1 株廣譜拮抗菌的分離鑒定及其抗菌活性成分分析

郭照輝，黃軍， 魏小武，羅 容珺 ， 伍善東，劉清術(shù),3*

(1.湖南省微生物研究院，湖南 長(zhǎng)沙410009；2.湖南省農(nóng)用微生物應(yīng)用工程技術(shù)研究中心，湖南 長(zhǎng)沙410009； 3.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙410128)

選用抗病品種和采用輪作的種植制度，并不能有效抑制某些土傳病害的為害；施用化學(xué)農(nóng)藥的效果雖好，但對(duì)環(huán)境和食品安全會(huì)造成巨大威脅[1–3]。有研究表明，利用植物根際有益微生物能有效降低植物病原菌的危害，且對(duì)環(huán)境友好，具有很好的應(yīng)用前景[4–6]。

筆者從煙–稻–(油)輪作10年以上的耕地土壤中篩選得到了1 株拮抗菌HMI–23，該菌株對(duì)水稻紋枯菌、煙草青枯菌、油菜核盤菌都具有顯著的抑菌效果。對(duì)該菌株抗菌物質(zhì)的穩(wěn)定性進(jìn)行了測(cè)試，并對(duì)主要抑菌成分進(jìn)行了檢測(cè)和分析，初步確定了該菌株產(chǎn)生的抗菌活性物質(zhì)的種類?，F(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材 料

2010年5月中旬，從湖南瀏陽(yáng)沙市、郴州宜章煙草–水稻輪作10年以上的田間，采集煙草根際土樣20 余份。

水稻紋枯病病原菌(立枯絲核菌(Rhizoctonia solani))、油菜菌核病病原菌(核盤菌(Sclerotinia sclerotiorum))由湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院陳武博士提供；煙草青枯病病原菌(雷爾氏菌(Ralstonia solanacearum ))由福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院劉波研究員提供。

常規(guī)細(xì)菌培養(yǎng)基采用LB 培養(yǎng)基，病原真菌培養(yǎng)基采用PDA 培養(yǎng)基，青枯雷爾氏菌采用TTC 培養(yǎng)基，液體發(fā)酵培養(yǎng)基采用Landy 培養(yǎng)基[7]。除PDA培養(yǎng)基外，其余培養(yǎng)基pH 均為7.0～7.2。

1.2 方 法

1.2.1 拮抗菌的分離與篩選

拮抗菌的分離參照文獻(xiàn)[10]方法進(jìn)行。

病原真菌拮抗試驗(yàn)采用對(duì)峙培養(yǎng)法[8]，青枯病拮抗試驗(yàn)，采用雙層平板法[11]。

1.2.2 拮抗菌發(fā)酵液抑菌活性測(cè)定

拮抗菌菌株接種于Landy培養(yǎng)基，培養(yǎng)48 h后，高速離心，上清液經(jīng)0.22 μm濾膜過(guò)濾除菌，發(fā)酵濾液采用杯碟法進(jìn)行抑菌活性測(cè)定[9]。

1.2.3 拮抗菌發(fā)酵液抑菌活性的穩(wěn)定性測(cè)定

1) 熱穩(wěn)定性試驗(yàn)。拮抗菌發(fā)酵濾液分別用20、40、60、80℃水浴處理1 h，100、120℃高溫蒸氣處理30min，再用杯碟法進(jìn)行抑菌活性測(cè)定，與未經(jīng)處理的發(fā)酵濾液的抑菌活性進(jìn)行比較。

2) 蛋白酶K 穩(wěn)定性試驗(yàn)。發(fā)酵濾液加入終質(zhì)量濃度1μg/mL 的蛋白酶K，室溫(25℃)處理1 h，再用杯碟法進(jìn)行抑菌活性測(cè)定，與未經(jīng)處理的發(fā)酵濾液的抑菌活性進(jìn)行比較。

3) 紫外線照射穩(wěn)定性試驗(yàn)。遮光布遮擋自然光，發(fā)酵濾液紫外燈照射10、20、30、40、50、60min，再用杯碟法進(jìn)行抑菌活性測(cè)定，與未經(jīng)處理的發(fā)酵濾液的抑菌活性進(jìn)行比較。

