結(jié)腸癌干細(xì)胞樣細(xì)胞的體外培養(yǎng)、鑒定及n-3多不飽和脂肪酸對(duì)結(jié)腸癌干細(xì)胞樣細(xì)胞的抗增殖作用*

方 仕， 龍健婷， 張 冰， 楊 婷， 盧 味， 李鶴平， 石漢平

(中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院 1臨床營養(yǎng)科， 2腫瘤科， 3核醫(yī)學(xué)科， 5普通外科，廣東 廣州 510080； 4中山市人民醫(yī)院重癥治療科，廣東 中山 528400)

結(jié)腸癌干細(xì)胞樣細(xì)胞的體外培養(yǎng)、鑒定及n-3多不飽和脂肪酸對(duì)結(jié)腸癌干細(xì)胞樣細(xì)胞的抗增殖作用*

方 仕1， 龍健婷2， 張 冰3， 楊 婷4△， 盧 味1， 李鶴平2， 石漢平5

(中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院1臨床營養(yǎng)科，2腫瘤科，3核醫(yī)學(xué)科，5普通外科，廣東 廣州 510080；4中山市人民醫(yī)院重癥治療科，廣東 中山 528400)

目的： 采取無血清培養(yǎng)法培養(yǎng)出SW620細(xì)胞球，并對(duì)細(xì)胞球細(xì)胞進(jìn)行干細(xì)胞鑒定；在細(xì)胞水平研究n-3多不飽和脂肪酸(n-3 PUFAs)對(duì)結(jié)腸癌干細(xì)胞樣細(xì)胞的作用。方法: 正常培養(yǎng)人結(jié)腸癌細(xì)胞株SW620并使其逐步適應(yīng)無血清培養(yǎng)條件，經(jīng)無血清培養(yǎng)1周后收集SW620細(xì)胞球。用免疫熒光法檢測胚胎干細(xì)胞標(biāo)志物SSEA-1和TRA-1-81；采用real-time PCR的方法檢測干細(xì)胞相關(guān)基因Sox-2和Oct-4的表達(dá)情況；對(duì)比SW620貼壁細(xì)胞和干細(xì)胞樣細(xì)胞(CSCLC)在軟瓊脂上的克隆形成能力；采用裸鼠移植瘤模型比較2種細(xì)胞的成瘤能力；用MTS法對(duì)比2種細(xì)胞在遞增濃度的5-氟尿嘧啶(5-FU)或mitomycin C處理下的生長抑制情況；用MTS法、Annexin V/PI染色和臺(tái)盼藍(lán)染色分別觀察遞增濃度二十二碳六烯酸(DHA)和二十碳五烯酸(EPA)作用于SW620 CSCLC后細(xì)胞生長抑制情況、凋亡情況和死亡情況；MTS法檢測5-FU或mitomycin C聯(lián)合n-3 PUFAs對(duì)結(jié)腸癌CSCLC增殖的影響。結(jié)果: 無血清培養(yǎng)法成功從SW620中培養(yǎng)出細(xì)胞球。細(xì)胞球細(xì)胞高表達(dá)SSEA-1和TRA-1-81并一過性表達(dá)Sox-2和Oct-4基因；對(duì)5-FU及mitomycin C相對(duì)抵抗；在軟瓊脂上克隆形成率及在裸鼠皮下的成瘤率均顯著高于貼壁細(xì)胞，表明這些細(xì)胞具有干細(xì)胞特性，即為來自于SW620的CSCLC。DHA和(或)EPA作用于SW620 CSCLC能抑制細(xì)胞生長、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，并能增強(qiáng)5-FU及mitomycin C對(duì)其抑制作用。結(jié)論: 無血清培養(yǎng)法能夠從SW620細(xì)胞中培養(yǎng)出具有干細(xì)胞特性的細(xì)胞，它們具有高克隆形成能力及高致瘤性，對(duì)化療藥物相對(duì)抗拒；DHA和EPA能夠誘導(dǎo)SW620來源CSCLC發(fā)生凋亡并增強(qiáng)化療藥物的抗腫瘤活性。

