• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    4種含硫化合物對鏈霉菌B221固體發(fā)酵羽毛角蛋白過程的影響

    2014-07-18 03:24:00羅蕾史玉峰崔丹丹姜婻婻王玲王睿勇
    江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué) 2014年2期
    關(guān)鍵詞:亞硫酸鹽降解

    羅蕾 史玉峰 崔丹丹 姜婻婻 王玲 王睿勇

    摘要:利用自行分離得到的鏈霉菌B221固體發(fā)酵羽毛角蛋白,設(shè)置硫酸鈉、亞硫酸鈉、硫代硫酸鈉和二硫蘇糖醇4種含硫化合物添加組,分析發(fā)酵后7 d的發(fā)酵物中角蛋白酶活力、可溶性蛋白含量以及各種含硫化合物的消長變化規(guī)律。結(jié)果表明添加的4種含硫化合物對角蛋白酶都具有激活作用,但沒有顯著增加發(fā)酵產(chǎn)物中可溶性蛋白的含量;亞硫酸鹽含量、二硫鍵化合物含量和S-磺酸半胱氨酸類物質(zhì)含量之間存在著密切的相關(guān)性,B221固體發(fā)酵角蛋白過程中存在著亞硫酸鹽解作用;硫代硫酸鹽含量、二硫鍵化合物含量、S-磺酸半胱氨酸類物質(zhì)含量、巰基化合物含量之間存在著密切的相關(guān)性,B221固體發(fā)酵角蛋白過程中存在著另一種降解機(jī)制——硫代硫酸鹽解作用。

    關(guān)鍵詞:羽毛角蛋白;降解;含硫化合物;硫解;亞硫酸鹽;硫代硫酸鹽

    中圖分類號(hào): Q935文獻(xiàn)標(biāo)志碼: A文章編號(hào):1002-1302(2014)02-0310-04

    收稿日期:2013-12-16

    基金項(xiàng)目:國家自然科學(xué)基金(編號(hào):30571354);江蘇省科技支撐計(jì)劃(編號(hào):BE2008405)。

    作者簡介:羅蕾(1987—),女,湖南邵陽人,碩士研究生,從事應(yīng)用微生物學(xué)研究。Tel:(025) 83592685。

    通信作者:王睿勇。Tel:(025) 83592685;Email:wangry@nju.edu.cn。隨著全球家禽養(yǎng)殖業(yè)的快速發(fā)展,在家禽加工處理過程中產(chǎn)生了大量的羽毛廢棄物。據(jù)食品與農(nóng)業(yè)政策研究協(xié)會(huì)(FAPRI)預(yù)測:2019年全世界雞肉產(chǎn)量預(yù)計(jì)達(dá)到7 936萬t,屆時(shí)將產(chǎn)生近600萬t雞毛[1]。這些羽毛中,除了少量用于制備氨基酸、蛋白質(zhì)飼料以及羽絨制品外,絕大部分都被直接丟棄到環(huán)境中,造成了大量的資源浪費(fèi),同時(shí)造成了嚴(yán)重的環(huán)境污染[2]。

    羽毛的主要成分是β角蛋白,粗蛋白含量可達(dá)80%以上,半胱氨酸和胱氨酸含量更是為天然蛋白質(zhì)飼料之冠。角蛋白化學(xué)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定,不溶于水,也不能被胃蛋白酶、胰蛋白酶等水解[3]。傳統(tǒng)處理羽毛角蛋白的方法是利用物理、化學(xué)水解法,但存在能耗高、環(huán)境污染嚴(yán)重、三廢不易處理、某些必需氨基酸破壞嚴(yán)重、生產(chǎn)的羽毛粉消化率低等問題[4]。因此,利用生物技術(shù)途徑來解決角蛋白的分解利用近年來越來越受關(guān)注。

    1963年,Nickerson等從弗氏鏈霉菌中分離到一種酶復(fù)合物,并在發(fā)酵液中檢測到大量巰基化合物,由此推論角蛋白的降解主要是由菌絲表面附著的角蛋白酶直接斷裂二硫鍵進(jìn)行的,即酶降解途徑[5]。1989年Kunert在真菌石膏樣小孢子菌分解角蛋白的試驗(yàn)中,從發(fā)酵液中檢測到亞硫酸鹽、硫酸鹽、少量巰基化合物和S-磺酸半胱氨酸,結(jié)合相關(guān)試驗(yàn)證據(jù)認(rèn)為該降解過程首先是亞硫酸鹽裂解二硫鍵(即亞硫酸鹽分解),然后亞硫酸分解變性的蛋白質(zhì)進(jìn)一步被溶液中的蛋白酶降解,亞硫酸鹽分解作為微生物降解角蛋白過程中的一種非酶降解機(jī)制首次被提出[6]。Kunert用弗氏鏈霉菌降解角蛋白時(shí),發(fā)酵液中未能檢測到亞硫酸鹽,硫酸鹽含量也很低,巰基化合物卻大量存在,硫代硫酸根為角蛋白中硫的主要轉(zhuǎn)化形式,由此認(rèn)為該菌降解角蛋白是由角蛋白酶直接還原二硫鍵進(jìn)行的[6]。2007年朱曉飛等利用鏈霉菌B221液體發(fā)酵進(jìn)行了羽毛角蛋白降解機(jī)制的初探,結(jié)果表明硫酸鹽是角蛋白降解過程中硫元素的主要轉(zhuǎn)化形式,同時(shí)在發(fā)酵液中還檢測到了亞硫酸鹽,其含量變化與角蛋白酶活、降解率、可溶性蛋白、巰基化合物的變化存在很強(qiáng)的相關(guān)性,表明亞硫酸鹽分解作用在角蛋白降解中可能起到非常關(guān)鍵的作用[7]。2010年聶慶霽等利用地衣芽孢桿菌nju-1411-1液體發(fā)酵羽毛角蛋白,檢測到硫元素以硫酸根、亞硫酸根、硫離子、硫代硫酸根、巰基化合物、二硫鍵化合物、半胱氨酸、胱氨酸以及S-磺酸半胱氨酸類物質(zhì)等9種形態(tài)存在,其中硫酸根、亞硫酸根、硫代硫酸根和S-磺酸半胱氨酸類物質(zhì)是主要形態(tài),亞硫酸根和S-磺酸半胱氨酸類物質(zhì)出現(xiàn)相互消長的關(guān)系,表明亞硫酸鹽分解作用的存在[8]。