1.2.4 拮抗菌 16S rDNA 序列測(cè)定

以拮抗菌的基因組DNA 為模板，用細(xì)菌16S rDNA 通用引物27F 和1492R 對(duì)拮抗菌菌株的16S rDNA 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，產(chǎn)物送至上海生工測(cè)序。利用NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)的BLASTn 程序?qū)π蛄羞M(jìn)行同源性檢索，與GenBank 數(shù)據(jù)進(jìn)行比對(duì)分析，再利用軟件Mega 5 進(jìn)行多序列同源性分析，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

1.2.5 拮抗菌脂肽類抗生素合成相關(guān)基因的檢測(cè)

以拮抗菌基因組為模板，根據(jù)其他芽孢桿菌已鑒定的mycosubtilinB[10]、fengycinB[11]、iturinA[12]脂肽合成基因簇中的保守區(qū)域及脂肽合成必須的關(guān)鍵酶編碼基因sfp[13](磷酸泛酰巰基乙胺基轉(zhuǎn)移酶基因)，設(shè)計(jì)4 對(duì)PCR 引物探針，序列為：mycBF，

–ATGTCGGTGTTTAAAAATCAAGTAACG–，myc BR，–TTAGGACGCCAGCAGTTCTTCTATTGA–；fenBF，–CTATAGTTTGTTGACGGCTC–，fenBR，–CAGCACTGGTTCTTGTCGCA–；ituAF，–ATGTA TACCAGTCAATTCC–，ituAR，–GATCCGAAGCTG ACAATAG–；sfpF，–ATGAAGATTTACGGAATTTA–，sfpR，–TTATAAAAGCTCTTCGTACG–)。PCR 檢測(cè)拮抗菌基因組中是否存在mycB、fenB、ituA、sfp脂肽合成基因，并將PCR 產(chǎn)物送至上海生工測(cè)序，利用NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)的BLASTn 程序?qū)π蛄羞M(jìn)行同源性檢索，與GenBank 數(shù)據(jù)進(jìn)行比對(duì)分析。

1.2.6 拮抗菌脂肽類物質(zhì)的提取與抑菌活性測(cè)定

脂肽類物質(zhì)提取按照文獻(xiàn)[14]方法進(jìn)行，粗提液經(jīng)0.22 μm 濾膜過(guò)濾，采用杯碟法測(cè)定稀釋10倍后的脂肽粗提液對(duì)水稻立枯絲核菌、油菜核盤菌和青枯雷爾氏菌的抑菌活性。

1.2.7 拮抗菌脂肽粗提取物成分分析

取脂肽過(guò)濾液進(jìn)行HPLC–ESI/MS 檢測(cè)，色譜條件參照文獻(xiàn)[14]。

2 結(jié)果與分析

2.1 拮抗菌的分離和篩選結(jié)果

從20 多份土壤樣品中分離、篩選拮抗菌的結(jié)果來(lái)看，1 株篩選自瀏陽(yáng)沙市鎮(zhèn)煙草根際土壤的菌株HMI–23，對(duì)水稻立枯絲核菌、油菜核盤菌和青枯雷爾氏菌均具有強(qiáng)拮抗作用(圖1)，抑菌圈直徑分別為16.5、32.8、22.3 mm。對(duì)稻曲病病原菌、辣椒疫病病原菌、西瓜枯萎病病原菌等的抑菌圈直徑都在20 mm 以上(數(shù)據(jù)未列出)，顯示出較廣的抑菌譜。HMI–23 在LB 平板培養(yǎng)基上，菌落呈淡黃色，顯微鏡下菌體為桿狀，可形成芽孢。

圖1 拮抗菌HMI–23 對(duì)病原菌的抑菌活性 Fig.1 The inhibition activity of antagonistic bacteria strain HMI-23 to plant pathogens