結(jié)腸腫瘤； 腫瘤干細(xì)胞； 無血清培養(yǎng)； n-3多不飽和脂肪酸； 化學(xué)治療

結(jié)直腸癌(colorectal cancer, CRC)為起源于結(jié)直腸黏膜上皮的惡性腫瘤。根據(jù)美國的統(tǒng)計(jì)數(shù)字，進(jìn)入2014年，預(yù)計(jì)將有71 830名男性和65 000名女性會(huì)被診斷為結(jié)直腸癌，而26 270名男性及24 040名女性將死于此病[1]。

Reya等[2]首次提出腫瘤干細(xì)胞(cancer stem cell, CSC)學(xué)說，認(rèn)為惡性腫瘤組織中存在一群數(shù)量極少的具有干細(xì)胞樣特性的細(xì)胞，這群細(xì)胞具有自我更新、無限增殖以及多向分化潛能，而且對(duì)傳統(tǒng)的抗腫瘤治療相對(duì)抗拒，具有啟動(dòng)和維持腫瘤的能力[3]。日益增加的證據(jù)顯示幾乎所有的實(shí)體瘤包括CRC都包含特有的CSC亞群，是導(dǎo)致術(shù)后轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)、腫瘤耐藥及總生存下降的根源[4]。

n-3多不飽和脂肪酸(n-3 polyunsaturated fatty acids, n-3 PUFAs)主要包括α-亞麻酸、二十碳五烯酸(eicosapentenoicacid, EPA)和二十二碳六烯酸(docosahexaenoicacid, DHA)。多年來研究發(fā)現(xiàn)，n-3 PUFAs具有調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)、調(diào)節(jié)心血管功能、抗動(dòng)脈硬化、抗炎、抗癌等多種特殊功效[5-6]。n-3 PUFAs已被用于多種惡性腫瘤的輔助治療，并證實(shí)其能通過改變腫瘤細(xì)胞生物膜結(jié)構(gòu)和功能、增加腫瘤細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)過氧化物的產(chǎn)生、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡、調(diào)節(jié)機(jī)體免疫系統(tǒng)及增強(qiáng)化療藥物抗腫瘤效果等機(jī)制抑制腫瘤的發(fā)生、進(jìn)展和轉(zhuǎn)移[7-10]。然而，n-3 PUFAs對(duì)CSC作用如何，是否能通過抑制CSC達(dá)到進(jìn)一步抑制腫瘤的作用，是否能夠提高化療藥物對(duì)CSC的殺傷作用，這些問題國內(nèi)外尚未見文獻(xiàn)報(bào)道。

本研究首先探討在體外大量培養(yǎng)、富集結(jié)腸癌干細(xì)胞樣細(xì)胞(cancer stem cell-like cells, CSCLC)的方法，并對(duì)其干細(xì)胞性進(jìn)行鑒定；研究n-3 PUFAs在體外對(duì)結(jié)直腸癌CSCLC的作用。

材 料 和 方 法

1 細(xì)胞及動(dòng)物

SW620人結(jié)腸癌細(xì)胞株購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞生物研究所，正常培養(yǎng)于含有10%小牛血清、5×104U/L青霉素及50 mg/L鏈霉素的DMEM/F12培養(yǎng)基(Gibco)。培養(yǎng)在37 ℃、5% CO2的濕化培養(yǎng)箱內(nèi)。逐步降低含血清培養(yǎng)基的比例直至無血清培養(yǎng)，約1周后獲得SW620細(xì)胞球。無胸腺裸鼠購自中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均遵守中山大學(xué)《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》，并在實(shí)驗(yàn)前獲得倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

2 主要方法

2.1 免疫熒光胰酶消化貼壁生長的SW620細(xì)胞及細(xì)胞球 細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，制作細(xì)胞爬片，4%甲醛固定后以PBS清洗，5% BSA+10%山羊血清封閉后以SSEA-1或TRA-1-81抗體(Cell Signaling)孵育過夜，經(jīng)PBS及蒸餾水振洗、吹干后滴加熒光素標(biāo)記Ⅱ抗(1∶150)，室溫孵育60 min后行DAPI(Invitrogen)染色，封片后4 ℃避光干燥保存24 h后在激光共聚焦顯微鏡下觀察。