    本研究利用筆者所在實(shí)驗(yàn)室自行篩選的鏈霉菌B221,研究角蛋白固體發(fā)酵過程中外源添加不同濃度的硫酸鈉、亞硫酸鈉、硫代硫酸鈉和二硫蘇糖醇等四種含硫化合物對鏈霉菌B221角蛋白固體發(fā)酵過程的影響,加深對鏈霉菌B221降解角蛋白機(jī)制的認(rèn)識(shí),旨在為生物技術(shù)方法開發(fā)利用羽毛角蛋白資源奠定基礎(chǔ)。

    1材料與方法

    1.1供試材料

    鏈霉菌B221,從畜禽場長年堆積羽毛等廢棄物的土壤中經(jīng)過富集培養(yǎng)和分離篩選獲得。

    基礎(chǔ)培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基[9]。

    1.2試驗(yàn)方法

    1.2.1羽毛角蛋白的固體發(fā)酵在250 mL錐形瓶中裝入34 mL基礎(chǔ)培養(yǎng)基,加入10 g羽毛,121 ℃滅菌20 min。冷卻后,加入1 mL 4種含硫化合物溶液,使發(fā)酵體系中含硫化合物的濃度分別達(dá)到1 μmol/mL、10 μmol/mL、20 μmol/mL,接種2 mL孢子懸液,40 ℃下培養(yǎng)。添加的含硫化合物經(jīng) 0.22 μm 濾膜過濾除菌。以不添加含硫化合物的發(fā)酵組作為對照。B221固體發(fā)酵羽毛角蛋白周期一般為7 d,在研究中于發(fā)酵后7 d取樣,進(jìn)行含硫化合物含量和角蛋白酶活、可溶性蛋白含量測定。

    1.2.2含硫化合物的提取及測定取2 g發(fā)酵物,加入 60 mL 去離子水,40 ℃ 150 r/min振搖1 h,中速定性濾紙過濾,用濾液測定各種含硫化合物的含量。硫酸根:鉻酸鋇分光光度法;亞硫酸根:改進(jìn)的鹽酸副玫瑰苯胺法;硫化物:亞甲基藍(lán)分光光度法;巰基化合物:5,5′-二硫代-2-硝基苯甲酸(DTNB)光度法;二硫鍵:NTSB顯色法;硫代硫酸鹽:硫酸銅存在下的硫氰酸冷解法;半胱氨酸:酸性茚三酮顯色法;胱氨酸:二硫蘇糖醇裂解后,再采用酸性茚三酮顯色法;S-磺酸半胱氨酸:堿性條件下與氰化鈉反應(yīng)釋放出亞硫酸根離子的間接方法[7,10]。

    1.2.3角蛋白酶活、可溶性蛋白含量測定測定方法參照文獻(xiàn)[11]。

    2結(jié)果與分析

    2.1外源添加含硫化合物對固體發(fā)酵過程中角蛋白酶活和可溶性蛋白的影響

    從圖1可以看出,硫酸鈉添加組和二硫蘇糖醇添加組的角蛋白酶活力比其他2個(gè)添加組的酶活力要高許多。硫酸鈉添加組在添加濃度為10 μmol/mL時(shí)酶活力最高,為 36.11 U/mL,比不添加組的酶活力增加了74.76%;二硫蘇糖醇添加組在添加濃度為1 μmol/mL時(shí)酶活力最高,為 28.39 U/mL,比不添加組的酶活力增加了37.34%;亞硫酸鈉添加組的角蛋白酶活力隨著添加濃度的增大而提高,但變化幅度不大;硫代硫酸鈉添加組的角蛋白酶活力隨著添加濃度的增大而有所下降。

    從圖2可以看出,所有添加組的可溶性蛋白含量均比不添加組降低,其中硫酸鈉添加組和亞硫酸鈉添加組的可溶性蛋白含量隨著添加濃度的增大而減少,在添加濃度為 20 μmol/mL 時(shí),可溶性蛋白含量分別為不添加組的62.57%和65.16%;硫代硫酸鈉添加組的可溶性蛋白含量隨著添加濃度的增大而提高,最高為15.5 mg/mL,為不添加組的9107%;二硫蘇糖醇添加組則隨著添加濃度的增大先降后升,但變化幅度不大。