2.2 拮抗菌HMI–23 發(fā)酵液的抑菌效果

HMI–23 菌發(fā)酵液對(duì)水稻立枯絲核菌、油菜核盤菌和青枯雷爾氏菌的抑制作用較強(qiáng)，其抑菌圈平均直徑分別達(dá)19.6、27.0、30.2 mm，表明HMI–23菌株發(fā)酵濾液中含有抑制真菌和細(xì)菌的活性成分。

2.3 拮抗菌HMI–23 發(fā)酵液抑菌成分的穩(wěn)定性

2.3.1 溫度對(duì)發(fā)酵液抗真菌活性的影響

以油菜核盤菌為測(cè)試靶標(biāo)，測(cè)試不同溫度熱處理后，HMI–23 發(fā)酵濾液抗真菌活性的變化情況。結(jié)果(表1)顯示，20～80℃處理時(shí)，發(fā)酵濾液的抗真菌活性基本保持不變，100～120℃處理后，活性有所下降，但仍能保留60%以上的抗真菌活性，表明抗真菌活性物質(zhì)具有較高的熱穩(wěn)定性。

2.3.2 蛋白酶K 和紫外線處理對(duì)發(fā)酵液抗真菌活性的影響

蛋白酶K 處理后的發(fā)酵濾液所產(chǎn)生的抑菌圈直徑與對(duì)照基本相等(表1)，表明HMI–23 菌株發(fā)酵液中的抗真菌活性物質(zhì)不能被蛋白酶K 水解而失活，可能不是蛋白類物質(zhì)。紫外線處理后的發(fā)酵濾液所產(chǎn)生的抑菌圈直徑也與對(duì)照基本相等(表1)，表明紫外線照射對(duì)抗菌物質(zhì)基本沒(méi)有影響。

表1 拮抗菌HMI–23 發(fā)酵濾液抗真菌活性的穩(wěn)定性 Table 1 The stabilization of antifungal activity of strain HMI-23 fermentation broth supernatant

2.4 拮抗菌HMI–23 的16S rDNA 序列分析

以 HMI–23 菌株基因組為目標(biāo)，以引物27F/1492R 成功擴(kuò)增到了1.5 kb 左右的條帶，測(cè)序后序列已經(jīng)登錄到GenBank(ID：JX964996.1)。以此序列及同源序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(圖2)，顯示HMI–23 與解淀粉芽孢桿菌FZB42 親緣關(guān)系最近。

圖2 拮抗菌HMI–23 的16S rDNA 系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù) Fig. 2 16S rRNA based phylogeny tree of antagonistic bacteria HMI–23

2.5 拮抗菌HMI–23 脂肽合成相關(guān)基因的PCR 擴(kuò)增結(jié)果

以基因組為模板，利用4 對(duì)特異引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，獲得4 條目標(biāo)片段(圖3)，其相對(duì)分子質(zhì)量與已知的脂肽抗生素合成基因相符合，即抗霉枯草菌素B(mycosubtilin B)合成基因mycB、豐原素B(fengycin B)合成基因fenB、伊枯草菌素A (iturin A)合成基因ituA 和脂肽抗生素合成關(guān)鍵基因sfp，大小分別為2.0、1.4、1.1 和0.6 kb。序列跟解淀粉芽孢桿菌FZB42 基因組[15]中同源基因的同源性分別為98%、98%、95%、96%，說(shuō)明 菌株HMI–23 基因組中可能含有相應(yīng)抗菌脂肽類的完整的生物合成基因簇，也進(jìn)一步證明了其與解淀粉芽孢桿菌FZB42 具有很近的親緣關(guān)系。

圖3 脂肽合成基因的PCR 擴(kuò)增結(jié)果 Fig.3 PCR results forgenes coding for lipopeptides

2.6 拮抗菌HMI–23 脂肽粗提物的抑菌作用和活性成分

拮抗菌脂肽粗提物抗菌活性測(cè)定結(jié)果顯示，對(duì)水稻立枯絲核菌、油菜核盤菌和青枯雷爾氏菌的抑菌圈平均直徑分別達(dá)25.8、29.3、35.5 mm。

