微乳法制備丹皮酚納米結構脂質(zhì)載體

孫 雯 ，龍凱花 ，李彤暉 ，辛永潔 ，廉志遠 ，李 曄

(1．陜西中醫(yī)學院，陜西 咸陽 712046； 2．陜西省中醫(yī)藥研究院，陜西 西安 710003）

納米脂質(zhì)載體，全稱納米結構脂質(zhì)載體（NLC），是在固體脂質(zhì)納米粒（SLN）基礎上發(fā)展起來的第2代新型給藥系統(tǒng)。NLC保留了SLN生理相容性好，可生物降解，可控制藥物釋放，有良好的靶向性，易于大規(guī)模生產(chǎn)的優(yōu)點[1]；同時，NLC在固體脂質(zhì)載體中引入了液體脂質(zhì)，使晶體混亂度增加，獲得了較高的晶體缺陷，克服了SLN載藥量低的問題;另外，許多難溶性藥物在液態(tài)脂質(zhì)中的溶解度要大于固態(tài)脂質(zhì)，因此在NLC固態(tài)骨架中形成微小的液態(tài)脂質(zhì)納米格室也有利于載藥量的提高。液態(tài)脂質(zhì)的加入，還改善了SLN的藥物突釋和納米?；鞈殷w水分含量高的缺點。與SLN相同，NLC的制備方法主要包括高壓乳勻法、微乳法、乳化蒸發(fā)-低溫固化法、微乳超聲分散法、薄膜-超聲分散法、溶劑擴散法等[2-5]。微乳是熱力學穩(wěn)定體系，采用微乳法制備NLC，可使其粒徑大小可控、粒度分布均勻，由于制備速度快，無需在制備后分散，因此試驗裝置簡單、制備條件溫和、操作方便。丹皮酚(paeonol)具有良好的抗炎、抗過敏及抗感染作用，體外用藥素有“天然抗生素”之稱[6]。但丹皮酚具有易揮發(fā)、易氧化和生物半衰期短等特性，無法保持持久有效的血藥濃度，影響制劑的穩(wěn)定性和生物利用度[7-8]。本研究中利用NLC研究了具有緩釋作用的丹皮酚制劑工藝。

1 儀器與試藥

BP-61型電子分析天平（德國賽多利斯公司）；GL-88B型渦旋混合儀（江蘇海門其林貝爾儀器制造有限公司）；HJ-6型磁力攪拌器（常州國華電器有限公司）；TGL-16G型離心機（上海安亭科學儀器廠）；SHA-C型恒溫水浴振蕩器（常州國華電器有限公司）；1026型高效液相色譜儀（安捷倫公司）；FOEA26810D型純水機（MiLLipore公司）。丹皮酚提取物（含量不低于98%，西安天一生物技術有限公司）；丹皮酚對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號為 110752-200410）。

2 方法與結果

2．1 液態(tài)脂質(zhì)、乳化劑和助乳化劑的篩選

采用高效液相色譜（HPLC）法[9-10]測定丹皮酚在不同介質(zhì)中的溶解度，因此選擇對丹皮酚溶解度較大的輔料進行處方篩選。

色譜條件：色譜柱為Agilent Zorbax Eclipse XDB-C18柱(250 mm ×4．6 mm，5 μm)，流動相為甲醇 - 水（70 ∶30），檢測波長為 274 nm，進樣量為 10 μL，流速為 1 mL ／min，柱溫為 30 ℃ 。

溶液制備與測定：精密稱取丹皮酚對照品5．90 mg，加甲醇定容于10 mL容量瓶中，制成每1 mL含0．590 mg的溶液，搖勻，即得對照品溶液。取過量丹皮酚細粉置10 mL具塞試管中，分別加入各種液態(tài)脂質(zhì)、表面活性劑及助表面活性劑約1．0 g，密封，磁力攪拌混勻，于（42±1）℃水浴搖床中振蕩至平衡后，以12 000 r／min的速率離心10 min，取上清液200 μL，置容量瓶中，精密稱定，甲醇溶解并稀釋至刻度，HPLC法檢測藥物含量，計算丹皮酚在各輔料中的飽和溶解度。平行測定3份，結果見表1。