    2.2外源添加含硫化合物對固體發(fā)酵過程中含硫化合物的影響

    從圖3可以看出,各含硫化合物添加組的亞硫酸鹽含量基本上都比不添加組降低,同一含硫化合物不同添加濃度之間相差不大,這可能是由于到了發(fā)酵后期,基本上已無羽毛成形結(jié)構(gòu),亞硫酸鹽的生成量與消耗量基本持平,維持在一個(gè)穩(wěn)定水平。硫酸鈉添加組在添加濃度為20 μmol/mL時(shí)的亞硫酸鹽含量比其他2個(gè)添加濃度的低很多,為什么會(huì)產(chǎn)生這樣的變化,還需要進(jìn)一步研究。亞硫酸鹽在羽毛角蛋白降解過程中主要起2方面的作用,一方面起亞硫酸鹽解作用,打開二硫鍵,破壞羽毛角蛋白結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性;另一方面被微生物的氧化酶氧化成硫酸鹽,為微生物的生長提供快速硫源。

    從圖4可以看出,亞硫酸鈉和硫代硫酸鈉添加組的 S-磺酸半胱氨酸含量隨著添加濃度的增大而增加,都比硫酸鈉和二硫蘇糖醇添加組高很多。亞硫酸鈉添加組最高達(dá)到了0349 μmol/mL,這是由于亞硫酸鹽解作用將二硫鍵裂解成了巰基化合物和S-磺酸半胱氨酸,添加的亞硫酸鈉量越多,通過亞硫酸鹽解作用產(chǎn)生的S-磺酸半胱氨酸也就越多。硫代硫酸鈉添加組S-磺酸半胱氨酸含量最高達(dá)到了 0731 μmol/mL,這可能是由于存在硫代硫酸鹽解作用,使得S-磺酸半胱氨酸類物質(zhì)含量增加,反應(yīng)式為:R—S—S—R+S2O2-3+H+→R—SH+R—S—SO3-+S2-。

    硫酸鈉添加組和二硫蘇糖醇添加組的S-磺酸半胱氨酸含量均比不添加組的低很多,可能是由于二者的添加對角蛋白酶的強(qiáng)烈激活,使得酶解作用成為羽毛角蛋白降解的主要機(jī)制,競爭性地消耗了二硫鍵化合物,因而導(dǎo)致由亞硫酸鹽解作用和硫代硫酸鹽解作用產(chǎn)生的S-磺酸半胱氨酸量減少。

    從圖5可以看出,不添加組的二硫鍵化合物含量為 0518 μmol/mL,4種含硫化合物添加組的二硫鍵化合物含量

    均比不添加組的低。其中亞硫酸鈉添加組的二硫鍵含量最低,且隨著添加濃度的增大而降低,這是由于亞硫酸鈉與二硫鍵發(fā)生亞硫酸鹽解作用,消耗了二硫鍵所致,這也可以從亞硫酸鈉添加組的S-磺酸半胱氨酸含量很高看出。硫代硫酸鈉添加組的二硫鍵含量也隨著添加濃度的增大而降低,推測可能也是由于硫代硫酸鈉與二硫鍵發(fā)生反應(yīng),消耗了二硫鍵所致。

    從圖6可以看出,除了亞硫酸鈉添加組在添加濃度為 10 μmol/mL 和20 μmol/mL時(shí)的巰基化合物含量比不添加高外,其他各添加組的巰基化合物含量均比不添加組低,這可能是由于亞硫酸鈉添加組添加的亞硫酸鈉進(jìn)行了亞硫酸鹽解作用,產(chǎn)生了巰基化合物所致。其他含硫化合物添加組尤其是硫酸鈉添加組和二硫蘇糖醇添加組,由于對角蛋白酶的強(qiáng)烈激活作用,使得巰基化合物的消耗加快,因而導(dǎo)致巰基化合物含量比不添加組的低。

    從圖7可以看出,硫酸鈉添加組和二硫蘇糖醇添加組的半胱氨酸含量均比不添加組低,這可能是由于它們的添加激活了角蛋白酶,導(dǎo)致微生物對半胱氨酸的利用加劇所致。硫代硫酸鈉添加組的半胱氨酸含量仍然隨著添加濃度的增大而增加,最高為0141 μmol/mL,是發(fā)酵后5 d的1.58倍,是不添加組的2.56倍。

    從圖8可以看出,硫酸鈉添加組和亞硫酸鈉添加組的胱氨酸含量隨著添加濃度的增大而先增后降,其中硫酸鈉添加組的胱氨酸含量均比不添加組的低,亞硫酸鈉添加組在添加濃度為1 μmol/mL和10 μmol/mL時(shí)的胱氨酸含量比不添加組高,在添加濃度為10 μmol/mL時(shí)最高。硫代硫酸鈉添加組和二硫蘇糖醇添加組的胱氨酸含量隨著添加濃度的增大而降低。

