大豆異黃酮對腦缺血/再灌注誘導的線粒體損傷和腦細胞凋亡的影響*

趙士弟， 陳 耀， 姜麗娜， 董銀鳳， 陳前芬△

(蚌埠醫(yī)學院 1病理生理學教研室， 2第一附屬醫(yī)院，安徽 蚌埠 233000)

大豆異黃酮對腦缺血/再灌注誘導的線粒體損傷和腦細胞凋亡的影響*

趙士弟1， 陳 耀2， 姜麗娜1， 董銀鳳1， 陳前芬1△

(蚌埠醫(yī)學院1病理生理學教研室，2第一附屬醫(yī)院，安徽 蚌埠 233000)

目的： 研究大豆異黃酮(SI)對全腦缺血/再灌注大鼠腦組織線粒體超微結(jié)構(gòu)、細胞凋亡和細胞色素C(Cyt-C)、caspase-3及caspase-9表達的影響，探討大豆異黃酮對腦缺血/再灌注損傷的作用及機制。方法: 60只健康成年SD 大鼠隨機分為假手術(shù)組(sham)、缺血再灌注組(I/R)和大豆異黃酮預(yù)處理組(SI)。SI組給予SI 120 mg·kg-1·d-1連續(xù)灌胃21 d，其余2組用等體積生理鹽水灌胃，每天1次，第22天I/R組和SI組行手術(shù)阻斷三血管制備全腦缺血/再灌注模型。缺血1 h，再灌1 h后處死，取大腦皮層，光鏡觀察腦細胞形態(tài)學變化，透射電鏡觀察線粒體超微結(jié)構(gòu)變化，流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡率，半定量RT-PCR法和免疫組織化學法測定腦組織中Cyt-C、caspase-9及caspase-3的表達。結(jié)果: I/R組線粒體膜崩解、嵴消失，腦細胞大量凋亡。與I/R組相比，大豆異黃酮預(yù)處理能明顯改善線粒體超微結(jié)構(gòu)的損傷，減少腦細胞凋亡率(P<0.01)。I/R組Cyt-C、caspase-9和caspase-3 mRNA的表達和蛋白的含量高于sham 組(P<0.01)，與I/R組相比，SI組Cyt-C、 caspase-9及caspase-3 mRNA 和蛋白的表達顯著降低(P<0.01)。結(jié)論: 大豆異黃酮可能通過穩(wěn)定線粒體結(jié)構(gòu)，減少線粒體釋放Cyt-C，降低caspase-9和caspase-3的表達，抑制細胞凋亡，從而減輕腦缺血/再灌注損傷。

大豆異黃酮； 缺血/再灌注； 細胞凋亡； 線粒體損傷； Caspase-9； Caspase-3

缺血性腦中風已成為成年患者致死或致殘的最常見原因之一。恢復(fù)血供是治療缺血腦組織的最有效方法，卻可誘發(fā)缺血的腦組織進一步損傷[1]。因此，探索缺血-再灌注損傷機制及尋找防治新途徑一直備受關(guān)注。流行病學研究表明：食用含黃酮類食物，尤其是異黃酮食物，與腦中風的發(fā)生率呈負相關(guān)[2]。大豆異黃酮(soybean isoflavones, SI)是大豆中的異黃酮類化合物的總稱，與雌激素具有相似的結(jié)構(gòu)與分子量，卻少有動物雌激素臨床上的一些毒負作用，被稱為“植物雌激素”，具有抗腫瘤、防治心血管疾病等生理活性[3]。近來研究發(fā)現(xiàn)，SI能提高腦缺血大鼠的抗氧化能力、減少缺血腦細胞線粒體釋放細胞色素C(cytochrome C，Cyt-C)、阻止腦細胞凋亡[4]，但SI對腦缺血再灌注誘導的腦皮層神經(jīng)元線粒體超微結(jié)構(gòu)及凋亡蛋白酶活性的變化報道較少。本研究利用SI預(yù)處理，觀察大鼠全腦缺血再灌注模型腦細胞形態(tài)及線粒體超微結(jié)構(gòu)變化、腦組織Cyt-C、caspase-9及caspase-3表達、腦細胞凋亡發(fā)生率等，探討SI對腦缺血再灌注損傷的保護作用及其機制。

