàn)行有效系列）開(kāi)展相關(guān)項(xiàng)目的檢測(cè)。本次能力驗(yàn)證的定量項(xiàng)目中，菌落總數(shù)和大腸菌群的滿(mǎn)意率分別為90.5%和89.7%；定性項(xiàng)目中金葡菌滿(mǎn)意率最高，78個(gè)結(jié)果反饋僅1個(gè)為不滿(mǎn)意，滿(mǎn)意率為98.7%；副溶血性弧菌滿(mǎn)意率最低，56個(gè)結(jié)果反饋中，49個(gè)為滿(mǎn)意，滿(mǎn)意率為87.5%。此外，組織方將每一個(gè)項(xiàng)目分成不同組別，本實(shí)驗(yàn)室副溶血性弧菌項(xiàng)目被分配到指定值為陽(yáng)性組，有26個(gè)結(jié)果反饋，只有20個(gè)為滿(mǎn)意，滿(mǎn)意率為76.9%。

在參加能力驗(yàn)證活動(dòng)時(shí)，需要注意以下幾方面：

實(shí)驗(yàn)前要仔細(xì)閱讀參試指導(dǎo)書(shū)，按照其要求對(duì)樣品進(jìn)行前處理。對(duì)于定量項(xiàng)目來(lái)說(shuō)，西林瓶中的樣品是一個(gè)不可分割的整體，應(yīng)全部溶解用于檢測(cè)，不能只取一部分進(jìn)行檢測(cè)而造成結(jié)果不準(zhǔn)確。樣品打開(kāi)后應(yīng)立即水化，否則會(huì)導(dǎo)致樣品吸潮溶解困難，影響準(zhǔn)確計(jì)數(shù)。在樣品稀釋過(guò)程中要充分混勻，以免影響計(jì)數(shù)結(jié)果的準(zhǔn)確性。采用傾注法對(duì)樣品計(jì)數(shù)的項(xiàng)目，在傾注培養(yǎng)基后應(yīng)搖動(dòng)平板以保證細(xì)菌均勻分布，以免造成蔓延生長(zhǎng)影響計(jì)數(shù)結(jié)果。由于MPN法是基于泊松分布的一種間接計(jì)數(shù)方法，其計(jì)數(shù)原理是將待測(cè)樣品作一系列稀釋?zhuān)恢毕♂尩綄⑸倭康南♂屢航臃N到新鮮培養(yǎng)基中沒(méi)有或極少出現(xiàn)細(xì)菌生長(zhǎng)繁殖，然后根據(jù)沒(méi)有生長(zhǎng)的最低稀釋度與出現(xiàn)生長(zhǎng)的最高稀釋度，采用“最可能數(shù)”理論，查MPN表計(jì)算得出樣品單位體積中細(xì)菌數(shù)的近似值。所以采用MPN法對(duì)樣品計(jì)數(shù)的項(xiàng)目在操作時(shí)應(yīng)稀釋足夠的倍數(shù)，以達(dá)到出現(xiàn)生長(zhǎng)的最高稀釋度，并謹(jǐn)慎選擇計(jì)數(shù)的稀釋度，即選擇的3個(gè)稀釋度既要包括所有重復(fù)都有菌液生長(zhǎng)的最高稀釋度，又要包括出現(xiàn)生長(zhǎng)的最高稀釋度，否則會(huì)影響MPN法的計(jì)數(shù)結(jié)果。

對(duì)于定性項(xiàng)目來(lái)說(shuō)，保證培養(yǎng)基的質(zhì)量，選擇適合的培養(yǎng)基，檢測(cè)人員的操作水平和經(jīng)驗(yàn)判斷都非常重要。每批次培養(yǎng)基應(yīng)做好質(zhì)控，并在有效期內(nèi)使用。在首次分離培養(yǎng)時(shí)，建議使用弱選擇性培養(yǎng)基，這是因?yàn)槔鋬龈稍镞^(guò)程可能造成細(xì)胞內(nèi)核酸的損傷而誘導(dǎo)突變體的產(chǎn)生，可能導(dǎo)致目標(biāo)菌在強(qiáng)選擇性培養(yǎng)基上也無(wú)法生長(zhǎng)。建議使用顯色培養(yǎng)基，更方便有效地將目標(biāo)菌和雜菌區(qū)分開(kāi)來(lái)。在劃線分離時(shí)，要盡可能多的分出單個(gè)菌落。能準(zhǔn)確識(shí)別選擇性平板上的可疑菌落，進(jìn)行后續(xù)鑒定時(shí)，應(yīng)挑取盡可能多的可疑菌落，以免因挑取的菌落數(shù)量太少?zèng)]有取到目標(biāo)菌而造成假陰性。認(rèn)真完成所有的鑒別試驗(yàn)再做出判斷，以免因判斷依據(jù)不足而影響檢測(cè)結(jié)果。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，應(yīng)設(shè)置陰、陽(yáng)性對(duì)照，避免假陰性或假陽(yáng)性結(jié)果出現(xiàn)而影響結(jié)果判斷。

綜上所述，能力驗(yàn)證是證明實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)能力的一種科學(xué)有效的技術(shù)手段，是對(duì)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)能力和管理狀況進(jìn)行考核的客觀方法，是實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制的重要手段，對(duì)實(shí)驗(yàn)室資質(zhì)認(rèn)定工作有效性的后續(xù)監(jiān)督有著非常重要的作用。實(shí)驗(yàn)室能力驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，與實(shí)驗(yàn)室的工作技術(shù)水平直接相關(guān)。參加能力驗(yàn)證計(jì)劃獲得滿(mǎn)意結(jié)果，能增強(qiáng)客戶(hù)及相關(guān)方對(duì)實(shí)驗(yàn)室出具可靠數(shù)據(jù)的信心。通過(guò)能力驗(yàn)證活動(dòng)，實(shí)驗(yàn)室能了解自身不足，有利于督促其加強(qiáng)自身能力建設(shè)，提高實(shí)驗(yàn)室人員檢測(cè)技術(shù)水平，增加檢測(cè)結(jié)果的正確性和可靠性。

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