弗林蛋白酶抑制劑對(duì)乳腺癌細(xì)胞MCF-7遷移的影響*

任京力， 史 齊 ， 孫明振， 宋國(guó)華， 馬永超

(漯河醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校 1醫(yī)學(xué)生物工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 2藥學(xué)系藥理學(xué)教研室， 4生物化學(xué)教研室，河南 漯河 462000；3新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院病理教研室，河南 新鄉(xiāng) 453000)

弗林蛋白酶抑制劑對(duì)乳腺癌細(xì)胞MCF-7遷移的影響*

任京力1, 2△， 史 齊3， 孫明振2， 宋國(guó)華1， 馬永超4

(漯河醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校1醫(yī)學(xué)生物工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，2藥學(xué)系藥理學(xué)教研室，4生物化學(xué)教研室，河南 漯河 462000；3新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院病理教研室，河南 新鄉(xiāng) 453000)

目的： 探討乳腺癌轉(zhuǎn)移的機(jī)制，為深入研究乳腺癌發(fā)生、發(fā)展機(jī)制提供理論基礎(chǔ)。方法: 不同濃度的弗林蛋白酶(furin)抑制劑處理人乳腺癌細(xì)胞MCF-7 48 h。細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)(wound healing assay)和細(xì)胞趨化實(shí)驗(yàn)(Transwell assay)檢測(cè)MCF-7細(xì)胞遷移和侵襲能力。Western blotting 檢測(cè)細(xì)胞遷移相關(guān)蛋白膜型基質(zhì)金屬蛋白酶1(MT1-MMP)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)-C和VEGF-D水平。酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)液中基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)2和9水平。結(jié)果: 與對(duì)照組相比，200 nmol/L的furin抑制劑α1-PDX即對(duì)細(xì)胞遷移及侵襲起顯著抑制作用(均P<0.05)；細(xì)胞遷移相關(guān)的MT1-MMP、VEGF-C和VEGF-D表達(dá)水平均顯著降低(P<0.05)；MCF-7細(xì)胞上清液中MMP2 和 MMP9的表達(dá)均顯著降低(P<0.05)。結(jié)論: Furin抑制劑通過(guò)下調(diào)乳腺癌細(xì)胞MCF-7的MMPs及VEGFs表達(dá)抑制其遷移。

弗林蛋白酶抑制劑； 乳腺腫瘤； 基質(zhì)金屬蛋白酶； 血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子

前蛋白轉(zhuǎn)化酶家族的生物學(xué)及其與疾病的關(guān)系一直受到廣泛關(guān)注。弗林蛋白酶(furin)是蛋白前體加工酶家族中的重要成員，其與腫瘤細(xì)胞生物學(xué)特性的關(guān)系是腫瘤研究的重要領(lǐng)域。Furin在細(xì)胞定位于反面高爾基體囊膜、內(nèi)體和細(xì)胞表面。細(xì)胞內(nèi)許多重要的多肽與蛋白質(zhì)激素的合成與分泌、膜受體的成熟、血漿蛋白前體的激活等過(guò)程需要furin的參與，這些蛋白質(zhì)在發(fā)揮活性之前需要經(jīng)過(guò)蛋白轉(zhuǎn)化酶對(duì)蛋白前體切割，然后才能成為有功能的蛋白質(zhì)[1]。包括Notch、Wnt、膜型基質(zhì)金屬蛋白酶1(membrane-type 1 matrix metalloproteinase，MT1-MMP)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)在內(nèi)的許多與腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)的蛋白質(zhì)在體內(nèi)成熟過(guò)程中，必須經(jīng)過(guò)furin等蛋白轉(zhuǎn)化酶對(duì)其前體進(jìn)行剪切，才能發(fā)揮生物學(xué)活性[2-3]。這些蛋白質(zhì)中部分成員與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。因此furin酶活性及其對(duì)底物剪切的調(diào)控應(yīng)該是腫瘤防治靶點(diǎn)。然而，綜合目前的研究，發(fā)現(xiàn)在不同的腫瘤，抑制furin的活性對(duì)腫瘤生物學(xué)行為的改變是不同的[4-5]。有關(guān)furin與乳腺癌轉(zhuǎn)移的關(guān)系目前還不清楚，我們當(dāng)前的研究為揭示furin在乳腺癌發(fā)生發(fā)展中的作用提供了理論依據(jù)。

