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    半枝蓮黃酮對復合Aβ25-35引起線粒體膜Bcl-2、Bax、Bcl-xL及Bak異常的干預(yù)作用*

    2014-07-18 11:55:25趙泓翔崔亞迪吳曉光商亞珍
    中國病理生理雜志 2014年12期
    關(guān)鍵詞:皮層黃酮線粒體

    趙泓翔, 郭 可, 崔亞迪, 吳曉光, 商亞珍

    (承德醫(yī)學院中藥研究所,河北省中藥研究與開發(fā)重點實驗室,河北省中醫(yī)藥抗癡呆重點研究室,河北 承德 067000)

    半枝蓮黃酮對復合Aβ25-35引起線粒體膜Bcl-2、Bax、Bcl-xL及Bak異常的干預(yù)作用*

    趙泓翔, 郭 可, 崔亞迪, 吳曉光, 商亞珍△

    (承德醫(yī)學院中藥研究所,河北省中藥研究與開發(fā)重點實驗室,河北省中醫(yī)藥抗癡呆重點研究室,河北 承德 067000)

    目的: 探討半枝蓮黃酮(SBF)對大鼠腦室注射β-淀粉樣蛋白25-35(Aβ25-35)結(jié)合三氯化鋁(AlCl3)及重組人轉(zhuǎn)化生長因子β1(rhTGF-β1)(復合Aβ25-35)引起的皮層細胞線粒體膜凋亡相關(guān)蛋白異常的干預(yù)作用。方法: 雄性SD大鼠手術(shù)當天腦室注射10 ng rhTGF-β1,手術(shù)第2天開始腦室分別于上午注射Aβ25-35(4 μg/d,連續(xù)注射14 d)、下午注射1% AlCl3(3 μL/d ,連續(xù)注射5 d)建立神經(jīng)損傷模型。術(shù)后第49天模型成功大鼠隨機分為模型對照組和3個劑量SBF組。藥物組大鼠分別連續(xù)灌胃 SBF (35、70和140 mg/kg)36 d,每日1次。大鼠末次給藥60 min后斷頭處死,蛋白印跡法測定各組大鼠皮層細胞線粒體膜Bcl-2、Bax、Bcl-xL和Bak的蛋白表達水平。結(jié)果: 大鼠腦室注射復合Aβ25-35可使大鼠皮層細胞線粒體膜Bcl-2和Bcl-xL蛋白表達水平明顯降低(P<0.05),使Bax和Bak蛋白表達水平明顯增加(P<0.01)。然而,35、70和140 mg/kg SBF灌胃36 d,可以不同程度地逆轉(zhuǎn)復合Aβ25-35所致上述改變。結(jié)論: 腦室注射Aβ25-35聯(lián)合AlCl3和rhTGF-β1可引起線粒體膜凋亡因子Bcl-2、Bax、Bcl-xL和Bak異常改變,SBF能夠逆轉(zhuǎn)上述凋亡因子異常改變。

    半枝蓮黃酮; β-淀粉樣蛋白25-35; 三氯化鋁; 重組人類轉(zhuǎn)化生長因子-β1; 線粒體凋亡通路

    目前,神經(jīng)退行性疾病已成為臨床上常見的疾病,神經(jīng)細胞凋亡的加劇被認為是該病主要的現(xiàn)象之一[1]。細胞凋亡是機體正常細胞在受到生理或病理刺激后出現(xiàn)的自發(fā)性死亡,是一個高度有序的、主動的、由基因控制和多種酶參與的程序化死亡過程[2]。研究表明,異常的細胞凋亡與很多疾病如炎癥、腫瘤和神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[3]。根據(jù)細胞凋亡的啟動,細胞凋亡分為線粒體凋亡通路、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)凋亡通路和死亡受體通路。線粒體凋亡通路是細胞凋亡中一條非常重要的通路,凋亡刺激通過線粒體膜上的一系列凋亡因子產(chǎn)生級聯(lián)反應(yīng),引起細胞凋亡,特別是Bcl-2家族中抑凋亡因子Bcl-2、Bcl-xL及促凋亡因子Bax、Bak異常表達在疾病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要作用[4-5]。