2.2 Real-time PCR檢測Sox-2和Oct-4 mRNA表達(dá) 從細(xì)胞球細(xì)胞中用Trizol(Invitrogen)提取總RNA，以ReverTra Ace反轉(zhuǎn)錄酶(Toyobo)合成cDNA第1鏈，實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)應(yīng)用SYBR Green PCR Master Mix(Applied Biosystems)在ABI Prism 7500測序儀(Applied Biosystems)中進(jìn)行。Sox-2擴(kuò)增引物序列如下：正義鏈為5′-ATGCACCGCTACGACGTGA-3′；反義鏈為 5′-CTTTTGCACCCCTCCCATTT-3′。Oct-4擴(kuò)增引物序列如下：正義鏈為5′-CGACCATCTGCCGCTTTGAG-3′；反義鏈為 5′-CCCCCTGTCCCCCATTCCTA-3′。內(nèi)參照基因?yàn)镚APDH。PCR過程簡述如下：95 ℃變性5 min；然后40個(gè)循環(huán)：95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s。mRNA水平用2-ΔΔCt方法分析。

2.3 軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn) 將1.32%低熔點(diǎn)瓊脂糖與2×細(xì)胞培養(yǎng)基以1∶1的體積比混合制備0.66%的底層瓊脂，6孔板中每孔1 mL，將0.66%的低熔點(diǎn)瓊脂糖與2×細(xì)胞培養(yǎng)基以1∶1的體積比混合制備0.33%的上層瓊脂，每孔加1 mL。消化貼壁細(xì)胞或細(xì)胞球細(xì)胞成單個(gè)細(xì)胞，調(diào)整單細(xì)胞懸液密度為1×107/L，在每孔瓊脂平面上加100 μL單細(xì)胞懸液(每孔1 000個(gè)細(xì)胞)。置于37 ℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)2～3周，計(jì)數(shù)含50個(gè)細(xì)胞以上的克隆，計(jì)算集落形成率(克隆數(shù)/接種細(xì)胞數(shù)×100%)。

2.4 裸鼠體內(nèi)成瘤實(shí)驗(yàn) 裸鼠分為3組(每組6只)，分別接種2×103、2×104和2×105的SW620貼壁細(xì)胞(右側(cè)皮下)，或細(xì)胞球細(xì)胞(左側(cè)皮下)，每3 d觀察腫瘤形成情況，連續(xù)觀察4周，處死后測量腫瘤大小。

2.5 細(xì)胞生長抑制實(shí)驗(yàn) DHA、EPA、5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil，5-FU)及絲裂霉素C (mitomycin C)均購自Sigma；DMSO購自北京化工廠。細(xì)胞球細(xì)胞在96孔板中懸浮培養(yǎng)，加入含10 μmol/L、30 μmol/L、50 μmol/L、70 μmol/L的DHA、EPA或DHA+EPA，或含10-9、10-8、10-7、10-6、10-5mol/L mitomycin C，或2、4、6、8、10 mg/L 5-FU?；罴?xì)胞琥珀酸脫氫酶能把外源性MTT還原成難溶的紫藍(lán)色formaza結(jié)晶并沉積在細(xì)胞里，而死細(xì)胞無此功能。Formaza結(jié)晶溶解于DMSO中，用酶標(biāo)儀測定570 nm處吸光度(A)值。抑制率(%)=(未加藥組A-加藥組A)/未加藥組A×100%。

2.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡 取10 μmol/L、30 μmol/L、50 μmol/L、70 μmol/L的DHA、EPA或DHA+EPA處理過1 d的干細(xì)胞球，按照試劑說明書操作，以Annexin V和PI標(biāo)記細(xì)胞，避光孵育后進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測，每次計(jì)數(shù)10 000個(gè)細(xì)胞。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有實(shí)驗(yàn)均獨(dú)立重復(fù)至少3次。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。統(tǒng)計(jì)方法采用單因素方差分析或t檢驗(yàn)。統(tǒng)計(jì)軟件使用SPSS 18.0 。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 無血清培養(yǎng)方法得到的SW620細(xì)胞球高表達(dá)胚胎干細(xì)胞表面標(biāo)志物及干細(xì)胞相關(guān)基因