    從圖9可以看出,除了硫代硫酸鈉添加組3個(gè)添加濃度和亞硫酸鈉添加組在添加濃度為10 μmol/mL和20 μmol/mL時(shí)的硫代硫酸鈉含量比不添加組的高外,其他含硫化合物添加組的硫代硫酸鈉含量均比不添加組低。其中亞硫酸鈉添加組的硫代硫酸鈉含量隨著亞硫酸鈉添加濃度的增大而增加,在添加濃度為20 μmol/mL時(shí)的硫代硫酸鈉含量最高,為 0411 μmol/mL,推測是由于還原性的亞硫酸鈉的存在,降低了硫代硫酸鈉的氧化速率。硫代硫酸鈉添加組的硫代硫酸鈉含量隨著添加濃度的增大而增加,在添加濃度為20 μmol/mL時(shí)的硫代硫酸鈉含量最高,為0491 μmol/mL,推測是由于添加了過量的硫代硫酸鈉,超過了利用限度所致。

    從圖10可以看出,硫酸鈉添加組的硫酸鹽含量隨著添加濃度的增大而增加,在添加1 μmol/mL時(shí),硫酸鹽濃度比不添加組的硫酸鹽濃度低;而在添加10 μmol/10 mL和 20 μmol/10 mL 時(shí),硫酸鹽濃度均比不添加組的硫酸鹽濃度要高。這可能是由于添加較低濃度硫酸鈉時(shí),硫酸鈉被鏈霉菌B211作為無機(jī)硫源而優(yōu)先利用掉,隨著添加濃度的增大,超過了鏈霉菌B221的利用速率,因而殘留的硫酸鹽濃度也逐漸增大。硫酸鹽作為角蛋白中硫元素的最終氧化產(chǎn)物,性質(zhì)比較穩(wěn)定,通常情況下,硫酸鹽的生成速率應(yīng)大于利用速率,在發(fā)酵產(chǎn)物中是逐步積累的。

    3結(jié)論

    到目前為止,已知能分解利用角蛋白的微生物有30余種,但針對含硫化合物添加對羽毛角蛋白降解過程,特別是固體發(fā)酵的影響所進(jìn)行的研究幾乎沒有。本研究以筆者所在實(shí)驗(yàn)室自行篩選到的鏈霉菌B221為材料,系統(tǒng)研究了羽毛角蛋白固體發(fā)酵過程中4種外源含硫化合物的添加對羽毛角蛋白固體降解過程的影響,發(fā)現(xiàn):(1)添加的4種含硫化合物對角蛋白酶都具有激活作用,但沒有顯著增加發(fā)酵產(chǎn)物中可溶性蛋白的含量;(2)亞硫酸鹽含量、二硫鍵化合物含量和 S-磺酸半胱氨酸類物質(zhì)含量之間存在著密切的相關(guān)性,再次證明了在B221固體發(fā)酵角蛋白過程中確實(shí)存在著亞硫酸鹽解作用;(3)硫代硫酸鹽含量、二硫鍵化合物含量、S-磺酸半胱氨酸類物質(zhì)含量、巰基化合物含量之間存在著密切的相關(guān)性,表明在B221固體發(fā)酵角蛋白過程中確實(shí)存在著另一種降解機(jī)制——硫代硫酸鹽解作用。

    參考文獻(xiàn):

    [1]繩賀軍,姜東鳳. 全球肉雞產(chǎn)業(yè)步入十年增長期[J]. 中國畜牧雜志,2010,46(14):62-63.

    [2]Divakala K C,Chiba L I,Kamalakar R B,et al. Amino acid supplementation of hydrolyzed feather meal diets for finisher pigs[J]. Journal of Animal Science,2009,87(4):1270-1281.

    [3]Anbu P,Hilda A. Purification of keratinase from poultry farm isolate Scopulariopsis brevicaulis and statistical optimization of enzyme activity[J]. Enzyme and Microbiological Technology,2005,36:639-647.

    [4]Marshall R C,Orwin D F,Gillespie J M. Structure and biochemistry of mammalian hard keratin[J]. Electron Microscopy Reviews,1991,4(1):47-83.

    [5]Nickerson W J. Keratinase[J]. Biochem Biophys Acta,1963,77:87-99.

    [6]Kunert J. Biochemical mechanisms of keratin degradation by actionmycete Streptomyces fradiae and fungus Microsporium gypseum,a comparison[J]. Journal of Basic Microbiology,1989,27:597-604.

    [7]朱曉飛,張玲,趙平芝,等. 鏈霉菌B221的角蛋白降解機(jī)制初探[J]. 中國農(nóng)學(xué)通報(bào),2007,23(6):18-22.

    [8]聶慶霽,史玉峰,王玲,等. 地衣芽孢桿菌nju-1411-1降解羽毛角蛋白過程中含硫化合物的變化[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué),2010(4):258-261.

    [9]董榮斌,張玲,朱曉飛,等. 耐熱鏈霉菌B221降解羽毛角蛋白的固體發(fā)酵條件研究[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué),2007(6):249-251.

    [10]魏復(fù)盛,國家環(huán)境保護(hù)總局,水和廢水監(jiān)測分析方法委會(huì). 水和廢水監(jiān)測分析方法[M]. 4版.北京:中國環(huán)境科學(xué)出版社,2002.