    經(jīng)過長期的研究發(fā)現(xiàn),Aβ具有較強的神經(jīng)毒性,腦室投放Aβ肽段可以誘發(fā)動物神經(jīng)病理學改變,包括神經(jīng)細胞凋亡[6]。如果結(jié)合鋁和重組人轉(zhuǎn)化生長因子β1(recombinant human transforming growth factor β1, rhTGF-β1)建立多因素神經(jīng)損傷,更能較全面模擬臨床神經(jīng)病變病人的病理生理特征[7-8]。半枝蓮黃酮(Scutellariabarbataflavonoids,SBF)是從半枝蓮(ScutellariabarbataD. Don)地上部分分離的黃酮類化合物,以野黃芩苷為主。已經(jīng)發(fā)現(xiàn),SBF具有解熱、抗菌、抗突變和抗氧化等多種功效,對去勢大鼠記憶障礙、神經(jīng)內(nèi)分泌及腦內(nèi)自由基異常變化以及Aβ25-35對星形膠質(zhì)細胞的損害具有明顯的治療作用[9-11],但對Aβ25-35聯(lián)合AlCl3和rhTGF-β1(復合Aβ25-35)引起動物神經(jīng)損害、特別是線粒體凋亡通路中線粒體膜上的凋亡因子的影響尚未見報道。本實驗利用大鼠腦室注射Aβ25-35聯(lián)合AlCl3和rhTGF-β1建立神經(jīng)損害模型,探討SBF對復合Aβ模型大鼠皮層細胞線粒體膜凋亡因子Bcl-2、Bax、Bak和Bcl-xL異常變化的干預(yù)結(jié)果。

    材 料 和 方 法

    1 實驗動物與藥品

    清潔級健康Sprague-Dawley(SD)雄性大鼠(合格證編號:90912)體重300~350 g,由河北醫(yī)科大學實驗動物中心提供。飼養(yǎng)于承德醫(yī)學院實驗動物中心,手術(shù)前適應(yīng)性飼養(yǎng)1周,自由進食,12 h光照明/暗交替。半枝蓮黃酮由本實驗室制備;兔抗大鼠Bcl-2、Bax、Bcl-xL和Bak多克隆抗體由武漢博士德生物工程有限公司提供;Aβ25-35由上海強耀生物科技有限公司提供;線粒體/胞漿制備試劑盒 C1260購于北京普利來基因技術(shù)有限公司,其它試劑購于試劑商店。

    2 方法

    2.1 動物模型的建立 300~350 g健康雄性SD大鼠,實驗室適應(yīng)性飼養(yǎng)1周,術(shù)前禁食12小時。腹腔注射10%水合氯醛 (300 mg/kg) 麻醉,常規(guī)消毒,固定于大鼠腦立體定位儀,顱頂正中矢狀切開,暴露硬腦膜,標記前鹵點位置。參照包新民編著《大鼠腦立體定位圖譜》,以前鹵點為坐標原點,于前鹵點后2.0 mm、矢狀縫右側(cè)旁開1.4 mm、深4.6 mm確認丘腦背側(cè)核位置。于前鹵點后1.2 mm、矢狀縫左側(cè)旁開2.0 mm、深4.0 mm確認側(cè)腦室位置,三棱錐鉆一直徑為0.2 mm孔,埋置導管,用硫酸鋅水門汀固定導管。模型對照組側(cè)腦室給藥Aβ25-3514 d,AlCl35 d,給藥速度為1 μL/min,假手術(shù)對照組給予等體積生理鹽水,首次注射時在丘腦前背側(cè)核注入rhTGF-β110 ng??p合傷口,常規(guī)飼養(yǎng)。術(shù)后3 d內(nèi)肌肉注射青霉素每日1次,1次1×105U。歸籠飼養(yǎng),在手術(shù)第45天利用Morris水迷宮進行4 d的大鼠記憶障礙模型篩選,以第4天水迷宮篩選成績計算,模型對照組大鼠篩選率大于0.2,即為模型成功大鼠,本實驗?zāi)P统晒β?94.7%。有關(guān)大鼠學習、記憶研究將另文報道。