SW620細(xì)胞于無血清培養(yǎng)液中培養(yǎng)3 d后，可見單層細(xì)胞中有些區(qū)域逐漸增厚，6～7 d即可離開多層貼壁細(xì)胞，最后懸浮于培養(yǎng)液中。鏡下觀察懸浮細(xì)胞結(jié)構(gòu)致密、形態(tài)均一、核大、核仁清晰、核質(zhì)比高，見圖1A。共聚焦顯微鏡下觀察，這些來自于細(xì)胞球的細(xì)胞膜表面表達(dá)SSEA-1和TRA-1-81胚胎干細(xì)胞標(biāo)志物，其陽性率顯著高于貼壁培養(yǎng)的SW620細(xì)胞，見圖1B。Real-time PCR檢測干細(xì)胞相關(guān)基因Sox-2和Oct-4在SW620細(xì)胞無血清培養(yǎng)第1天至第7天的表達(dá)情況，結(jié)果表明SW620細(xì)胞在形成細(xì)胞球的過程中，Sox-2和Oct-4基因表現(xiàn)出啟動(dòng)現(xiàn)象，其表達(dá)量在第2～3天最高，而在細(xì)胞球已經(jīng)形成以后，這2個(gè)基因的表達(dá)量又恢復(fù)至培養(yǎng)之初的水平，表明SW620細(xì)胞在形成細(xì)胞球過程中由分化狀態(tài)轉(zhuǎn)入未分化狀態(tài),見圖1C。

Figure 1.SW620 cell line-derived spheroid cells highly expressed embryonic stem cell markers. A: SW620 cells formed spheres in serum-free medium after acclimation gradually for 7 d; B: immunofluorescence staining of spheroid cells and adherent cells with antibodies against SSEA-1 (red) and TRA-1-81 (red); C: the expression levels of pluripotency marker genesSox-2 andOct-4 were examined by real-time PCR during the transformation of SW620 to spheres from 1 d to 7 d.Mean±SD.n=3.*P<0.05vsserum-free medium on day 2;△P<0.05vsserum-free medium on day 3.

圖1 無血清培養(yǎng)方法得到SW620細(xì)胞球高表達(dá)胚胎干細(xì)胞表面標(biāo)志物及干細(xì)胞相關(guān)基因

2 SW620細(xì)胞系來源的細(xì)胞球細(xì)胞克隆形成能力和成瘤性顯著增加，并對(duì)化療藥抗拒

在倒置顯微鏡下對(duì)2組細(xì)胞所生成的細(xì)胞克隆進(jìn)行觀察、計(jì)數(shù)。結(jié)果顯示，無血清條件培養(yǎng)下的SW620細(xì)胞球消化成單個(gè)細(xì)胞克隆形成率是(4.44±3.85)%，含10%血清的DMEM/F12培養(yǎng)液培養(yǎng)的SW620細(xì)胞克隆形成率為(0.89±0.38)%，兩者的克隆形成率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖2A。接種2×103個(gè)細(xì)胞球細(xì)胞組中，2只裸鼠4周后皮下可觀察到直徑3 mm左右隆起，而貼壁細(xì)胞組無一只形成皮下隆起；接種2×104個(gè)細(xì)胞球細(xì)胞組中，2只裸鼠4周后形成皮下移植瘤。而貼壁細(xì)胞至少需要2×105個(gè)細(xì)胞才能形成皮下移植瘤。同樣以2×105個(gè)細(xì)胞接種的情況下，細(xì)胞球細(xì)胞形成的移植瘤體積為(2 279±346.3)mm3，而SW620貼壁細(xì)胞形成的移植瘤體積為(889.8±78.8)mm3(P<0.05)。細(xì)胞球細(xì)胞具有更強(qiáng)的體內(nèi)成瘤能力，見圖2B。隨著濃度的遞增，5-FU和mitomycin C對(duì)SW620貼壁細(xì)胞及細(xì)胞球細(xì)胞的抑制作用逐漸增強(qiáng)，但細(xì)胞球細(xì)胞對(duì)2種化療藥物的作用較貼壁細(xì)胞明顯抗拒，見圖2C。這些具備干細(xì)胞特性的細(xì)胞即為SW620 CSCLC。