利用HPLC–ESI/MS 對(duì)粗提物進(jìn)行定性定量分析(表2、圖4)，結(jié)果表明，HMI–23 的脂肽粗提物中含有與已知抗菌脂肽iturin A、mycosubtilin B、fengycin B 和bacillomycin D 相對(duì)分子質(zhì)量相同的化合物，表明該菌可能具有產(chǎn)生這4 種抗菌脂肽的能力。除了以上4 種已知化合物外，脂肽粗提物中還含有多個(gè)未知相對(duì)分子質(zhì)量的組分(數(shù)據(jù)未列出)。

表2 脂肽粗提物中可能存在的脂肽類化合物 Table 2 Detection of known lipopeptides from crude extract

圖4 脂肽粗提物中化合物12、15、24、33 號(hào)在質(zhì)譜分析中對(duì)應(yīng)的離子峰 Fig.4 The ion peak of lipopeptide compound 12(a),15(b),24(c),33(d) analyzed by MS

3 討 論

文獻(xiàn)[16–18]報(bào)道的拮抗菌大多只是針對(duì)某種作物病害進(jìn)行篩選，對(duì)多種作物病原菌都具有較好抑菌活性的拮抗菌并不多見(jiàn)，能同時(shí)抑制植物病原真菌和植物病原細(xì)菌的拮抗菌更少。本研究分離篩選得到的拮抗菌HMI–23，對(duì)水稻立枯絲核菌、油菜核盤菌等植物病原真菌和青枯雷爾氏菌等植物病原細(xì)菌都有較強(qiáng)的抑制活性，抑菌譜較廣，具有開(kāi)發(fā)成廣譜抗病生物農(nóng)藥或生物肥料的潛力。菌株HMI–23 經(jīng)16S rDNA 比對(duì)分析，認(rèn)為該菌株可能是解淀粉芽孢桿菌，與目前研究和應(yīng)用較多的PGPR(plantgrowth promoting rhizobacteria)解淀粉芽孢桿菌FZB42 親緣關(guān)系非常接近[15]。通過(guò)穩(wěn)定性試驗(yàn)、PCR 檢測(cè)和質(zhì)譜檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，與大部分已經(jīng)報(bào)道的芽孢桿菌類拮抗細(xì)菌一樣，HMI–23 的抑菌活性主要來(lái)自于脂肽類抗生素[19–20]。與解淀粉芽孢桿菌FZB42 一樣，拮抗菌HMI–23 基因組中也含有多種脂肽抗生素的生物合成基因簇，如mycosubtilin B、fengycin B 和bacillomycin D[21]。此外， HMI–23可能還產(chǎn)生FZB42 不能產(chǎn)生的抗真菌脂肽Iturin A[22]，能在一定程度上提高拮抗菌的抗真菌效果[12]。HMI–23 發(fā)酵液中還含有多種未知組分，最終確定HMI–23 抗菌活性物質(zhì)的種類以及探索菌株是否產(chǎn)生新抗菌化合物，還有待進(jìn)一步的分離、純化、鑒定，以及全基因組測(cè)序、基因組發(fā)掘、基因敲除等一系列試驗(yàn)進(jìn)行探索。

[1] Leistra M，Matser A M．Adsorption，transformation，and bioavailability of the fungicides carbendazim and iprodione in soil，alone and in combination [J]．J Environ Sci Health B，2004，39(1)：1–17．

[2] Wang Y S，Wen C Y，Chiu T C，et al．Effect of fungicide iprodione on soil bacterial community[J]．Ecotoxicol Environ Saf，2004，59(1)：127–132．

[3] Alabouvette C，OlivainC，Steinberg C．Biological control of plant diseases：The European situation[J]．Eur J Plant Pathol，2006，114(3)：329–341．

[4] Kazempour M N．Biological control of Rhizoctonia solani，the causal agent of rice sheath blight by antago- nistics bacteria ingreen house and field conditions[J]. Plant Pathol，2004(3)：88–96．