    2.2 實驗動物分組、給藥及樣品制備 在手術(shù)第 49 天,模型成功大鼠隨機分4組,模型對照組和3劑量藥物組,藥物組大鼠連續(xù)用SBF灌胃(每日劑量為35、70和140 mg/kg)36 d,模型對照組和假手術(shù)對照組大鼠給予等體積的生理鹽水。大鼠手術(shù)第85天,即給藥第36天,所有大鼠在給藥60 min后乙醚麻醉,斷頭處死,冰上分離大腦皮層放在1.5 mL無RNA酶的EP管中,凍存于-80 ℃超低溫冰柜中備用。

    2.3 Western blotting檢測大鼠皮層細胞線粒體膜上Bcl-2、Bax、Bcl-xL和Bak的測定 200 mg皮層組織與1.5 mL Mito Solution反復研磨,800 ×g4℃ 離心5 min,取上清12 000×g4 ℃ 再離心10 min,此時上清液為細胞的胞液成分,在管底的沉淀即為線粒體。

    將得到的線粒體加入0.2 mL Mito Solution進行洗滌,12 000×g4 ℃ 離心10 min,棄上清,沉淀加RIPA裂解液,得到線粒體液,利用BCA法測定線粒體蛋白濃度。樣品與上樣buffer混勻,95 ℃ 加熱使蛋白變性,根據(jù)測定的蛋白濃度每孔上樣50 μg,10% SDS-PAGE分離蛋白約1.5 h,轉(zhuǎn)移至PVDF膜封閉2 h。在Ⅰ抗Bcl-2、Bax、Bcl-xL和Bak稀釋液中孵育PVDF膜2 h,TBST洗后置于Ⅱ抗稀釋液孵育1 h,TBST洗后蛋白印跡顯影,膠片掃描后,采用Quantity One 軟件對顯影條帶進行分析,計算Bcl-2、Bax、Bcl-xL和Bak條帶與β-actin條帶的體積比和光密度比值,作為它們的蛋白相對表達量。

    3 統(tǒng)計學處理

    數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(mean±SD)表示,使用統(tǒng)計學軟件SPSS 17.0進行統(tǒng)計學分析,組間均數(shù)比較采用單因素方差分析,兩兩比較采用SNK-q檢驗,以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

    結(jié) 果

    1 半枝蓮黃酮對復合Aβ25-35所致大鼠皮層細胞線粒體膜上Bcl-2蛋白表達的影響

    圖1顯示,與假手術(shù)組相比,模型組大鼠皮層細胞線粒體膜上Bcl-2蛋白表達明顯降低(P<0.01)。然而劑量為35、70和140 mg/kg的SBF不同程度地增加了大鼠皮層細胞線粒體膜上Bcl-2的蛋白表達,與模型組相比,SBF 70和140 mg/kg組的Bcl-2蛋白表達量顯著增加(P<0.05或P<0.01)。

    Figure 1.The effect of SBF on Bcl-2 protein relative expression level in the cerebral cortex cell mitochondria of the rats treated with composite Aβ25-35.Mean±SD.n=3.##P<0.01vssham;*P<0.05,**P<0.01vsmodel.

    圖1 SBF對注射復合Aβ25-35大鼠的皮層細胞線粒體膜上Bcl-2蛋白表達的影響

    2 半枝蓮黃酮對復合Aβ25-35所致大鼠皮層細胞線粒體膜上Bax蛋白表達的影響

    圖2顯示,與假手術(shù)組比較,模型組大鼠皮層細胞線粒體膜上Bax的蛋白表達明顯增加(P<0.01)。然而,劑量為 35、70和140 mg/kg的SBF能顯著降低復合Aβ25-35所致的大鼠皮層細胞線粒體膜上Bax蛋白表達量的升高(P<0.05或P<0.01)。

    Figure 2.The effect of SBF on Bax protein relative expression level in the cerebral cortex cell mitochondria of the rats treated with composite Aβ25-35. Mean±SD.n=3.##P<0.01vssham;*P<0.05,**P<0.01vsmodel.