    [11]朱小飛. 微生物降解角蛋白的機(jī)制研究——含硫化合物的轉(zhuǎn)化及其作用[D].

    猜你喜歡
    亞硫酸鹽降解
    美國制訂測定食品中亞硫酸鹽濃度的新分析方法
    亞硫酸鹽在食品中的研究進(jìn)展
    食品中亞硫酸鹽的檢測
    食品界(2019年2期)2019-03-10 19:35:00
    亞硝酸鹽降解進(jìn)展研究
    土壤中多菌靈污染及修復(fù)技術(shù)研究現(xiàn)狀
    紅外光譜結(jié)合元素分析法研究SRB對煤的降解
    污水處理生物技術(shù)探討
    四環(huán)素類抗生素的環(huán)境行為研究進(jìn)展
    科技視界(2016年11期)2016-05-23 08:07:47
    食品中亞硫酸鹽的使用及檢測
    微生物對垃圾滲濾液中胡敏酸降解和形成的影響
    科技視界(2016年7期)2016-04-01 09:39:11
    or卡值多少钱| 无人区码免费观看不卡| 久久久精品欧美日韩精品| 人人妻人人澡欧美一区二区| 国语自产精品视频在线第100页| 国产精品永久免费网站| 无人区码免费观看不卡| 给我免费播放毛片高清在线观看| 舔av片在线| 国产精品av视频在线免费观看| 亚洲精品在线美女| 国产欧美日韩精品一区二区| 久久久久精品国产欧美久久久| 夜夜夜夜夜久久久久| 哪里可以看免费的av片| 午夜影院日韩av| netflix在线观看网站| 国产97色在线日韩免费| 久久久国产成人免费| 亚洲精华国产精华精| 国产精品影院久久| 91在线观看av| 91麻豆av在线| 夜夜爽天天搞| 在线观看一区二区三区| 亚洲专区国产一区二区| 两个人看的免费小视频| 午夜精品久久久久久毛片777| 成人特级av手机在线观看| 免费av毛片视频| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 欧美乱码精品一区二区三区| 国产精品久久久人人做人人爽| 欧美日本视频| 校园春色视频在线观看| www.www免费av| 国产一区二区在线av高清观看| 日韩欧美国产一区二区入口| 好看av亚洲va欧美ⅴa在| 色av中文字幕| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片| 男女床上黄色一级片免费看| 日韩免费av在线播放| 成人永久免费在线观看视频| 美女高潮的动态| 国产精品 国内视频| www.999成人在线观看| 97人妻精品一区二区三区麻豆| 国产精品99久久99久久久不卡| 日韩大尺度精品在线看网址| 色尼玛亚洲综合影院| 成人三级做爰电影| 免费在线观看成人毛片| 精品欧美国产一区二区三| 久久亚洲真实| 亚洲熟妇熟女久久| av国产免费在线观看| 亚洲精品在线观看二区| 国产三级中文精品| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看| 国产在线精品亚洲第一网站| 国产综合懂色| 在线观看日韩欧美| 嫩草影院入口| 母亲3免费完整高清在线观看| 99久久无色码亚洲精品果冻| 久久久久久久午夜电影| 午夜福利高清视频| 日韩国内少妇激情av| 男女那种视频在线观看| 欧美色欧美亚洲另类二区| 日本 欧美在线| 久久精品人妻少妇| 国产亚洲精品综合一区在线观看| 久久久久九九精品影院| 亚洲美女视频黄频| netflix在线观看网站| 日韩欧美在线二视频| 后天国语完整版免费观看| 精品久久久久久久末码| 亚洲精品色激情综合| 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| 97碰自拍视频| 老汉色∧v一级毛片| 黄色日韩在线| 亚洲午夜精品一区,二区,三区| 久久久久久久久中文| 男女那种视频在线观看| 中文字幕久久专区| 美女被艹到高潮喷水动态| 国产精品永久免费网站| 免费看日本二区| 久久精品国产99精品国产亚洲性色| 最近视频中文字幕2019在线8| 国产成人福利小说| 国产一区在线观看成人免费| 国产视频一区二区在线看| 国产免费男女视频| 国产午夜精品论理片| 亚洲天堂国产精品一区在线| 精品无人区乱码1区二区| 国产精品久久视频播放| 久久中文字幕人妻熟女| 午夜免费观看网址| 国产精品久久久久久亚洲av鲁大| 黄色日韩在线| 亚洲一区二区三区不卡视频| 法律面前人人平等表现在哪些方面| 欧美色视频一区免费| 国产精品 国内视频| 国产成年人精品一区二区| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 亚洲精品一区av在线观看| 精品人妻1区二区| 欧美+亚洲+日韩+国产| 人人妻人人澡欧美一区二区| 国产成+人综合+亚洲专区| svipshipincom国产片| 亚洲欧美激情综合另类| 伦理电影免费视频| 观看免费一级毛片| 观看免费一级毛片| 成人av在线播放网站| 男女视频在线观看网站免费| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 老汉色av国产亚洲站长工具| 美女午夜性视频免费| 一级a爱片免费观看的视频| 人人妻人人澡欧美一区二区| 