高華健+任靜+蔡鳳香+李偉+李晶+隋亞平+趙鳳云

摘要：以水稻品種中花 11 號(hào)為材料，利用 MAPKK 抑制劑 PD（PD 98059）分析了 MAPK 信號(hào)對(duì)水稻根系生長、H2O2 產(chǎn)生、生長素積累分布及生長素和細(xì)胞周期基因表達(dá)譜的影響。結(jié)果表明，PD 處理促進(jìn)了初生根和不定根的伸長生長，但抑制了側(cè)根的形成和發(fā)育，并誘導(dǎo)了H2O2 的產(chǎn)生和生長素的積累增加。分子水平分析顯示，PD 處理分別使 14 個(gè)生長素基因和12 個(gè)細(xì)胞周期基因表達(dá)上調(diào)，使 3 個(gè)生長素基因和 7 個(gè)細(xì)胞周期基因表達(dá)下調(diào)。這些結(jié)果說明在正常條件下，MAPK 對(duì)水稻幼苗根系生長的調(diào)節(jié)與其控制 H2O2 產(chǎn)生和生長素平衡及調(diào)控生長素和細(xì)胞周期基因表達(dá)有密切關(guān)系。

關(guān)鍵詞：MAPK（絲裂原活化蛋白激酶）；生長素；水稻根系

中圖分類號(hào)： S511.01文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號(hào)：1002-1302（2014）01-0018-04

收稿日期：2013-04-24

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金（編號(hào)：30671126）；山東省淄博市科技發(fā)展計(jì)劃（編號(hào)：109036、111089）。

作者簡介：高華?。?992—），男，山東日照人，本科生；任靜（1990—），女，山東鄒平人，碩士研究生，從事植物逆境分子生物學(xué)研究。他們對(duì)本工作的貢獻(xiàn)相同。

通信作者：趙鳳云，教授，從事植物逆境分子生物學(xué)研究。E-mail：zfy1226@126.com。MAPK 信號(hào)級(jí)聯(lián)是植物體內(nèi)的重要信號(hào)分子[1]，越來越多的證據(jù)表明 MAPK 信號(hào)在調(diào)節(jié)植物生長發(fā)育、細(xì)胞增殖、激素生理及環(huán)境脅迫應(yīng)答過程中發(fā)揮重要作用[2]。生長素是植物體內(nèi)的關(guān)鍵激素之一，影響植物根系生長、細(xì)胞分裂及基因表達(dá)。關(guān)于生長素與 MAPK 的關(guān)系有不同的報(bào)道[3-4]，如 Mockaitis等報(bào)道生長素誘導(dǎo)擬南芥根系 MAPK 活性增加[5]，Mizoguchi 等試驗(yàn)也得到類似結(jié)果[6]。相反，Kovtun 等研究表明 NPK1（a specific plant MAPK kinase kinase，MAPKKK）激活 MAPK 信號(hào)級(jí)聯(lián)，抑制早期生長素應(yīng)答基因轉(zhuǎn)錄[7]，Lee 等和 Dai 等分別報(bào)道 MPK12 和 MKK7 是生長素信號(hào)的負(fù)調(diào)控因子[8-9]。這些研究表明在生長素信號(hào)傳導(dǎo)過程中存在正調(diào)控和負(fù)調(diào)控 MAPK 途徑[4]。

細(xì)胞周期是控制植物生長的關(guān)鍵因子之一。MAPK 在細(xì)胞分裂過程中起核心作用[4]。如煙草NTF6（Nicotiana tabacum MAPK homolog）在細(xì)胞分裂晚后期被激活并瞬時(shí)定位在成膜體[10]。NTF4（N. tabacum MAPK homolog）在細(xì)胞周期的G1期表達(dá)低，但在S、G2期表達(dá)高[4]。Ma等報(bào)道在胞質(zhì)分裂過程中MAPK磷酸化與細(xì)胞板形成有關(guān)[11]。細(xì)胞周期進(jìn)程受細(xì)胞周期蛋白和（Cycs）和依賴于周期蛋白激酶（CDKs）等一系列蛋白調(diào)控[12]。ROS是植物體內(nèi)的重要信號(hào)分子，有研究表明，MAPK信號(hào)途徑不僅受ROS誘導(dǎo)，還調(diào)節(jié)ROS產(chǎn)生[13-14]。這些結(jié)果顯示MAPK與生長素、細(xì)胞周期和 ROS 有密切關(guān)系，我們的前期研究發(fā)現(xiàn)生長素、細(xì)胞周期和 ROS 都參與了水稻根系生長的調(diào)節(jié)[15]，但是在水稻幼苗根系生長發(fā)育過程中 MAPK 與它們的關(guān)系還不清楚。本試驗(yàn)以水稻品種中花11號(hào)為材料，利用 MAPKK 抑制劑 PD（PD 98059）研究 MAPK 信號(hào)對(duì)水稻根系生長、H2O2 產(chǎn)生、生長素積累分布及生長素和細(xì)胞周期基因表達(dá)譜的影響。1材料與方法