    圖2 SBF對注射復合Aβ25-35大鼠的皮層細胞線粒體膜上Bax蛋白表達的影響

    3 半枝蓮黃酮對復合Aβ25-35所致大鼠皮層細胞線粒體膜上Bcl-xL蛋白表達異常的影響

    圖3顯示,與假手術(shù)組相比,(P<0.01)。然而,劑量為 35、70和140 mg/kg的SBF能顯著增加注射復合Aβ25-35大鼠皮層細胞線粒體膜上Bcl-xL蛋白的表達量(P<0.05或P<0.01)。

    4 半枝蓮黃酮對復合Aβ25-35所致大鼠皮層細胞線粒體膜上Bak蛋白表達異常的影響

    與假手術(shù)組相比,模型組大鼠皮層中Bak蛋白的表達明顯增加(P<0.01)。然而,劑量為35、70和140 mg/kg的SBF顯著降低注射復合Aβ25-35大鼠皮層細胞線粒體膜上Bak蛋白的表達量(P<0.01),見圖4。

    討 論

    流行病調(diào)查顯示,隨著全球人類的老齡化,神經(jīng)退行性病人日益增多,而神經(jīng)細胞凋亡性病理改變是這些病人神經(jīng)病變主要的特征性改變之一[12]。細胞凋亡又稱為細胞程序化死亡,是一個高度主動有序、多個基因和蛋白因子參與調(diào)控的正常的生理活動過程[13]。然而,當細胞遭受病理性刺激后,細胞凋

    Figure 3.The effect of SBF on Bcl-xL protein relative expression level in the cerebral cortex cell mitochondria of the rats treated with composite Aβ25-35. Mean±SD.n=3.##P<0.01vssham;*P<0.05,**P<0.01vsmodel.

    圖3 SBF對注射復合Aβ25-35大鼠的皮層細胞線粒體膜上Bcl-xL蛋白表達的影響

    Figure 4.The effect of SBF on Bak protein relative expression level in the cerebral cortex cell mitochondria of the rats treated with composite Aβ25-35. Mean±SD.n=3.##P<0.01vssham;**P<0.01vsmodel.

    圖4 SBF對注射復合Aβ25-35大鼠的皮層細胞線粒體膜上Bak蛋白表達的影響

    亡就會異常加劇,而異常的細胞凋亡與一系列疾病包括神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[14-15]。

    在神經(jīng)系統(tǒng)中,神經(jīng)細胞凋亡是神經(jīng)元丟失的重要原因,Aβ蛋白可以引起神經(jīng)細胞內(nèi)鈣離子失衡,而鈣離子超載與線粒體途徑凋亡有密切關(guān)系。線粒體凋亡路徑為Aβ誘導神經(jīng)細胞凋亡的主要途徑,其中Aβ可引起線粒體的損害和相關(guān)凋亡蛋白的改變。眾所周知,線粒體是機體能量的動力工廠,線粒體的狀態(tài)是否正常直接調(diào)控著細胞的死亡模式,而線粒體通路中相關(guān)凋亡因子在疾病發(fā)生、發(fā)展以及藥物作用研究中發(fā)揮重要作用。線粒體膜上存在著多種與細胞凋亡相關(guān)的重要蛋白因子,Bcl-2家族成員Bcl-2、Bax、Bak、Bcl-xL等嚴格控制著線粒體外膜的通透性,調(diào)控細胞色素C(cytochrome C,Cyt-C)的釋放和細胞凋亡[16]。Bcl-2和Bax是線粒體外膜上一對相互拮抗的細胞凋亡因子,Bcl-2是抗細胞凋亡因子,它能夠降低線粒體膜的通透性,抑制Cyt-C的釋放;Bax是促細胞凋亡因子,正常情況下Bax是以單體形式存在于線粒體膜上,當細胞接受凋亡信號時,Bax則形成二聚體促進Cyt-C的釋放,同時Bcl-2能夠抑制Bax的構(gòu)象改變,阻止Bax二聚體的形成而減少Cyt-C 的釋放。Bak與Bcl-xL是線粒體外膜上又一對互相拮抗的凋亡因子,Bak促進細胞凋亡,Bcl-xL抑制細胞凋亡,Bak和Bcl-xL也是通過影響線粒體外膜的通透性來調(diào)節(jié)Cyt-C釋放,當Bak占優(yōu)勢時Cyt-C自線粒體釋放。當細胞色素C一旦從線粒體釋放到胞液中,Cyt-C則與凋亡蛋白酶激活因子1(apoptosis protease-activated factor-1,Apaf-1)和caspase-9相互作用,從而激活caspase-3,導致細胞凋亡[17]。