篩選結果：液態(tài)脂質(zhì)中油酸乙酯(EO)，油酸(AO)，辛酸葵酸三甘油酯(GTCC)對丹皮酚溶解度均較高，但黏度大的脂質(zhì)不利于在水相中分散，乳化平衡所需時間較長，因此，用黏度較小的油相為佳[8]。因以可進一步考察微乳形成性能考察的液態(tài)脂質(zhì)有油酸乙酯，GTCC，油酸聚乙醇甘油酯(LabrafiL M1944CS)，單亞油酸甘油酯(Maisine 35-1)，肉豆蔻異丙酯(IPM)；乳化劑有聚乙二醇-12-羥基硬脂酸酯(HS-15)，辛酸癸酸乙二醇甘油酯(LabrasoL)，聚氧乙烯氫化蓖麻油(RH-40)；助乳化劑有甘油，二乙二醇單乙基醚(TranscutoL P)，聚乙二醇400(PEG400)，無水乙醇。

表1 丹皮酚在不同油、表面活性劑和助表面活性劑中的表觀溶解度（42℃，n＝3）

2．2 偽三元相圖的繪制

不同固態(tài)脂質(zhì)對初乳液（微乳）形成的影響：以油酸乙酯為液態(tài)脂質(zhì)，考察固態(tài)脂質(zhì)硬脂酸、單硬酯酸甘油酯對初乳液形成的影響，并繪制偽三元相圖，見圖1。可見，兩種固態(tài)脂質(zhì)形成微乳液的面積與其加入量呈負相關；硬脂酸的 O／W型微乳面積明顯大于單硬酯酸甘油酯。

圖1 不同固態(tài)脂質(zhì)對初乳液的影響

不同液態(tài)脂質(zhì)對初乳液形成的影響：以硬脂酸為固態(tài)脂質(zhì)，考察液態(tài)脂質(zhì) GTCC，LabrafiL M 1944CS，油酸乙酯，Mainsine 35-1，IPM對初乳液形成的影響，并繪制偽三元相圖，見圖2。可見，5種乳化劑均能形成微乳，其中GTCC，油酸乙酯，IPM的偽三元相圖下微乳面積較大。

不同乳化劑對初乳液形成的影響：以硬脂酸為固態(tài)脂質(zhì)，油酸乙酯為液態(tài)脂質(zhì)，考察乳化劑泊洛沙姆，LabrasoL，RH-40，HS-15，卵磷脂對初乳液形成的影響，繪制偽三元相圖，見圖3?？梢?，卵磷脂和泊洛沙姆188不能形成微乳；偽三元相圖下，HS-15形成的微乳面積最小。

圖2 不同液態(tài)脂質(zhì)對初乳液的影響

圖3 不同乳化劑對初乳液的影響

不同助乳化劑對初乳液形成的影響：以硬脂酸為固態(tài)脂質(zhì)，油酸乙酯為液態(tài)脂質(zhì)，考察助乳化劑 PEG400、1，2-丙二醇、TranscutoL P、無水乙醇、甘油對初乳液形成的影響，繪制偽三元相圖，見圖4?？梢?，各助乳化劑均能不同程度地形成微乳液。但考慮到乙醇的皮膚刺激性，因此后續(xù)篩選將不列入無水乙醇。