材 料 和 方 法

1 材料、動物及分組

低溫離心機(Eppendorf)；TGradient梯度 PCR 儀(Biometra)； DY-A型電泳儀(上海生化所申華生化技術(shù)公司)；Tanon GIS-1000凝膠成像系統(tǒng)(上海天能科技有限公司)；JEM-1230透射電鏡；流式細胞儀(BD)。大豆異黃酮(陜西寶雞中藥飲片加工有限公司，純度40%)；Annexin V-FITC/PI試劑盒(晶美生物工程有限公司)；PCR試劑盒(Fermentas)；免疫組化試劑盒(北京博奧森生物技術(shù)有限公司)。

健康成年雄性SD大鼠60只，體重180～220 g，由蚌埠醫(yī)學院實驗動物中心供應(yīng)。實驗動物隨機分為假手術(shù)組(sham)、腦缺血再灌注組(I/R)和大豆異黃酮預(yù)處理組(SI)。

2 主要方法

2.1 動物給藥方法 用超純水配制成12 g/L的大豆異黃酮溶液，SI組按照120 mg/kg BW的劑量給予>大豆異黃酮灌胃，每天1次，連續(xù)21 d。Sham組和I/R組灌胃等體積的生理鹽水。

2.2 動物模型的制備 灌胃21 d后于第22天進行手術(shù)。Sham 組僅手術(shù)不缺血，I/R組及SI組術(shù)后用三血管阻斷法復(fù)制大鼠全腦缺血再灌注損傷模型[5]。取鼠稱重，10%水合氯醛(3.5 mL/kg) 腹腔注射麻醉，頸部正中切開，分離雙頸總動脈，暴露基底動脈，夾閉上述三支血管，監(jiān)測腦電圖(EEG)，EEG在幾秒內(nèi)成一直線時，全腦缺血模型復(fù)制成功，缺血1 h 后再恢復(fù)灌流1 h，將大鼠處死并迅速斷頭取腦。

2.3 HE 染色及線粒體超微結(jié)構(gòu)的觀察 大腦浸泡于10%甲醛溶液中固定24 h，固定后的腦組織以冠狀切面選取最大截面積上下各1 mm共切取2 mm腦組織，常規(guī)脫水、透明、石蠟包埋、切片(4 μm)干燥，HE染色，光鏡下觀察腦皮層病理學變化。另取1 mm × 1 mm × 1 mm 組織后固定于2.5%戊二醛，緩沖液固定6 h，1%鋨酸后固定1 h，濃度梯度乙醇脫水，環(huán)氧樹脂包埋、烘烤， 半薄切片(70 nm)醋酸鈾浸泡及枸櫞酸鉛染色，沖洗、干燥等處理后，用日產(chǎn)JEM-1230 型透射電鏡攝片觀察大腦皮層細胞線粒體超微結(jié)構(gòu)。

2.4 細胞凋亡檢測 腦缺血再灌注1 h后取腦組織制備腦細胞懸液(濃度1×109/L)，取100 μL細胞懸液于流式檢測管中，依次加入Annexin V/ FITC 2.5 μL和PI 5 μL，避光作用15 min，再加入結(jié)合緩沖液400 μL，流式細胞儀檢測細胞凋亡率，每個樣品計數(shù)10 000個細胞。

2.5 半定量RT-PCR法檢測Cyt-C、caspase-9及caspase-3 mRNA的表達 Trizol法提取總RNA，參照試劑盒說明書逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，在PCR 儀中將引物按步驟加入cDNA 中進行序列擴增，取5 μL各擴增產(chǎn)物在1%瓊脂糖(含溴化乙啶 0.5 mg /L)凝膠上電泳(電壓100 V，電流45 mA)，溴化乙啶顯色。采用天能GIS 系統(tǒng)分析軟件測定各條帶灰度值，計算目的條帶Cyt-C、caspase-9及caspase-3與β-actin 灰度的比值。RT-PCR實驗所用擴增Cyt-C、caspase-9， caspase-3及β-actin的引物序列見表1。