    在細胞線粒體凋亡通路中,DNA被降解為片段也是細胞凋亡常見的結(jié)果[18]。有人認為在神經(jīng)退行性病人中最初可能是DNA損傷,然后出現(xiàn)Bcl-2和Bax調(diào)控的改變,直至細胞死亡丟失。更有報道在神經(jīng)元和小膠質(zhì)細胞中均發(fā)現(xiàn)Bax的表達,表明Bax可能是神經(jīng)元死亡的早期事件[19]。體外研究發(fā)現(xiàn),Aβ能上調(diào)Bak的表達,下調(diào)Bcl-xL的表達;體內(nèi)動物實驗發(fā)現(xiàn),Aβ使腦內(nèi)Bak表達增強,使Bcl-xL的表達減少或者沒有明顯影響[20],故推測Aβ可能通過促進Bak的表達來改變Bak/Bcl-xL之間的平衡,而誘導細胞凋亡。在內(nèi)源性凋亡途徑中,Bcl-2和Bcl-xL可直接在線粒體外膜上形成一種陽離子通道和穩(wěn)定的膜電位,該通道抑制Cyt-C的釋放。Bax和Bak在線粒體外膜上通過空間構(gòu)象的改變形成的通道是一種陰離子通道,而該通道促進Cyt-C的釋放,這樣抗凋亡因子和促凋亡因子在線粒體膜上形成的通道對Cyt-C的釋放起相反的調(diào)控作用[21]。進一步實質(zhì)性的研究發(fā)現(xiàn),線粒體Cyt-C的釋放是通過膜滲透性轉(zhuǎn)變孔道復合物(permeability transition pore complex, PTPC)來完成的,Bcl-2家族的凋亡因子直接調(diào)節(jié)著PTPC,而PTPC是一種大分子多蛋白復合體,其大部分組件是電壓依從性陰離子通道,線粒體膜上促凋亡因子Bax和Bak能夠直接打開脂質(zhì)體電壓依從性陰離子通道,消除線粒體膜電位,促進Cyt-C的釋放;線粒體膜上抗凋亡因子Bcl-2和Bcl-xL能夠穩(wěn)定膜電位,阻止Cyt-C的釋放[22]。釋放的Cyt-C進一步激活其下游凋亡因子,直至激活最終效應(yīng)因子caspase-3而導致細胞凋亡。

    細胞凋亡特別是線粒體凋亡通路介導的細胞凋亡直接參與了神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生發(fā)展,因此,任何能夠抑制細胞凋亡的手段,都有利于這些疾病的治療。本研究利用腦室注射Aβ25-35聯(lián)合AlCl3和rhTGF-β1建立多因素神經(jīng)損傷模型,探討大鼠皮層細胞線粒體膜上Bcl-2、Bax、Bcl-xL和Bak的變化以及SBF干預(yù)的作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn),與假手術(shù)大鼠相比,腦室注射復合Aβ25-35大鼠皮層細胞線粒體膜上Bcl-2和Bcl-xL的蛋白表達明顯降低、Bax和Bak的蛋白表達明顯增加。Bcl-2/Bax和Bcl-xL/Bak這兩對作用相反的細胞凋亡因子共同促進Cyt-C的釋放,激活其下游的一系列凋亡因子,引發(fā)細胞凋亡。然而,SBF灌胃模型大鼠36 d明顯翻轉(zhuǎn)由復合Aβ25-35所致皮層細胞線粒體膜上Bcl-2、Bcl-xL、Bax和Bak蛋白表達的異常,穩(wěn)定線粒體凋亡通路相關(guān)凋亡因子,抑制Cyt-C的釋放,從而抑制細胞凋亡。