材 料 和 方 法

1 細(xì)胞與試劑

人乳腺癌細(xì)胞系MCF-7購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院協(xié)和細(xì)胞庫(kù)，生長(zhǎng)在含有10%胎牛血清(FBS)、1×105U/L青霉素和100 mg/L鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基(Gibco)中，于37 ℃、 5% CO2飽和濕度下培養(yǎng)。Furin抑制劑α1-PDX(Merck)溶于DMSO中，制成5 mmol/L母液。鼠抗人VEGF-C、VEGF-D、MT1-MMP和GAPDH抗體均購(gòu)自Santa Cruz；抗鼠IgG-HRP和抗兔IgG-HRP購(gòu)自Sigma；MTT、Hoechst 33342和Transwell試劑購(gòu)自Promega；基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)2和MMP9 ELISA檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京建成生物試劑公司；其它試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

2 方法

2.1 單層細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)(wound healing assay) MCF-7細(xì)胞接種在6孔板，待生長(zhǎng)至融合度達(dá)100% 時(shí)，用無(wú)菌的200 μL的槍頭尖制成劃痕(wound)，并用PBS洗滌細(xì)胞碎片。細(xì)胞處理同前。在指定的時(shí)間用倒置顯微鏡配備的數(shù)碼相機(jī)拍攝受傷區(qū)域的細(xì)胞遷移情況。

2.2 Transwell侵襲實(shí)驗(yàn) 不同濃度α1-PDX處理的MCF-7細(xì)胞(1×105)接種于Transwell小室的上部腔室，含有200 μL的RPMI-1640培養(yǎng)基，但不含10% FBS。Transwell小室下部腔室被填充有500 μL的完整的RPMI-1640培養(yǎng)基，含10%FBS。使細(xì)胞遷移48 h，然后用4%甲醛將細(xì)胞固定，室溫下孵育15 min。去離子水洗滌后，0.1%結(jié)晶紫染色。在光學(xué)顯微鏡下拍攝遷移的克隆。

2.3 Western blotting 檢測(cè)細(xì)胞遷移相關(guān)蛋白表達(dá)水平 MCF-7細(xì)胞培養(yǎng)及處理同前。收集細(xì)胞加入RIPA緩沖液及蛋白酶抑制劑，冰上孵育30 min，13 200 r/min離心30 min。收集上清并用BCA法(Pierce)測(cè)定蛋白濃度。細(xì)胞總蛋白經(jīng)12%的SDS-PAGE分離后轉(zhuǎn)移到PVDF膜，室溫下5%脫脂牛奶封閉1 h。在4 ℃下孵育MT1-MMP、VEGF-C、VEGF-D和GAPDH(1∶1 000)的抗體過(guò)夜。PBST洗滌后加入HRP標(biāo)記的羊抗鼠Ⅱ抗，室溫下孵育1 h， PBST洗滌后，超敏發(fā)光液(Pierce)孵育后，LAS3000成像儀拍照。

2.4 ELISA MCF-7細(xì)胞處理同前所述，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清并根據(jù)MMP2和MMP9 ELISA檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行后續(xù)檢測(cè)。每個(gè)樣品重復(fù)5次。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 13.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 α1-PDX對(duì)MCF-7細(xì)胞遷移和侵襲的影響

為檢測(cè)α1-PDX是否對(duì)MCF-7細(xì)胞的遷移和侵襲有調(diào)節(jié)作用，我們用wound healing和Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了MCF-7細(xì)胞遷移的情況。2種實(shí)驗(yàn)結(jié)果均表明α1-PDX顯著降低了MCF-7細(xì)胞遷移和侵襲能力，見(jiàn)圖1、2。

Figure 1.The effects of α1-PDX on the migration of MCF-7 cells. A: original imaging of wounding healing assay upon stimuli of different concentrations of α1-PDX at different time points (×100); B: statistical analysis of the effects of α1-PDX on the migration of MCF-7 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vs0 h.

圖1 α1-PDX對(duì)MCF-7細(xì)胞遷移的影響

Figure 2.The effects of α1-PDX on the invasion ability of MCF-7 cells (crystal violet staining，×100). A: control group; B: MCF-7 cells treated with 200 nmol/L α1-PDX for 48 h; C: MCF-7 cells treated with 400 nmol/L α1-PDX for 48 h； D: statistical analysis of the effects of α1-PDX on the invasion ability of MCF-7 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05，**P<0.01vscontrol.