1.1材料與處理

以水稻中花 11 號(hào)為材料，挑選籽粒飽滿的種子去殼后消毒：75% 乙醇（30 s）、0.1% 氯化汞（15 min）、2% 次氯酸鈉（20 min），無菌水沖洗 6 次以上，然后將種子分別種在MS 培養(yǎng)基上，置于培養(yǎng)箱內(nèi)[光周期為 14 h光照，光照強(qiáng)度為 200 μmol/（m2·s），白天溫度 26 ℃，夜間10 h溫度為20 ℃，空氣相對(duì)濕度為 50%～60%]培養(yǎng)8 d，然后轉(zhuǎn)入Hoagland營養(yǎng)液添加15 μmol/L PD（PD 98059，MAPKK 抑制劑）處理 5 d，每種處理至少重復(fù)3次，每次3個(gè)平行試驗(yàn)，每個(gè)試驗(yàn) 50～60 株。

1.2根系生長統(tǒng)計(jì)

初生根和不定根的長度用尺子測(cè)量，初生根和不定根上側(cè)根的數(shù)量和長度用帶數(shù)碼相機(jī)的顯微鏡統(tǒng)計(jì)和測(cè)量，每個(gè)指標(biāo)統(tǒng)計(jì)60株。

1. 3H2O2 含量的測(cè)定

H2O2的定性和定量測(cè)定分別參照Chen等[16]及Loreto等[17]方法進(jìn)行，每種處理至少用20株。

1.4生長素分布和積累的測(cè)定

利用轉(zhuǎn)DR5-GUS 基因水稻對(duì)生長素的分布和積累進(jìn)行測(cè)定，方法參照Petersson 等[18]。轉(zhuǎn)基因水稻種子在MS 培養(yǎng)基萌發(fā)生長8 d，然后轉(zhuǎn)入Hoagland營養(yǎng)液添加15 μmol/L PD在上述同樣條件下分別處理5、10 h，或在Hoagland營養(yǎng)液同時(shí)添加0.06% H2O2 和15 mmol/L DMTU（H2O2 清除劑）處理5 h，每種處理至少用20株進(jìn)行GUS 活性檢測(cè)。

1.5RT-PCR 分析

使用 Trizol 試劑提取總 mRNA，取1 μg 總 mRNA，利用RNA PCR Kit（AMV）V3.0合成cDNA。每個(gè)處理PCR反應(yīng)用等量的 cDNA，每個(gè)泳道用25 μL PCR 產(chǎn)物，每個(gè)PCR反應(yīng)在同樣條件下獨(dú)立重復(fù)3次。Osactin1 基因作為內(nèi)標(biāo)，通過Gel-Pro Analyzer 軟件對(duì)基因轉(zhuǎn)錄活性進(jìn)行半定量，將對(duì)照的轉(zhuǎn)錄水平設(shè)置為1，基因表達(dá)水平≥1.3為表達(dá)上調(diào)，≤0.7為表達(dá)下調(diào)。

1. 6數(shù)據(jù)處理

用Excel進(jìn)行原始數(shù)據(jù)的處理。取3次重復(fù)試驗(yàn)的平均值。用單因子方差分析PD處理與對(duì)照之間的差異，P<0.05 表示差異顯著。