表1 引物序列

2.6 免疫組織化學染色法檢測Cyt-C、caspase-9及caspase-3蛋白的表達 石蠟切片常規(guī)脫蠟水化，3% H2O2滅活內(nèi)源性過氧化物酶，微波修復(fù)抗原，山羊血清封閉，滴加Ⅰ抗(兔抗Cyt-C、caspase-3和caspase-9多克隆抗體)及生物素抗兔Ⅱ抗IgG，加入鏈霉親和素-生物素-酶復(fù)合物液孵育，DAB顯色，蘇木素輕度復(fù)染，脫水透明封片。顯微鏡下觀察陽性顯色為棕黃色。陰性對照以PBS代替Ⅰ抗。陽性細胞計數(shù)分析：每組取2張切片，在400倍顯微鏡下觀察，大腦皮質(zhì)區(qū)隨機取6個視野，計數(shù)每個視野中陽性細胞，取平均值。

3 統(tǒng)計學處理

數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS 13.0 統(tǒng)計軟件處理，實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，多組間比較用單因素方差分析(ANOVA)，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗。

結(jié) 果

1 各組腦皮層神經(jīng)元HE染色形態(tài)變化

光鏡下，sham組的神經(jīng)元細胞數(shù)目基本正常，細胞完整，胞體飽滿，胞核圓形，核仁清晰；I/R組的神經(jīng)元數(shù)量減少，間質(zhì)水腫，胞體腫脹，細胞呈圓形或三角形，胞膜有溶解，胞核固縮、邊集，呈新月形、塊狀小體甚至核碎片消失；SI組的多數(shù)神經(jīng)細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)基本完整，胞核清晰可見，部分神經(jīng)元輕度腫脹，部分細胞核固縮，細胞間隙略寬，見圖1。

Figure 1.Morphological changes of the cortex cells after cerebral ischemia/reperfusion in the rats (HE staining, ×400).

圖1 缺血再灌注皮層神經(jīng)細胞形態(tài)學的變化

2 各組腦皮層神經(jīng)元線粒體的形態(tài)變化

透射電鏡下，sham組的神經(jīng)元細胞形態(tài)規(guī)則，線粒體膜完整，嵴清晰可見；I/R組的細胞外形不規(guī)則，多數(shù)線粒體水腫，線粒體膜崩解，嵴消失；SI組的神經(jīng)細胞結(jié)構(gòu)基本完整，線粒體膜基本完整，嵴突少許破壞，見圖2。

Figure 2.The ultra-microstructure of the cortex cells after cerebral ischemia/reperfusion in the rats observed under transmission electronic microscope (× 15 000).

圖2 腦缺血再灌注后腦皮層細胞超微結(jié)構(gòu)的透射電鏡觀察

3 各組腦皮層神經(jīng)元Cyt-C、caspase-9及caspase-3 mRNA的表達

經(jīng)PCR擴增，1%瓊脂糖凝膠電泳后，凝膠成像可見Cyt-C、caspase-9和caspase-3條帶亮度，sham組微弱，I/R組最亮，SI組的亮度比I/R組明顯減弱，內(nèi)參照β-actin在各組亮度較一致，見圖3。

Figure 3.The mRNA expression of Cyt-C, caspase-9 and caspase-3 in different groups.

圖3 各組Cyt-C、caspase-9和caspase-3 mRNA的表達結(jié)果

電泳圖譜經(jīng)天能GIS 系統(tǒng)分析軟件分析(以目的基因與內(nèi)參照β-actin的吸光度比值作為半定量指標)，可見I/R組的Cyt-C和caspase-9 mRNA的表達較sham組明顯增多(P<0.01)；SI組的Cyt-C和caspase-9 mRNA的表達較sham組也增多，但無顯著差異(P>0.05)，但較I/R組顯著降低(P<0.01)；I/R組、SI組的caspase-3 mRNA的表達較sham組明顯增多(P<0.01)，但SI組caspase-3 mRNA的表達較I/R組顯著降低(P<0.05)，見表2。

表2 各組Cyt-C、caspase-9和caspase-3 mRNA表達的比較

*P<0.01vssham group;#P<0.05,# #P<0.01vsI/R group.