圖2 不同濃度α1-PDX對(duì)MCF-7細(xì)胞侵襲能力的影響

2 α1-PDX對(duì)細(xì)胞遷移相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

許多蛋白質(zhì)在體內(nèi)參與腫瘤細(xì)胞遷移的調(diào)節(jié)。為充分了解α1-PDX調(diào)節(jié)MCF-7細(xì)胞遷移的分子機(jī)制，我們通過(guò)Western blotting和ELISA法檢測(cè)了細(xì)胞MT1-MMP、MMP2、MMP9、VEGF-C和VEGF-D蛋白表達(dá)水平。如圖3所示，α1-PDX顯著降低了細(xì)胞內(nèi)MT1-MMP、VEGF-C和VEGF-D的表達(dá)。同時(shí)細(xì)胞培養(yǎng)液上清中MMP2和MMP9濃度也明顯低于對(duì)照組，見(jiàn)圖4。這些結(jié)果表明，α1-PDX抑制MCF-7細(xì)胞遷移可能與降低MT1-MMP、MMP2、MMP9、VEGF-C和 VEGF-D的表達(dá)有關(guān)。

Figure 3.The effects of α1-PDX on the expression of cell migration-associated proteins MT1-MMP, VEGF-C and VEGF-D. A: original Western blotting showing the protein expression of MT1-MMP, VEGF-C and VEGF-D upon treatment with different concentrations of α1-PDX for 48 h; B: statistical analysis of the protein expression levels of MT1-MMP, VEGF-C and VEGF-D upon treatment with different concentrations of α1-PDX for 48 h. Mean±SD.n=3.*P<0.05，**P<0.01vscontrol.

圖3 α1-PDX對(duì)遷移相關(guān)蛋白MT1-MMP、 VEGF-C及VEGF-D表達(dá)的影響

Figure 4.The effects of α1-PDX on the protein levels of MMP9 (A) and MMP2 (B) in the supernatant of MCF-7 cells. Mean±SD.n=5.*P<0.05vscontrol.

圖4 α1-PDX對(duì)MCF-7細(xì)胞上清液中MMP9和MMP2水平的影響

討 論

乳腺癌是女性最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，其死亡率僅次于肺癌而位居第二，我國(guó)雖是乳腺癌低發(fā)區(qū)，但其發(fā)病率也正逐年上升[5]，在大城市中已經(jīng)接近歐美國(guó)家的發(fā)病水平，故對(duì)乳腺癌的研究越來(lái)越受到重視。晚期乳腺癌患者中，最常見(jiàn)的并發(fā)癥為骨、肺和肝等轉(zhuǎn)移。隨著對(duì)乳腺癌生物學(xué)行為研究的不斷深入，目前認(rèn)為乳腺癌發(fā)病就是全身性疾病，其主要的死亡原因是遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，最常見(jiàn)的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移部位是骨骼[6]。因而進(jìn)行深入研究乳腺癌侵襲和轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制很有必要。

Furin在腫瘤進(jìn)展中發(fā)揮重要作用，可以作為腫瘤進(jìn)展過(guò)程中的分子標(biāo)記，在某種程度上可以作為腫瘤預(yù)后的指標(biāo)[7]。許多與腫瘤密切相關(guān)的蛋白成熟需經(jīng)過(guò)furin蛋白的剪切加工。所以，furin活性及其與底物蛋白相互作用的調(diào)節(jié)可以作為腫瘤治療的靶點(diǎn)。抑制furin活性對(duì)抑制腫瘤的遷移和侵襲有積極作用。弗林蛋白酶抑制劑α1-PDX為目前常用的furin抑制劑。α1-PDX為一生物工程重組的α1-蛋白酶突變體，其特殊之處是在其活性位點(diǎn)環(huán)中有一段單一最小弗林蛋白酶共享序列(Arg355-Ile-Pro-Arg358)，起到抑制furin活性的作用。

在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)，furin抑制劑α1-PDX可誘導(dǎo)MCF-7細(xì)胞增殖抑制和凋亡。此外，我們還發(fā)現(xiàn)， MCF-7細(xì)胞經(jīng)α1-PDX孵育后，遷移能力顯著降低。但具體的分子機(jī)制不清楚。腫瘤轉(zhuǎn)移是一個(gè)復(fù)雜的多步驟的過(guò)程。許多蛋白分子參與腫瘤轉(zhuǎn)移的過(guò)程。眾所周知，腫瘤細(xì)胞外基質(zhì)消化是腫瘤最常見(jiàn)的侵襲和轉(zhuǎn)移的前提條件，腫瘤細(xì)胞分泌的MMPs可以降解所有的細(xì)胞外基質(zhì)的重要組成部分[8-9]。因此，這些基質(zhì)金屬蛋白酶的表達(dá)水平可有效反映腫瘤細(xì)胞的侵襲能力。已經(jīng)證明在許多類型的腫瘤中基質(zhì)金屬蛋白酶MMP2和MMP9降解基底膜是促進(jìn)腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移關(guān)鍵的步驟[10]。MT1-MMP參與激活MMP2和MMP13，降解細(xì)胞周圍基質(zhì)[11]。