Figure 2.SW620-derived spheroid cells exhibited greater abilities of clonogenicity and tumorigenicity. A: colony formation in soft agar medium was photographed 3 d, 8 d and 10 d after seeding. The spheroid cells had higher colony formation efficiency as compared to the adherent SW620 cells. B: sorted cells were subcutaneously injected into the dorsal regions of nude mice at a dose of 2×105cells. Spheroid cells produced palpable xenograft tumors at the injection site, while adherent cells didn’t generate tumors. C: 5-FU- or mitomycin C-induced growth inhibition was compared between adherent cells and spheroid cells. Spheroid cells showed higher resistance to both chemotherapeutic drugs compared with adherent cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsadherent cells.

圖2 SW620細(xì)胞系來源的細(xì)胞球細(xì)胞克隆形成能力和成瘤性顯著增加，并抗化療藥

3 n-3 PUFAs抑制SW620 CSCLC的增殖

隨著DHA、EPA、DHA+EPA濃度從10 μmol/L增加至70 μmol/L，DHA、EPA或2種n-3 PUFAs聯(lián)合對(duì)SW620 CSCLC及貼壁細(xì)胞的抑制作用呈增強(qiáng)趨勢。結(jié)果顯示，各濃度n-3 PUFAs對(duì)CSCLC的抑制作用以聯(lián)合組最強(qiáng)，單用DHA組居中，單用EPA組最弱，各組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。流式細(xì)胞術(shù)檢測Annexin V/PI染色凋亡細(xì)胞以及臺(tái)盼藍(lán)染色死亡細(xì)胞計(jì)數(shù)進(jìn)一步支持MTS生長抑制實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，即各濃度n-3 PUFAs誘導(dǎo)CSCLC凋亡及促進(jìn)細(xì)胞死亡的作用以聯(lián)合組最強(qiáng)，單用DHA組居中，單用EPA組最弱，各組之間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。n-3 PUFAs對(duì)貼壁細(xì)胞同樣具有抑制作用，見圖3。

Figure 3.n-3 PUFAs induced apoptotic cell death in both spheroid cells and adherent cells.Mean±SD.n=3.*P<0.05vsEPA alone;△P<0.05vsDHA alone.

圖3 n-3 PUFAs對(duì)SW620 CSCLC增殖的影響

4 n-3 PUFAs增加SW620 CSCLC對(duì)化學(xué)治療藥物的敏感性

隨著濃度的遞增，5-FU及mitomycin C對(duì)SW620 CSCLC的生長抑制作用呈現(xiàn)濃度依賴性。2種化療藥物聯(lián)合EPA(50 μmol/L)或DHA(50 μmol/L)，或聯(lián)合EPA(50 μmol/L)+DHA(50 μmol/L)均較單用化療藥物時(shí)對(duì)SW620 CSCLC的生長抑制作用增強(qiáng)，該增強(qiáng)作用在聯(lián)合2種n-3 PUFAs時(shí)最為有效。DHA增強(qiáng)化療藥物抑制SW620 CSCLC的作用顯著高于EPA，見圖4。

討 論

Hierarchy學(xué)說認(rèn)為腫瘤組織中存在極少數(shù)具有無限增殖和自我更新能力、能夠?qū)е履[瘤發(fā)生的細(xì)胞，即“腫瘤干細(xì)胞”，它是腫瘤轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)及耐藥的根源[11]。關(guān)于CRC，近年的研究也發(fā)現(xiàn)了CSC的存在[3]，然而，缺乏公認(rèn)的結(jié)直腸CSC的特異性標(biāo)志物以及難以獲取大量結(jié)直腸CSC作為研究對(duì)象，影響了人們對(duì)結(jié)直腸CSC的深入研究。為了解決CSC來源問題，本研究率先進(jìn)行了包括無血清培養(yǎng)等一系列嘗試，并成功從SW620細(xì)胞系中培養(yǎng)、穩(wěn)定傳代了具有干細(xì)胞特性的細(xì)胞，稱之為CRC的CSCLC。