4 各組腦皮層神經(jīng)元Cyt-C、caspase-9及caspase-3 蛋白的表達

免疫組化染色陽性細胞胞質(zhì)呈棕黃色，陰性對照細胞呈淡藍色，胞漿中無棕黃色顆粒物。Sham組可見少數(shù)散在的弱陽性細胞，I/R組細胞呈片狀強陽

性表達，SI組陽性細胞表達介于sham組和I/R組之間，見圖4～6。 與sham組比較，I/R組和SI組Cyt-C、caspase-9及caspase-3 蛋白表達的陽性細胞數(shù)明顯增多(P<0.01)，但SI組較I/R組陽性細胞數(shù)明顯減少(P<0.01)，見圖4～6。

Figure 4.The protein expression of Cyt-C of the cortex cells after cerebral ischemia/reperfusion in the rats. A: immunohistochemical staining (× 400); B: statistical analysis of positive cells. Mean±SD.n=10.**P<0.01vssham group;# #P<0.01vsI/R group.

圖4 腦缺血再灌注大鼠皮層Cyt-C蛋白的表達

5 流式細胞術(shù)檢測腦細胞凋亡結(jié)果

凋亡早期，胞內(nèi)磷脂酰絲氨酸外翻，與Annexin-V有高度親合力；凋亡晚期細胞和壞死細胞可以被PI染色。實驗對缺血再灌注1 h后的腦細胞進行Annexin V-FITC 和PI染色，流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡率的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，IR組的Annexin V 陽性細胞率明顯高于sham組(P<0.01)，而SI組的Annexin V 陽性細胞率明顯低于IR組(P<0. 01)，見圖7。

討 論

我們目前的研究結(jié)果表明，大豆異黃酮通過減輕神經(jīng)元凋亡來保護缺血再灌注誘導損傷的腦細胞。抑制神經(jīng)元的凋亡與大豆異黃酮減輕缺血再灌注誘導的線粒體結(jié)構(gòu)的損傷、減少線粒體內(nèi)Cyt-C釋放到胞漿有關(guān)。大豆異黃酮也降低了缺血再灌注后腦組織caspase-9及caspase-3的表達。

Figure 5.The protein expression of caspase-9 of the cortex cells after cerebral ischemia/reperfusion in the rats. A: immunohistochemical staining (×400); B: statistical analysis of positive cells. Mean±SD.n=10.**P<0.01vssham group;# #P<0.01vsI/R group.

圖5 腦缺血再灌注大鼠皮層 caspase-9蛋白的表達

Figure 6.The protein expression of caspase-3 of the cortex cells after cerebral ischemia/reperfusion in the rats. A: immunohistochemical staining (×400); B: statistical analysis of positive cells. Mean±SD.n=10.**P<0.01vssham group;# #P<0.01vsI/R group.

圖6 腦缺血再灌注大鼠皮層 caspase-3蛋白的表達

腦缺血再灌注最嚴重的損傷性變化是腦細胞死亡，凋亡是細胞死亡的重要形式。哺乳動物細胞凋亡有2種主要的途徑。一是死亡受體介導的細胞外凋亡途徑，二是線粒體介導的細胞內(nèi)凋亡途徑[6]。以往人們認為線粒體是能量生成和儲存的場所，自人們發(fā)現(xiàn)線粒體膜上具有調(diào)控凋亡的Bcl-2的家族成員[7]，線粒體功能和結(jié)構(gòu)的變化便成為研究細胞凋亡的熱點，線粒體內(nèi)的Cyt-C在凋亡調(diào)控中的作用也引起學者的關(guān)注[8]。Cyt-C是線粒體呼吸鏈中傳遞電子功能的載體，位于線粒體內(nèi)膜外側(cè)呼吸鏈復(fù)合酶體Ⅲ～Ⅵ之間。各種原因?qū)е戮€粒體受損，線粒體膜通透性轉(zhuǎn)換孔(membrane permeability transi-tion pore，MPTP)開放，線粒體內(nèi)多種蛋白釋放到胞漿，其中最關(guān)鍵的是Cyt-C，其進入胞漿與胞漿內(nèi)凋亡蛋白酶激活因子1及dATP結(jié)合引發(fā)caspases 級聯(lián)反應(yīng)，誘導細胞凋亡[9]。Caspase家族是一組對底物天門冬氨酸部位有特異水解作用、活性中心富含半胱氨酸的蛋白酶家族。在細胞凋亡分子機制中，caspase呈不可逆性水解底物的級聯(lián)放大反應(yīng)，其中caspase-3在細胞凋亡中起著關(guān)鍵性的作用，激活的caspase-3進一步裂解下游的DNA依賴性蛋白激酶等，促進細胞凋亡[10]。Caspase-3的激活在線粒體凋亡途徑中依賴于線粒體Cyt-C的釋放和caspase-9的激活[11]。本研究發(fā)現(xiàn)，全腦缺血1 h、再灌注1 h后，大鼠大腦皮層神經(jīng)元部分線粒體膜崩解，嵴消失，線粒體結(jié)構(gòu)的完整性被破壞。對胞漿內(nèi)Cyt-C、caspase-9和caspase-3活性行RT-PCR擴增檢測提示腦組織Cyt-C、caspase-9和caspase-3的mRNA表達均增加，免疫組織化學檢測Cyt-C、caspase-9和caspase-3蛋白表達的陽性細胞數(shù)也明顯增加。利用流式細胞儀對大腦皮層細胞凋亡率檢測發(fā)現(xiàn)，Annexin V 陽性細胞凋亡率明顯增高。這些均提示線粒體結(jié)構(gòu)的損傷、線粒體內(nèi)Cyt-C的釋放、caspase-9和caspase-3活性增強參與了缺血再灌注早期腦組織損傷，與大腦皮層細胞凋亡率增加密切相關(guān)。這也同Christophe 等[12]的實驗結(jié)果相一致，因此，尋求有效保護線粒體結(jié)構(gòu)的完整性、減少Cyt-C的釋放 、抑制caspase-9和caspase-3活性的藥物成為降低缺血再灌注腦組織損傷的靶點之一。