在我們當(dāng)前的研究中，α1-PDX不僅能抑制MMP2和MMP9的表達(dá)，而且能降低MT1-MMP的表達(dá)。由于MT1-MMP是furin的底物，MT1-MMP在成熟前需要furin對(duì)前體進(jìn)行剪切[1]。α1-PDX降低了furin酶活性，進(jìn)而降低了MT1-MMP 成熟及激活，進(jìn)一步抑制了MMP2和MMP9的成熟。

VEGF調(diào)節(jié)腫瘤的轉(zhuǎn)移和血管生成[12]。VEGF-C和VEGF-D的表達(dá)增強(qiáng)可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞淋巴轉(zhuǎn)移，已經(jīng)被認(rèn)為是幾種類型癌癥的一個(gè)預(yù)后指標(biāo)[12]。VEGF-C和VEGF-D 的成熟、激活需要furin對(duì)其前體進(jìn)行剪切[1]。所以，我們同時(shí)檢測(cè)了α1-PDX處理后細(xì)胞VEGF-C和VEGF-D的表達(dá)。結(jié)果表明α1-PDX處理的細(xì)胞VEGF-C和VEGF-D蛋白表達(dá)顯著減少。

總之，這些結(jié)果表明，下調(diào)furin的活性，從而抑制MCF-7細(xì)胞MMPs和VEGFs蛋白的表達(dá)可能是其抑制MCF-7細(xì)胞生長(zhǎng)、侵襲的機(jī)制。Furin抑制劑對(duì)其它腫瘤細(xì)胞遷移抑制作用的研究已經(jīng)引起人們的重視[13-14]。但在不同的腫瘤細(xì)胞系中的作用是不一樣的，甚至是相反的[4-5]，因此，furin抑制劑在腫瘤中的作用研究?jī)H僅是個(gè)開(kāi)始，還有很多的未知機(jī)制需要深入研究。

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Effects of furin inhibitor on metastasis of human breast cancer MCF-7 cells

REN Jing-li1, 2, SHI Qi3, SUN Ming-zhen2, SONG Guo-hua1, MA Yong-chao4

(1KeyLaboratoryofMedicalBioengineering，2DepartmentofPharmacology，F(xiàn)acultyofPharmacy，4DepartmentofBiochemistry,LuoheMedicalcollege，Luohe462000,China;3DepartmentofPathology,XinxiangMedicalUniversity,Xinxiang453000,China.E-mail:renjimmy@sina.com)

AIM: To investigate the mechanism underlying breast cancer metastasis and to provide theoretical data for studying the pathogenesis of breast cancer onset and development. METHODS: Human breast cancer MCF-7 cells were treated with different concentrations of furin inhibitor α1-PDX for 48 h. Wound healing assay and Transwell assay were applied to detect the migration and invasion abilities of the MCF-7 cells. The expression of cell migration-associated proteins, including membrane-type 1 matrix metalloproteinase (MT1-MMP), vascular endothelial growth factor (VEGF)-C and VEGF-D， was determined by Western blotting. The protein levels of MMP2 and MMP9 in the supernatant were measured by ELISA. RESULTS: Compared with control group, 200 nmol/L of furin inhibitor exerted significant inhibitory effects on the cell migration (P<0.05). The expression of cell migration-associated proteins MT1-MMP, VEGF-C and VEGF-D was significantly inhibited after treated with α1-PDX (P<0.05). Significant inhibitory effects of α1-PDX on the expression of MMP9 and MMP2 (P<0.05) in the supernatant were observed. CONCLUSION: Furin inhibitor suppresses the metastasis of MCF-7 cells via down-regulating the expression of MMPs and VEGFs.

Furin inhibitors; Breast neoplasms; Matrix metalloproteinases; Vascular endothelial growth factors

1000- 4718(2014)12- 2267- 05

2014- 07- 17

2014- 09- 04

河南省高校科技創(chuàng)新人才支持計(jì)劃資助項(xiàng)目(No. 2012HASTIT038)

R73-3

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2014.12.027

△通訊作者 Tel: 0395-3115098； E-mail: renjimmy@sina.com