圖4 不同助乳化劑對初乳液的影響

2．3 過冷態(tài)處方的去除

對偽三元相圖篩選出的9個微乳處方進行“過冷態(tài)”處方試驗，凡不能在0℃冷水中分散，形成混懸液的，即認為是“過冷態(tài)”處方，對其舍棄。結果見表2。

表2 待選處方組成及其0℃分散表觀性狀表

2．4 載藥微乳液的制備

按表 2 中 1，2，3，5，6 處方，在（42 ±1）℃ 水浴下加入 10% 丹皮酚藥物，以微乳液仍澄清透明、離心后不分層為指標評定可載藥微乳液。結果表明，加入丹皮酚后，處方 1，2，6流動性好，離心后不分層，可作為制備丹皮酚NLC備用處方。處方3，4離心后分層，舍去。

2．5 丹皮酚NLC的制備

取處方量硬脂酸和油酸乙酯（42±1）℃加熱混勻，加入10%丹皮酚，磁力攪拌，加入處方量LabrasoL，TranscutoL P和水制備成澄明丹皮酚NLC微乳液，并將其加熱至60℃以上，用預熱至同樣溫度的注射器吸取1 mL微乳液，逐滴快速分散于10 mL的0℃冷水中，即形成丹皮酚NLC混懸液。

3 討論

本試驗在丹皮酚的NLC制備方法上采用了微乳法，此方法制備NLC的初乳液所需設備簡單、操作方便易行。試驗前期結果表明，硬脂酸、單硬脂酸甘油脂等固態(tài)脂質(zhì)的最低熔點約在40℃，而丹皮酚晶體在45℃即可熔融成液態(tài)，因此對各介質(zhì)溶解性能的考察溫度應設定在40～45℃。采用繪制偽三元相圖篩選微乳初乳液處方。分別對構成處方的固態(tài)脂質(zhì)、液態(tài)脂質(zhì)、乳化劑、助乳化劑進行微乳液的滴定，初選構成處方輔料。通過加藥粉、過冷液等試驗，篩選出備選處方。通過體外經(jīng)皮滲透試驗，優(yōu)選透皮滲透率高、突釋現(xiàn)象較弱的處方。文獻報道，NLC的分散粒徑和初乳液與分散液的溫差呈負相關，即初乳液與分散液的溫差越大，形成的NLC粒徑越?。环稚r乳滴越小，越容易均勻分散，分散粒徑趨向于小。對此，NLC的分散工藝還有待進一步考察。所謂“過冷態(tài)”，即溫度降至脂質(zhì)熔點以下時類脂不發(fā)生結晶現(xiàn)象。本試驗制備NLC初乳液產(chǎn)生過冷態(tài)的原因主要有混合脂質(zhì)作為載體材料降低了結晶度，打破晶格的有序性；粒徑太小及乳化劑的加入，導致類脂凝固被阻滯。NLC過冷態(tài)的形成會嚴重影響緩釋效果，因此對形成過冷態(tài)處方的篩除非常重要。

微乳具有穩(wěn)定的納米級結構，但仍然存在油水界面，表面活性劑在油相、水相和界面間快速交換，達到一種動態(tài)平衡。微乳稀釋冷卻時，表面活性劑將向分散介質(zhì)迅速擴散而流失。失去部分表面活性劑保護的微乳中未固化的脂質(zhì)油相互融合使粒徑增加。已形成的納米粒也會隨處方不同穩(wěn)定性有差異。縮短固化時間有利于得到粒徑小、穩(wěn)定性好的產(chǎn)品。

微乳是一種熱力學穩(wěn)定體系，其制備速度快，且無需在制備后立即分散，使得NLC制備工藝操作更加靈活。由于注射器針尖滴出的微乳液滴可以很小，每滴與分散介質(zhì)接觸時都能保證較高的稀釋倍數(shù)。因此微乳法制備NLC時總的稀釋倍數(shù)可以很小，甚至小于1。其產(chǎn)品的脂質(zhì)濃度可以比溶劑乳化法高，但仍比高壓乳勻法小[4]。乳化劑用量大是微乳法制備NLC的一個缺點。表面活性劑可以考慮用透析或超速離心等方法除去。本試驗制得的丹皮酚NLC同時具有緩釋作用，可以制成親水凝膠和軟膏而用于局部給藥[11]。

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