搡老岳熟女国产| 女同久久另类99精品国产91| 成人永久免费在线观看视频| 国产欧美日韩精品一区二区| 亚洲第一电影网av| 亚洲第一欧美日韩一区二区三区| 99久久国产精品久久久| 亚洲成av人片免费观看| cao死你这个sao货| 岛国在线免费视频观看| 欧美激情在线99| 麻豆av在线久日| 国产成人精品久久二区二区91| 亚洲七黄色美女视频| 久久天堂一区二区三区四区| 国产欧美日韩一区二区精品| 夜夜爽天天搞| 51午夜福利影视在线观看| 久久久久久大精品| 天堂动漫精品| 97超视频在线观看视频| av欧美777| av国产免费在线观看| 人人妻人人澡欧美一区二区| 日韩人妻高清精品专区| 午夜影院日韩av| www日本黄色视频网| 日韩欧美精品v在线| 日本五十路高清| 日本五十路高清| 午夜福利欧美成人| 国产精品av视频在线免费观看| 免费电影在线观看免费观看| 久久久久亚洲av毛片大全| 大型黄色视频在线免费观看| 成人av一区二区三区在线看| 婷婷精品国产亚洲av在线| 久久国产乱子伦精品免费另类| 亚洲真实伦在线观看| 亚洲专区中文字幕在线| 精品电影一区二区在线| 日韩人妻高清精品专区| www.自偷自拍.com| 色在线成人网| 他把我摸到了高潮在线观看| 一a级毛片在线观看| 2021天堂中文幕一二区在线观| 日韩免费av在线播放| 欧美一区二区精品小视频在线| av在线蜜桃| 国产高清视频在线播放一区| 精品不卡国产一区二区三区| 国产一区二区三区视频了| 成人国产一区最新在线观看| 97人妻精品一区二区三区麻豆| 日韩欧美一区二区三区在线观看| 亚洲av美国av| 观看美女的网站| 国产精品久久久人人做人人爽| 热99在线观看视频| 国产成年人精品一区二区| 亚洲av电影在线进入| 69av精品久久久久久| 久久中文字幕人妻熟女| 欧美在线一区亚洲| 国产亚洲精品久久久com| 午夜免费激情av| 在线观看免费午夜福利视频| 欧美3d第一页| 男女那种视频在线观看| 真实男女啪啪啪动态图| 久久伊人香网站| 午夜成年电影在线免费观看| 亚洲国产中文字幕在线视频| 亚洲av电影不卡..在线观看| 午夜成年电影在线免费观看| 在线播放国产精品三级| 久久久精品大字幕| 成年女人毛片免费观看观看9| 久久久色成人| 熟女人妻精品中文字幕| 亚洲中文日韩欧美视频| 中文亚洲av片在线观看爽| 美女大奶头视频| 亚洲国产欧美人成| 毛片女人毛片| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久| www日本在线高清视频| 亚洲精品一区av在线观看| 国产精品爽爽va在线观看网站| 精品熟女少妇八av免费久了| 99热精品在线国产| 成人av一区二区三区在线看| 天堂√8在线中文| 国产精华一区二区三区| 中文字幕最新亚洲高清| 在线观看66精品国产| 免费av毛片视频| 青草久久国产| 亚洲avbb在线观看| 色哟哟哟哟哟哟| 欧美日韩乱码在线| 精品久久久久久久人妻蜜臀av| 美女免费视频网站| 国产麻豆成人av免费视频| h日本视频在线播放| 色综合站精品国产| 91老司机精品| 久久亚洲精品不卡| 国产97色在线日韩免费| 18禁观看日本| 丝袜人妻中文字幕| 欧美激情久久久久久爽电影| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 一本精品99久久精品77| 日韩欧美精品v在线| 欧美乱妇无乱码| 欧美乱色亚洲激情| 国产三级黄色录像| 亚洲在线观看片| 国产一区在线观看成人免费| 久久久久性生活片| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 我要搜黄色片| 国产成人精品久久二区二区免费| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀| 亚洲精品456在线播放app | 哪里可以看免费的av片| 国产综合懂色| 97人妻精品一区二区三区麻豆| 99在线视频只有这里精品首页| 激情在线观看视频在线高清| 极品教师在线免费播放| 精品久久久久久久人妻蜜臀av| 久久久成人免费电影| 两人在一起打扑克的视频| 精品一区二区三区视频在线观看免费| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| 国产成人精品久久二区二区免费| 亚洲av成人av| 午夜福利成人在线免费观看| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 白带黄色成豆腐渣| 免费高清视频大片| 精品久久久久久久久久久久久| 国产三级中文精品| 亚洲av熟女| 国产精品一区二区免费欧美| 色综合亚洲欧美另类图片| 亚洲成a人片在线一区二区| 身体一侧抽搐| 日韩高清综合在线| 国产精品98久久久久久宅男小说| 欧美zozozo另类| 少妇的逼水好多| 久久久久久久久久黄片| 国产精品永久免费网站| 午夜a级毛片| 国产亚洲欧美98| 亚洲中文字幕一区二区三区有码在线看 | 99视频精品全部免费 在线 | 999精品在线视频| 亚洲精华国产精华精| 国产伦在线观看视频一区| 麻豆国产97在线/欧美| 观看免费一级毛片| 久久精品国产清高在天天线| 国内久久婷婷六月综合欲色啪| 亚洲美女黄片视频| 99久久精品国产亚洲精品| 成人av一区二区三区在线看| 精品欧美国产一区二区三| av天堂中文字幕网| a级毛片在线看网站| 一个人看视频在线观看www免费 | 美女高潮的动态| 日本免费一区二区三区高清不卡| 久久久国产成人免费| 小说图片视频综合网站| 久久精品91无色码中文字幕| 婷婷精品国产亚洲av| 搡老妇女老女人老熟妇| 欧美绝顶高潮抽搐喷水| 最近视频中文字幕2019在线8| 99精品在免费线老司机午夜| 长腿黑丝高跟| 亚洲av成人精品一区久久| 久久亚洲精品不卡| www.