2結(jié)果與分析

2.1MAPK對(duì)水稻幼苗根系生長的影響

由圖1-A，B可見，與對(duì)照相比，PD處理促進(jìn)了初生根和不定根的伸長生長（P<0.05）。相反，該處理?xiàng)l件下側(cè)根的形成和生長受到抑制（P<0.05）（圖1-C、D）。說明在正常條件下MAPK 對(duì)水稻根系特別是側(cè)根的生長和發(fā)育起重要的調(diào)節(jié)作用。

2.2MAPK對(duì)水稻幼苗根系H2O2含量的影響

MAPK對(duì)H2O2的產(chǎn)生有調(diào)節(jié)作用。為了進(jìn)一步了解MAPK對(duì)根系生長的調(diào)節(jié)是否與H2O2產(chǎn)生有關(guān)，定性和定量測(cè)定了根系中H2O2的產(chǎn)生。結(jié)果顯示，在PD處理?xiàng)l件下，H2O2的含量比對(duì)照組的增加（P<0.05）（圖2-A），定性測(cè)定結(jié)果與定量測(cè)定結(jié)果一致（圖2-B）。

2.3MAPK對(duì)水稻根系生長素積累和分布的影響

生長素是調(diào)節(jié)根系生長的重要信號(hào)分子之一，為了解MAPK調(diào)節(jié)水稻根系的生長是否與生長素有關(guān)，本試驗(yàn)利用轉(zhuǎn)DR5-GUS 基因水稻對(duì)PD處理中根系生長素的分布和積累進(jìn)行了測(cè)定（圖3）。與對(duì)照比，PD處理5 h 和10 h使生長素在初生根根尖各區(qū)的積累都明顯增加。H2O2 處理5 h 生長素在初生根根尖各區(qū)的積累也明顯增加，但用H2O2 及其清除劑DMTU 同時(shí)處理5 h 后，生長素在成熟區(qū)和伸長區(qū)的積累減少。這3種處理?xiàng)l件下生長素在不定根根尖各區(qū)的積累與分布與初生根的類似。

2.4MAPK對(duì)水稻根系生長素基因表達(dá)譜的影響

為進(jìn)一步了解MAPK 與生長素信號(hào)的關(guān)系，利用RT-PCR 和半定量技術(shù)分析了生長素信號(hào)途徑上的關(guān)鍵基因家族包括OsPINs（生長素運(yùn)輸）、OsARFs、OsIAAs（生長素應(yīng)答）

表達(dá)的變化。圖4顯示，在PD 處理?xiàng)l件下有17個(gè)生長素基因的表達(dá)水平發(fā)生了明顯變化，在這17個(gè)基因中只有3個(gè)基因（即OsPIN5a、OsPIN9、OsIAA13）的表達(dá)下調(diào)，其他14個(gè)基因（包括OsPIN1b、OsPIN5b、OsARF1、OsIAA2、OsIAA30 等）的表達(dá)水平都明顯升高，說明在正常條件下前3個(gè)基因受MAPK 信號(hào)級(jí)聯(lián)正調(diào)控，而后14個(gè)基因受MAPK 信號(hào)級(jí)聯(lián)負(fù)調(diào)控。PD 處理誘導(dǎo)生長素積累的變化可能與其調(diào)節(jié)生長素基因表達(dá)有密切關(guān)系。

2.5MAPK對(duì)水稻根系細(xì)胞周期基因表達(dá)譜的影響

細(xì)胞分裂是控制根系生長的重要因素之一，MAPK和生長素都對(duì)細(xì)胞周期基因表達(dá)有調(diào)節(jié)作用，試驗(yàn)進(jìn)一步分析了MAPK對(duì)細(xì)胞周期基因表達(dá)的影響。由圖5可見，PD 處理使7個(gè)細(xì)胞周期基因（包括Orysa；CycB2；2、Oryza；CycU2；1、Oryza；CDKC；3、Orysa；CDKE；1、Orysa；CDKG；1、Orysa；CDKG；2、Orysa；CKL2）表達(dá)下調(diào)，12個(gè)基因（包括Orysa；CycA2；1、Orysa；CycB2；1、Orysa；CycD5；1、Oryza；CDKC；1、Oryza；KRP5、Orysa；RB2 等）表達(dá)水平上調(diào)，說明正常條件下前7個(gè)基因受MAPK 信號(hào)級(jí)聯(lián)正調(diào)控，而后12個(gè)基因受MAPK 信號(hào)級(jí)聯(lián)負(fù)調(diào)控。PD 處理誘導(dǎo)根系生長的變化可能與其調(diào)節(jié)細(xì)胞周期基因表達(dá)有關(guān)。