實(shí)驗(yàn)伊始，我們收集了23例CRC患者原代腫瘤組織，希望通過體外培養(yǎng)獲得原代CRC細(xì)胞，以便進(jìn)一步分離、純化腫瘤干細(xì)胞。然而，在對(duì)這些原代腫瘤組織進(jìn)行培養(yǎng)的過程中，屢屢遭遇的污染問題曾一度使實(shí)驗(yàn)陷于困境。通過不斷總結(jié)經(jīng)驗(yàn)，克服污染后，培養(yǎng)出來的細(xì)胞成分復(fù)雜，難以去除大量的成纖維細(xì)胞，以致所能獲得的腫瘤細(xì)胞數(shù)量稀少，無法連續(xù)傳代，無法從患者的原代組織中培養(yǎng)出CRC的CSCLC。

以上實(shí)驗(yàn)的失敗讓我們不得不考慮從其它途徑獲取結(jié)直腸CSC。有報(bào)道指出，一些哺乳動(dòng)物的成體干細(xì)胞能夠在無血清培養(yǎng)基內(nèi)呈非黏附性球形生長，而大多數(shù)已分化的腫瘤細(xì)胞由于不能貼壁而發(fā)生失巢凋亡，而存活下來的則是一些增殖力強(qiáng)、類似于干細(xì)胞樣的腫瘤細(xì)胞[12]。因此，無血清培養(yǎng)法成為一種有效富集腫瘤干細(xì)胞的方法[13]。本實(shí)驗(yàn)用無血清培養(yǎng)法培養(yǎng)出SW620細(xì)胞球，并且實(shí)現(xiàn)在體外的大量繁殖和穩(wěn)定傳代，實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，此細(xì)胞球已穩(wěn)定傳至12代，且其干細(xì)胞特性并未發(fā)生改變。

Figure 4.n-3 PUFAs increased chemosensitivities of SW620 CSCLC to 5-FU and mitomycin C (Mit C). When 5-FU (A) or Mit C (B) were combined with DHA(50 μmol/L), EPA(50 μmol/L), or DHA plus EPA, the therapeutic effects of the chemotherapeutics increased in a dose-dependent manner. The combination of chemodrugs with DHA plus EPA had greater effect than DHA or EPA alone. EPA alone had the weakest effect on chemosensitivity. Mean±SD.n=3.

圖4 n-3 PUFAs增加SW620 CSCLC對(duì)化學(xué)治療藥物的敏感性

對(duì)n-3 PUFAs重要性的認(rèn)識(shí)緣于20世紀(jì)80年代對(duì)愛斯基摩人心血管發(fā)病率降低與經(jīng)常食用深海魚類有關(guān)這一發(fā)現(xiàn)。近年來，大量流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果提示n-3 PUFAs能預(yù)防腫瘤發(fā)生、抑制腫瘤生長。已知n-3 PUFAs對(duì)CRC的抑制作用主要表現(xiàn)為抑制細(xì)胞增殖、遷移，誘導(dǎo)其分化、凋亡和改善患者腫瘤體質(zhì)等[14]。本研究提出如下假設(shè)，n-3 PUFAs亦可以抑制結(jié)直腸CSCLC的生長、誘導(dǎo)其凋亡。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，EPA及DHA不僅能夠抑制SW620 CSCLC的生長，促使其凋亡，而且能夠增強(qiáng)化療藥物抗CSCLC的效果。盡管此前一些動(dòng)物學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果支持在化療前和化療過程中使用n-3 PUFAs能夠起到良好的增敏作用，但其機(jī)制尚不明確。目前認(rèn)為n-3 PUFAs可能通過以下機(jī)制參與調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的化療敏感性：(1)改變腫瘤細(xì)胞生物膜的結(jié)構(gòu)和功能[15]；(2)增強(qiáng)脂質(zhì)過氧化作用[16]；(3)影響化療藥物的吸收[17]；(4)影響核苷類似物的代謝[18]；(5)抑制腫瘤血管生成[19]。以上所述機(jī)制均為在腫瘤細(xì)胞中的研究結(jié)果。n-3 PUFAs是否通過相同的機(jī)制與化療藥物協(xié)同，發(fā)揮抑制CSC的作用，將是我們下一步研究的方向。雖然n-3 PUFAs能夠與化療藥物協(xié)同抗腫瘤這一點(diǎn)尚未得到大規(guī)模臨床試驗(yàn)的支持，但n-3 PUFAs良好的預(yù)防和治療潛力已收到廣泛關(guān)注。相信隨著研究的不斷深入，n-3 PUFAs在未來腫瘤防治中可能作為標(biāo)準(zhǔn)化療的有效佐劑而擁有更廣闊的應(yīng)用前景[20]。