精华液| 亚洲乱码一区二区免费版| 两性夫妻黄色片| 黑人巨大精品欧美一区二区mp4| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 国内精品一区二区在线观看| 一夜夜www| 亚洲av片天天在线观看| 中文字幕熟女人妻在线| 久久精品国产综合久久久| 久久精品影院6| 久久热在线av| 99精品欧美一区二区三区四区| 色尼玛亚洲综合影院| 中文字幕人成人乱码亚洲影| 人妻久久中文字幕网| 日本五十路高清| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 免费在线观看影片大全网站| 久久久国产成人免费| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 欧美成人一区二区免费高清观看 | 一本一本综合久久| 三级国产精品欧美在线观看 | 97碰自拍视频| 精品无人区乱码1区二区| 老熟妇仑乱视频hdxx| 免费观看的影片在线观看| 亚洲欧美精品综合一区二区三区| 国产精品久久视频播放| 亚洲av五月六月丁香网| 欧美黑人巨大hd| 国产精品国产高清国产av| 男女之事视频高清在线观看| 亚洲自偷自拍图片 自拍| 亚洲性夜色夜夜综合| 免费一级毛片在线播放高清视频| 成人特级av手机在线观看| 成人欧美大片| 90打野战视频偷拍视频| 亚洲国产日韩欧美精品在线观看 | 精品一区二区三区四区五区乱码| 午夜免费成人在线视频| xxxwww97欧美| 亚洲美女黄片视频| 中出人妻视频一区二区| 国产精品影院久久| 午夜免费激情av| 久久香蕉精品热| 这个男人来自地球电影免费观看| 在线观看免费视频日本深夜| 99riav亚洲国产免费| 女同久久另类99精品国产91| 青草久久国产| 免费无遮挡裸体视频| 制服丝袜大香蕉在线| 国产精品亚洲美女久久久| 国产精品av久久久久免费| 国产亚洲精品av在线| 亚洲无线在线观看| 国产午夜精品论理片| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 在线观看舔阴道视频| 一个人免费在线观看的高清视频| 国产熟女xx| 亚洲狠狠婷婷综合久久图片| 国产精品99久久久久久久久| 日本a在线网址| 亚洲欧美日韩东京热| 最近最新中文字幕大全免费视频| 成年版毛片免费区| 99riav亚洲国产免费| 中文亚洲av片在线观看爽| 日本一二三区视频观看| 亚洲成人久久性| 在线观看免费午夜福利视频| 国产精品影院久久| 国产成人欧美在线观看| 午夜a级毛片| 国产精品 欧美亚洲| 日本 av在线| 99热这里只有精品一区 | 免费在线观看亚洲国产| 最好的美女福利视频网| 又爽又黄无遮挡网站| av国产免费在线观看| 欧美另类亚洲清纯唯美| 国产私拍福利视频在线观看| 人妻丰满熟妇av一区二区三区| 免费电影在线观看免费观看| 夜夜躁狠狠躁天天躁| 日韩三级视频一区二区三区| 亚洲成av人片在线播放无| 亚洲九九香蕉| 成人国产综合亚洲| 午夜福利在线观看吧| 久久国产精品影院| 精品欧美国产一区二区三| 午夜视频精品福利| 亚洲成a人片在线一区二区| 在线视频色国产色| 国产精品 欧美亚洲| 国产精品一及| 真实男女啪啪啪动态图| 女生性感内裤真人,穿戴方法视频| 小蜜桃在线观看免费完整版高清| 欧美日韩乱码在线| 一个人看的www免费观看视频| 这个男人来自地球电影免费观看| 免费在线观看影片大全网站| 在线看三级毛片| 日韩欧美精品v在线| 欧美另类亚洲清纯唯美| 美女黄网站色视频| 免费一级毛片在线播放高清视频| 免费大片18禁| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 男人的好看免费观看在线视频| 1000部很黄的大片| xxxwww97欧美| 一区福利在线观看| 在线播放国产精品三级| 国产av不卡久久| 国产探花在线观看一区二区| 久久精品综合一区二区三区| netflix在线观看网站| 免费看美女性在线毛片视频| 亚洲午夜精品一区,二区,三区| 久久亚洲真实| 亚洲国产高清在线一区二区三| 精品欧美国产一区二区三| 我的老师免费观看完整版| 欧美日韩一级在线毛片| 日韩欧美国产一区二区入口| 美女高潮的动态| 国产野战对白在线观看| 熟女人妻精品中文字幕| 身体一侧抽搐| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 久久欧美精品欧美久久欧美| 在线观看免费午夜福利视频| 国产午夜福利久久久久久| 欧美成狂野欧美在线观看| 