3討論

MAPK 信號(hào)在調(diào)節(jié)植物生長發(fā)育、細(xì)胞增殖、激素生理過程中發(fā)揮重要作用[2]。PD 處理抑制 IAA和 ON 誘導(dǎo)的黃瓜不定根形成[19]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，PD 處理促進(jìn)了初生根和

不定根的伸長生長，但是抑制了側(cè)根的形成與發(fā)育（圖1）。生長素影響植物根系生長發(fā)育，OsPINs、OsARFs、OsIAAs是生長素信號(hào)途徑上的關(guān)鍵基因家族[20-22]。研究表明在生長素信號(hào)傳導(dǎo)過程中存在正調(diào)控和負(fù)調(diào)控 MAPK 信號(hào)途徑[3-9]。 本試驗(yàn)中，PD 處理使生長素在根尖的積累增加（圖3），分子水平分析顯示該條件下多數(shù)生長素基因表達(dá)上調(diào)，說明 MAPK 信號(hào)途徑負(fù)調(diào)控生長素信號(hào)，但是，有 3 個(gè)生長素基因的表達(dá)下調(diào)（圖4），暗示 MAPK 信號(hào)途徑也正調(diào)控生長素信號(hào)，這可能是因?yàn)?MAPK 信號(hào)級(jí)聯(lián)不同成員的結(jié)合可以調(diào)控不同基因的表達(dá)。因此 MAPK 與生長素的關(guān)系復(fù)雜，既有正調(diào)控途徑也有負(fù)調(diào)控途徑。PD 對(duì)根系生長的調(diào)節(jié)可能與其誘導(dǎo)生長素的增加和調(diào)控生長素基因表達(dá)有關(guān)。試驗(yàn)結(jié)果還說明，在正常條件下 MAPK 可能通過調(diào)節(jié)生長素基因表達(dá)控制生長素平衡。

MAPK 在細(xì)胞分裂過程中起核心作用[4，6，10-11]。細(xì)胞周期進(jìn)程受細(xì)胞周期蛋白等一系列蛋白調(diào)控[12]。MAPK 正調(diào)控細(xì)胞分裂相關(guān)基因表達(dá)[23]。但是本研究顯示，在水稻根系生長發(fā)育過程中 MAPK 對(duì)細(xì)胞周期基因表達(dá)的調(diào)節(jié)既有正調(diào)控（如Oryza；CDKC；3 和Orysa；CDKG；2 等）也有負(fù)調(diào)控（如Orysa；CycA2；1 和Oryza；KRP5等）（圖5），PD 對(duì)根系生長的調(diào)節(jié)可能與其調(diào)控細(xì)胞周期基因表達(dá)有關(guān)。我們的前期研究表明，ROS 是調(diào)節(jié)水稻根系生長發(fā)育及生長素和細(xì)胞周期基因表達(dá)的重要信號(hào)分子[15]，MAPK 信號(hào)調(diào)節(jié) ROS 產(chǎn)生[14]，大豆 GmMPK4 基因沉默導(dǎo)致 H2O2 積累增加[23]。本研究中 PD 處理誘導(dǎo) H2O2 增加（圖2），而且 PD 誘導(dǎo)生長素積累的變化與 H2O2 處理的類似（圖3），這些結(jié)果暗示 MAPK 對(duì)根系生長的調(diào)節(jié)可能還與 H2O2 有關(guān)。另外，本試驗(yàn)條件下，只有部分生長素（17個(gè)）和細(xì)胞周期（19個(gè)）基因的表達(dá)受 MAPK 信號(hào)級(jí)聯(lián)調(diào)控，其余基因的表達(dá)無明顯變化，說明在調(diào)節(jié)水稻根系生長過程中還存在其他信號(hào)途徑，如 ROS 信號(hào)途徑[15]。綜上所述，MAPK 信號(hào)級(jí)聯(lián)可能通過調(diào)節(jié) H2O2 產(chǎn)生和生長素平衡及細(xì)胞周期基因的表達(dá)參與了水稻根系生長的調(diào)控（圖6）。

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