綜上所述，我們用無血清培養(yǎng)法能成功從SW620細(xì)胞中分離出CSCLC。它們具有高克隆形成能力及高致瘤性，對(duì)化療藥物相對(duì)抗拒。DHA和EPA能夠抑制SW620來源CSCLC的生長、促使其發(fā)生凋亡，并且能夠增加SW620 CSCLC對(duì)5-FU或mitomycin C的敏感性。

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Cultivation and identification of human colon cancer stem cell-like cells and antiproliferative effects of n-3 polyunsaturated fatty acids

FANG Shi1, LONG Jian-ting2, ZHANG Bing3, YANG Ting4, LU Wei1, LI He-ping2, SHI Han-ping5

(1DepartmentofClinicNutrition,2DepartmentofMedicinalOncology,3DepartmentofNuclearMedicine,5DepartmentofSurgery,TheFirstAffiliatedHospital,SunYat-senUniversity,Guangzhou510080,China;4IntensiveCareUnit,ZhongshanPeople’sHospital,Zhongshan528400,China.E-mail:yangting_1234@aliyun.com)

AIM: To cultivate stem-like spheres from SW620 cell line in the specific serum-free medium and evaluate the features of the cancer stem cells, and to investigate the effects of docosahexaenoic acid (DHA) and eicosapentaenoic acid (EPA) on the growth of SW620 stem cell-like cells. METHODS: Human colon cancer stem cell-like cells (CSCLC) were obtained from SW620 spheres cultured in serum-free medium. These cells were tested for the expression of SSEA-1 and TRA-1-81 by immunofluorescence staining. The mRNA expression of Sox-2 and Oct-4 was detected by real-time PCR. The efficiency of colony formation on a soft agar gel and tumor formation in the nude mice was compared between SW620 adherent cells and CSCLC. The inhibitory effects of 5-fluorouracil (5-FU) and mitomycin C on both types of cells were measured by MTS assay. MTS assay, Annexin V/PI staining and trypan blue staining were used to determine the effects of DHA and EPA on both types of cells. MTS assay was also used to analyze the combined effect of DHA or EPA with chemotherapeutic drugs on SW620 CSCLC. RESULTS: SW620 cells formed spheres in serum-free culture. The cells from spheres highly expressed SSEA-1 and TRA-1-81, transiently expressedSox-2 andOct-4 genes and were more resistant to 5-FU and mitomycin C treatments. These cells exhibited a greater ability in clone formation and tumorigenicity, indicating that these cells carried stem cell-like features, hence were considered SW620-derived CSCLC. DHA and/or EPA suppressed SW620 CSCLC by inhibiting cell growth, inducing cell apoptosis and sensitizing them to chemotherapeutic drugs. CONCLUSION: The cells with stem cell-like features, such as high efficiency in clonogenicity, tumorigenicity and resistance to chemotherapeutic drugs, can be obtained from SW620 spheres cultured in serum-free condition. DHA and EPA induce apoptosis in SW620-derived CSCLC and sensitize them to chemotherapeutic drugs.

Colonic neoplasms; Neoplastic stem cells; Serum-free culture; n-3 Polyunsaturated fatty acids; Chemotherapy

1000- 4718(2014)12- 2135- 07

2014- 06- 09

2014- 10- 24

國家“十一·五”科技支撐計(jì)劃(No. 2008BAD91B03)； 廣東省科技計(jì)劃社會(huì)發(fā)展項(xiàng)目(No. 2013B021800284)； 廣東省教育部產(chǎn)學(xué)研結(jié)合項(xiàng)目(No. 2011B090400558)

R735.34

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2014.12.004

△通訊作者 Tel： 020-87755766-8179; E-mail: yangting_1234@aliyun.com