久久久久久人人人人人| 最近最新免费中文字幕在线| 精品国产亚洲在线| 一进一出抽搐动态| 日韩成人在线观看一区二区三区| 国产精品久久电影中文字幕| 在线免费观看的www视频| 日日夜夜操网爽| 精品久久久久久久毛片微露脸| 91在线观看av| 18禁美女被吸乳视频| 精品福利观看| 免费观看的影片在线观看| 人妻夜夜爽99麻豆av| 热99re8久久精品国产| 村上凉子中文字幕在线| 久久久久国产一级毛片高清牌| 男人舔女人下体高潮全视频| 观看免费一级毛片| 琪琪午夜伦伦电影理论片6080| 一本综合久久免费| 国产成人精品无人区| 女同久久另类99精品国产91| 国产真实乱freesex| 国产精品久久久久久亚洲av鲁大| 久久久久国产一级毛片高清牌| 久久婷婷人人爽人人干人人爱| 亚洲av成人精品一区久久| 女生性感内裤真人,穿戴方法视频| 国产伦在线观看视频一区| 久久久久久久精品吃奶| 日本黄色视频三级网站网址| 可以在线观看的亚洲视频| 男女午夜视频在线观看| 法律面前人人平等表现在哪些方面| 九九久久精品国产亚洲av麻豆 | 日韩欧美国产一区二区入口| 91麻豆av在线| 91麻豆精品激情在线观看国产| 免费在线观看日本一区| 亚洲九九香蕉| av福利片在线观看| 精品欧美国产一区二区三| 国产精品久久久久久亚洲av鲁大| 人妻久久中文字幕网| 色吧在线观看| 色综合婷婷激情| 国产高清有码在线观看视频| 小说图片视频综合网站| 在线观看免费午夜福利视频| 在线视频色国产色| 欧美大码av| 国产午夜精品久久久久久| 国产亚洲精品av在线| 久久久久久久精品吃奶| 亚洲一区二区三区色噜噜| 女警被强在线播放| 欧美在线黄色| 国产人伦9x9x在线观看| 国产精品日韩av在线免费观看| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲| 亚洲精华国产精华精| 成人av一区二区三区在线看| 少妇的丰满在线观看| 国产欧美日韩一区二区三| 国产欧美日韩精品一区二区| 亚洲精品中文字幕一二三四区| 日本黄色视频三级网站网址| 在线看三级毛片| 久久精品aⅴ一区二区三区四区| 国产综合懂色| 视频区欧美日本亚洲| 国产精品一区二区三区四区免费观看 | www日本黄色视频网| av黄色大香蕉| 嫩草影院精品99| 亚洲av五月六月丁香网| 久久午夜亚洲精品久久| 日本与韩国留学比较| 黄色丝袜av网址大全| 国产一区二区激情短视频| 在线十欧美十亚洲十日本专区| 一边摸一边抽搐一进一小说| 国产三级中文精品| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看| 国产成年人精品一区二区| 成人永久免费在线观看视频| 桃红色精品国产亚洲av| 亚洲精品在线观看二区| 级片在线观看| 久久中文字幕人妻熟女| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 久久久国产成人精品二区| 男女床上黄色一级片免费看| 免费看光身美女| 精品一区二区三区视频在线 | 亚洲国产精品成人综合色| 麻豆久久精品国产亚洲av| 欧美中文日本在线观看视频| 亚洲熟妇中文字幕五十中出| 一个人看视频在线观看www免费 | 丁香六月欧美| 免费人成视频x8x8入口观看| 久久久久久人人人人人| 日本三级黄在线观看| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区| h日本视频在线播放| 非洲黑人性xxxx精品又粗又长| 欧美午夜高清在线| 最近视频中文字幕2019在线8| 黑人巨大精品欧美一区二区mp4| xxxwww97欧美| 深夜精品福利| 少妇熟女aⅴ在线视频| 成人性生交大片免费视频hd| 草草在线视频免费看| 精品久久久久久久人妻蜜臀av| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| 国产男靠女视频免费网站| 久久久久久久久免费视频了| av视频在线观看入口| 男人舔女人的私密视频| 级片在线观看| 观看美女的网站| 国内精品美女久久久久久| 欧美极品一区二区三区四区| 视频区欧美日本亚洲| 99视频精品全部免费 在线 | 丰满人妻一区二区三区视频av | 麻豆成人av在线观看| 老司机午夜十八禁免费视频| 亚洲成人中文字幕在线播放| 国产又色又爽无遮挡免费看| 欧美成狂野欧美在线观看| 国产一区在线观看成人免费| 成人精品一区二区免费| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片| 国产成人系列免费观看| 丁香六月欧美| 99riav亚洲国产免费| 91av网一区二区| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 欧美成人性av电影在线观看| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 国产综合懂色| av视频在线观看入口| 国产精品久久久久久亚洲av鲁大| 真实男女啪啪啪动态图| 国产成人精品无人区| 午夜福利在线在线| 天堂网av新在线| 日本 欧美在线| 精品久久久久久,| 国产探花在线观看一区二区|