[5] Scherwinski K，Grosch R，Berg G．Effect of bacterial antagonists on lettuce：Active biocontrol of Rhizocto- niasolani and negligible，short-term effects on nontarget microorganisms[J]．FEMS Microbiol Ecol，2008，64(1)：106–116．

[6] Andrews M，Cripps M G，Edwards G R．The potential of beneficial microrganims in agricultural systems[J]．Ann Appl Biol，2012，160(3)：1–5．

[7] Akpa E，Jacques P，Wathelet B，et al．Influence of culture conditions on lipopeptide production by Bacillus subtilis [J]．Appl Biochem Biotechnol，2001，91～93：551–561．

[8] 蘭時(shí)樂(lè)，陳海榮，肖宏英，等．稻曲病菌拮抗菌的篩選及拮抗活性測(cè)定[J]．植物保護(hù)，2004，30(2)：69–72．

[9] 易有金，劉如石，尹華群，等．煙草青枯病拮抗內(nèi)生細(xì)菌的分離、鑒定及其田間防效[J]．應(yīng)用生態(tài)學(xué)報(bào)，2007，18(3)：554–558．

[10] Duitman E H，Hamoen L W，Rembold M，et al．The mycosubtilin synthetase of Bacillus subtilis ATCC6633：A multifunctional hybrid between a peptide synthetase，an amino transferase，and a fatty acid synthase [J]．Proc Natl Acad Sci，1999，96(23)：13294–13299．

[11] Lin T P，Chen C L，Chang L K，et al．Functional and transcriptional analyses of a fengycin synthetasegene，fenC，from Bacillus subtilis[J]．J Bacteriol，1999，181(16)：5060–5067．

[12] Tsuge K，Akiyama T，Shoda M．Cloning，sequencing，and characterization of the iturin A operon[J]．J Bacteriol，2001，183(21)：6265–6273．

[13] Tsuge K，Ano T，Hirai M，et al．Thegenes degQ，pps，and lpa–8 (sfp) are responsible for conversion of Bacillus subtilis 168 to plipastatin production[J]．Antimicrob Agents Chemother，1999，43(9)：2183–2192．

[14] SUN Li–jun，LU Zhao–xin，Bie Xiao–mei，et al. Influence of medium on antimicrobial lipopeptide production by Bacillus amyloliquefaciens ES–2[J]. Scientia Agricultura Sinica，2008，41(10)：3389–3398．

[15] CHEN Xiao-hua，Koumoutsi A，Scholz R，et al. Comparative analysis of the completegenome sequence of the plantgrowth-promoting bacterium Bacillus amyloliquefaciens FZB42[J]．Nature Biotechnology，2007，25(9)：1007–1014．

[16] 程亮，游春平，肖愛(ài)萍．拮抗細(xì)菌的研究進(jìn)展[J]．江西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2003，25(5)：732–735．

[17] 于淑池，張利平，王立安．拮抗細(xì)菌作為生物防治手段研究進(jìn)展[J]．河北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2004，8(1)：62–65．

[18] 邱德文．我國(guó)植物病害生物防治的現(xiàn)狀及發(fā)展策略[J]．植物保護(hù)，2010，36(4)：15–18．

[19] 趙新林，趙思峰．枯草芽孢桿菌對(duì)植物病害生物防治的作用機(jī)理[J]．湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，50(5)：3025–3028．

[20] 徐劉平，尹燕妮，李師默，等．拮抗細(xì)菌對(duì)土傳病原菌的作用機(jī)理[J]．中國(guó)生物防治，2006，22(1)：10–14．

[21] Koumoutsi A，Chen X H，Henne A，et al. Structural and functional characterization ofgene clusters directing nonribosomal synthesis of bioactive cyclic lipopeptides in Bacillus amyloliquefaciens strain FZB42[J]．J Bacteriol，2004，186(4)：1084–1096．

[22] Chen X H，Koumoutsi A，Scholz R，et al．Genome analysis of Bacillus amyloliquefaciens FZB42 reveals its potential for biocontrol of plant pathogens[J]．J Biotechnol，2009，140(1/2)：27–37．