Figure 7.Flow cytometry analysis of apoptotic rate of the cortex cells. A: Flow cytometry analysis; B: statistical analysis. Mean±SD.n=6.**P<0.01vssham group;# #P<0.01vsI/R group.

圖7 各實驗組腦皮層細胞凋亡率情況

大豆異黃酮是大豆和大豆制品中發(fā)現(xiàn)的化合物，作為雌激素的類似物目前已知有多種生理特性，如抗腫瘤、抗女性絕經(jīng)后的骨質(zhì)疏松癥和抗衰老，還具有提高學習、記憶能力和防治心臟病、糖尿病及川崎病等功能[13]。隨著人們對大豆異黃酮藥理作用的深入研究，發(fā)現(xiàn)大豆異黃酮能減少大腦中動脈阻塞引起的腦組織梗死面積[14]，降低細胞漿中Cyt-C的含量、減少細胞凋亡[4]。體外實驗研究也發(fā)現(xiàn)，大豆異黃酮能減輕由谷氨酸和毒胡蘿卜素誘導的大腦皮層培養(yǎng)細胞的凋亡[15]。在大豆異黃酮對抗缺血性腦損傷作用機制研究中Huang 等[16]發(fā)現(xiàn)，大豆異黃酮可通過激活Notch信號途徑降低腦缺血再灌注誘導的皮層細胞的凋亡率，并認為大豆異黃酮從10 mg·kg-1·d-1增至50 mg·kg-1·d-1，其腦保護作用具有劑量依賴性。我們在研究大豆異黃酮對缺血再灌注后腦組織NF-κB和TNF-α表達影響的實驗中所選取大豆異黃酮灌胃的劑量分別為60 mg·kg-1·d-1、120 mg·kg-1·d-1和240 mg·kg-1·d-1，發(fā)現(xiàn)120 mg·kg-1·d-1的劑量在腦保護作用中效果相對較好(尚未發(fā)表)，故本研究按照大豆異黃酮120 mg·kg-1·d-1的劑量給予大鼠灌胃進行藥物預(yù)處理，觀察大豆異黃酮對大鼠全腦缺血再灌注后大腦皮層細胞凋亡的影響，這也與其它文獻所選取的藥物應(yīng)用劑量相一致[17]。本實驗研究利用120 mg·kg-1·d-1劑量的大豆異黃酮灌胃觀察其對腦缺血1 h、再灌注1 h腦細胞凋亡率的影響，由于實驗條件的限制，我們并未進一步延長缺血再灌注的時間。在缺血再灌注早期，發(fā)現(xiàn)大豆異黃酮減輕了大腦皮層細胞形態(tài)損傷性變化并降低了腦細胞的凋亡率。為探討大豆異黃酮減輕細胞凋亡的機制，我們進一步觀察細胞線粒體的超微結(jié)構(gòu)的變化及胞漿Cyt-C的活性，發(fā)現(xiàn)大豆異黃酮預(yù)處理大鼠缺血再灌注后腦細胞線粒體結(jié)構(gòu)基本保持完整，部分輕度水腫，嵴少許破壞。與單純?nèi)毖俟嘧⒌哪X組織相比，腦組織Cyt-C mRNA表達也明顯降低，免疫組織化學檢測Cyt-C蛋白表達的陽性細胞數(shù)也顯著下降。進一步對線粒體凋亡途徑中Cyt-C蛋白的下游信號蛋白caspase-9和caspase-3活性的研究發(fā)現(xiàn)，腦組織caspase-9和caspase-3的mRNA表達明顯降低，蛋白表達的陽性細胞數(shù)也顯著下降。盡管Cyt-C能激活caspase-9進而活化caspase-3，但大豆異黃酮是抑制線粒體內(nèi)Cyt-C釋放到胞漿間接抑制caspase-9和caspase-3活性，還是直接抑制胞漿中caspase-9和caspase-3活性，仍有待進一步研究。