    本實驗室以往的研究已經(jīng)證明,SBF能顯著改善去卵巢大鼠學習記憶障礙及免疫、內(nèi)分泌異常,調(diào)節(jié)腦內(nèi)自由基系統(tǒng),SBF這些作用源于它是黃酮類化合物,具有多羥基結(jié)構(gòu)和較強的還原性,可通過自身氧化阻止膜脂質(zhì)結(jié)構(gòu)過氧化,保證了包括線粒體在內(nèi)膜結(jié)構(gòu)的完整性和通透性。結(jié)合以往的研究,本實驗提示,SBF改善復合Aβ25-35所致皮層細胞線粒體膜Bcl-2、Bax、Bcl-xL和Bak蛋白異常表達與其對線粒體膜結(jié)構(gòu)的保護密切相關(guān),而線粒體結(jié)構(gòu)與功能以及線粒體凋亡通路的正常調(diào)節(jié)都參與了SBF 抗細胞凋亡的過程。本研究為SBF可用于神經(jīng)退行性疾病的治療提供了實驗依據(jù)。

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    Effect ofScutellariabarbataflavonoids on abnormal changes of Bcl-2, Bax, Bcl-xL and Bak protein expression in mitochondrial membrane induced by composite Aβ25-35

    ZHAO Hong-xiang, GUO Ke, CUI Ya-di, WU Xiao-guang, SHANG Ya-zhen

    (InstituteofTraditionalChineseMedicine,ChengdeMedicalCollege,HebeiProvinceKeyLaboratoryofTraditionalChineseMedicineResearchandDevelopment,HebeiProvincialResearchOfficeofTraditionalChineseMedicineAgainstDementia,Chengde067000,China.E-mail:shangyz1018@sina.com)

    AIM: To study the abnormalities of Bcl-2, Bax, Bcl-xL and Bax in the cell mitochondrial membrane of cerebral cortex in the rats injected with β-amyloid beta protein 25-35 (Aβ25-35) in combination with aluminum trichloride (AlCl3) and recombinant human transforming growth factor β1(rhTGF-β1) (composite Aβ25-35) into lateral cerebral ventricle, and to explore the intervention ofScutellariaBarbataflavonoids (SBF). METHODS: The male SD rats were used to establish the neuronal damaged model by receiving injection of rhTGF-β1 1 μL (10 ng) on day 1 of operation, and then from day 2 of operation, intracerebroventricular injection of Aβ25-35(4 μg/d, consecutive 14 d) in the morning and 1% AlCl3in the afternoon (3 μL/d, consecutive 5 d). On the day 49 of operation, the successful model rats were randomly divided into model control and 3 doses of SBF groupss. The rats in SBF groups were daily orally administered with SBF at doses of 35, 70 and 140 mg/kg for 36 d. All the rats were decapitated 60 min after the last administration. The protein expression of Bcl-2, Bax, Bcl-xL and Bak in rat cerebral cortex cell mitochondrial membrane was detected by Western blotting. RESULTS: The composite Aβ25-35dramatically caused decreases in Bcl-2 and Bcl-xL (P<0.05), and increases in Bax and Bak (P<0.01) in rat cerebral cortex cell mitochondrial membrane. However, oral treatment with SBF for 36 d reversed the above disorders induced by composite Aβ25-35. CONCLUSION: The composite Aβ25-35induces the expression abnormalities of Bcl-2, Bax, Bcl-xL and Bak in mitochondrial membrane and SBF reverses the above disturbances of apoptotic factors.

    Scutellariabarbata flavonoids; β-Amyloid beta protein 25-35; Aluminum trichloride; Recombinant human transforming growth factor β1; Mitochondrial apoptosis pathway

    1000- 4718(2014)12- 2262- 05

    2014- 06- 23

    2014- 09- 17

    河北省自然科學基金資助項目(No. C2009001007; No. H2014406048);河北省中醫(yī)藥管理局資助項目(No. 05027);河北省高校重點學科建設(shè)項目

    R363

    A

    10.3969/j.issn.1000- 4718.2014.12.026

    △通訊作者Tel: 0314-2290616; E-mail: shangyz1018@sina.com

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