綜上所述，大豆異黃酮可能通過減輕腦缺血再灌注后線粒體結(jié)構(gòu)損傷進而減少線粒體內(nèi)Cyt-C的釋放，并下調(diào)胞漿中caspase-9和caspase-3的表達，減輕缺血再灌注誘導的腦細胞凋亡，保護受損腦細胞，這可能是大豆異黃酮抗缺血再灌注腦損傷的機制之一。

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Effects of soybean isflavones on mitochondrial damage and neuronal apoptosis induced by cerebral ischemia/reperfusion

ZHAO Shi-di1, CHEN Yao2, JIANG Li-na1, DONG Yin-feng1, CHEN Qian-fen1

(1DepartmentofPathophysiology,2TheFirstAffiliatedHospital,BengbuMedicalCollege,Bengbu233000,China.E-mail:cqf14621@126.com)

AIM: To study the effects of soybean isoflavones on mitochondrial ultrastructure, neuronal apoptosis and expression of cytochrome C, caspase-9 and caspase-3 in the rats with cerebral ischemia/reperfusion.METHODS: Adult healthy SD rats (n=60) were randomly divided into 3 groups: sham group, ischemia/reperfusion injury (I/R) group and soybean isoflavone (SI) pretreatment group. Soybean isoflavones (120 mg·kg-1·d-1) were fed by gastric lavage for 21 d. The global ischemia/reperfusion model of the rats was established by blocking 3 vessels, and then reperfused for 1 h after 1 h of ischemia. The morphological change of the cerebral cortex cells was observed under light microscope. The mitochondrial ultrastructure of the cerebral cortex cells was determined by transmission electron microscope. The apoptotic rate of the cerebral cortex cells was detected by flow cytometry. The expression of cytochrome C, caspase-9 and caspase-3 in the cerebral cortex cells was determined by semi-quantitative RT-PCR and immunohistochemical techniques.RESULTS: Disintegration of mitochondria membrane and disappearance of the mitochondrial cristae were seen in I/R group. Compared with I/R group, the change of ultrastructure of mitochondria was significantly improved by soybean isoflavone pretreatment, and the neuronal apoptotic rate was also significantly decreased (P<0.01). The mRNA expression and protein content of cytochrome C, caspase-9 and caspase-3 in I/R group were obviously higher than those in sham group (P<0.01). Compared with I/R group, the mRNA expression and protein content of cytochrome C, caspase-9 and caspase-3 in SI group were significantly decreased (P<0.01).CONCLUSION: Soybean isoflavones attenuate cerebral ischemia/reperfusion injury by stabilizing the structure of mitochondria, preventing cytochrome C release to the cytoplasm， inhibiting the activation of caspase-9 and caspase-3 and decreasing cell apoptosis．

Soybean isoflavones; Ischemia/reperfusion; Apoptosis; Mitochondrial damage; Caspase-9; Caspase-3

1000- 4718(2014)12- 2172- 07

2014- 07- 11

2014- 09- 01

安徽省自然科學基金資助項目(No. 1408085MH185)；安徽省教育廳自然科學研究基金資助項目(No. KJ2012B102)

R363.2；R743.3

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2014.12.010

△通訊作者 Tel: 0552-3175283; E-mail: cqf14621@126.com