黃芪多糖對心肌缺血再灌注損傷的保護作用*

李鐵成，張靜峰，馬寶豐，徐 芳，李德生，艾 浩

（遼寧醫(yī)學院附屬第三醫(yī)院，錦州 121000）

黃芪多糖（APS）是中藥黃芪的主要有效成分之一，具有調節(jié)免疫活性，抗炎抗氧化，減輕惡性腫瘤化療后的骨髓抑制等藥理作用[1-2]。近年研究發(fā)現(xiàn)黃芪多糖對心血管疾病具有一定的保護作用，其對糖尿病心肌病和心肌肥厚有一定的改善作用[3-4]。進一步研究顯示黃芪多糖對心肌缺血損傷也有一定的保護作用[5]。對心肌缺血再灌注損傷的深入研究發(fā)現(xiàn)，炎癥因子以及炎癥信號通路在心肌缺血再灌注損傷上發(fā)揮著至關重要的作用[6]，因此本研究以炎癥信號通路及炎癥因子為切入點，采用大鼠左冠狀動脈結扎的缺血再灌注模型，進一步探討了黃芪多糖對缺血再灌注損傷心肌的保護作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 健康清潔級成年雄性SD大鼠48只，體質量（220±40）g，由遼寧醫(yī)學院實驗動物中心提供，動物合格證號：SCXK（遼）2009-0004。

1.2 藥品與試劑 黃芪多糖，南京景竹生物科技有限公司，批號：JZ131209A；IκBα、p65 一抗：北京博奧森生物技術有限公司；腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白介素-6（IL-6）ELISA 檢測試劑盒：研域（上海）化學試劑有限公司。

1.3 分組與給藥 將48只SD大鼠按隨機數字表法隨機分為假手術組（Sham組）、心肌缺血再灌注組（MI/R組）、黃芪多糖低劑量組（300 mg/kg），黃芪多糖高劑量組（600mg/kg）。假手術組只穿線不結扎，MI/R組結扎30min，再灌注120min。本實驗根據以往研究結論[7-8]和預實驗結果采用了300 mg/kg和600 mg/kg黃芪多糖于造模前7 d灌胃給予，1次/日。

1.4 方法

1.4.1 模型制備 大鼠術前12 h禁食不禁飲，20%烏拉坦腹腔注射麻醉大鼠，氣管插管，接人工呼吸機（頻率55次／分，潮氣量15 mL/kg），四肢皮下插入針型電極記錄心電圖，并接心電監(jiān)護儀監(jiān)測心電變化。在胸骨左緣2、3肋間開胸，暴露心臟，剔除心包，于肺動脈圓錐和左心耳之間距主動脈根部1 mm處找到左冠狀動脈，穩(wěn)定10 min后，用剪去一條的細塑料管并行血管套于血管處，用3-0無創(chuàng)傷縫合線結扎套有塑料管的冠狀動脈，30 min后，用眼科剪刀剪去結扎線，移去管墊，再灌注120 min后取材測指標[9-10]。結扎后心電圖ST-T抬高，放松后ST-T回落50%為造模成功標志。

1.4.2 HE染色 再灌注后取下心肌組織置于10%甲醛液中保存48 h。固定脫水，石蠟包埋，連續(xù)切片，片厚 5 μm，60 ℃烤片，伊紅，蘇木素染色封片[11]，正置顯微鏡下拍照。

1.4.3 心肌梗死范圍測量 再灌注后取出心臟，切去心房及右心室，放入冰箱速凍1 h，在冠脈結扎線下平行于冠狀溝將心室等厚切成5片，放入0.1%氯化硝基四氮唑藍（NBT）溶液中，于37℃恒溫水浴振搖染色10 min。正常心肌染色為暗藍色，梗死區(qū)心肌不著色為淺紅色，用4%的多聚甲醛固定,分開梗死區(qū)與非梗死區(qū)心肌,計算梗死面積百分比。梗死面積%＝（梗死區(qū)心肌質量/整個左心室質量）%。

1.4.4 ELISA檢測血清TNF-α和IL-6含量 大鼠頸動脈取血，離心后收集上層血清，按試劑盒說明書操作測定血清中TNF-α和IL-6含量。

1.4.5 IκBα、p65蛋白表達的檢測 取部分梗死區(qū)心肌組織，用PBS沖洗，置于－70℃冰箱備用。測定指標時，取出樣品，BCA法蛋白定量。然后每組取10 μL樣品以及蛋白標準物點樣，進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，初始電壓為90 V，觀察Marker的移動情況，適時終止電泳。轉膜、封閉、洗膜，切割后分別與其特定的稀釋過的IκBα、p65一抗4℃雜交過夜，用洗膜液洗膜3次后與稀釋過的二抗反應，搖床上雜交1 h，再次洗膜3次，加ECL顯色，化學發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)檢測。

1.4.6 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件進行數據統(tǒng)計，計量資料以均數±標準差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 不同處理因素對心肌形態(tài)學變化的影響 假手術組心肌組織肌纖維排列整齊，無凋亡和炎性細胞侵潤的形態(tài)學變化。模型組心肌組織肌纖維排列紊亂，部分出現(xiàn)斷裂，有少量炎性細胞浸潤。而高劑量黃芪多糖組可部分改善上述心肌組織的形態(tài)學變化。見圖1。

2.2 心肌梗死面積結果 與缺血組相比，黃芪多糖低劑量組可縮小心肌組織的梗死面積，而黃芪多糖高劑量組心肌組織梗死面積進一步減小。見表1。

表1 各組大鼠心肌梗死面積結果（±s）Tab.1 Myocardial infarct sizes in each group（±s）

表1 各組大鼠心肌梗死面積結果（±s）Tab.1 Myocardial infarct sizes in each group（±s）

注：與 Sham 組比較，**P＜0.01；與 MI/R 組比較，#P＜0.05，##P＜0.01。

組別Sham組MI/R組黃芪多糖低劑量組黃芪多糖高劑量組n6666劑量（mg/kg） 梗死面積（%）-1.36±0.0840.98±6.63**300 32.13±4.14#600 26.23±3.86##-

2.3 黃芪多糖對大鼠血清TNF-α和IL-6含量的影響 如表2所示，心肌缺血再灌注損傷時大鼠血清中TNF-α和IL-6含量顯著增加，黃芪多糖可不同程度的降低上述炎癥因子的增加。

圖1 心肌組織形態(tài)學變化Fig.1 Morphological changes in heart tissue of different groups

表2 黃芪多糖對TNF-α和IL-6含量（±s）Tab.2 Effects of APS on TNF-α and IL-6 content（±s）ng/L

表2 黃芪多糖對TNF-α和IL-6含量（±s）Tab.2 Effects of APS on TNF-α and IL-6 content（±s）ng/L

注：與 Sham 組比較，**P＜0.01；與 MI/R 組比較，##P＜0.01。

組別Sham組MI/R組黃芪多糖低劑量組黃芪多糖高劑量組n 6 6 6 6劑量（mg/kg）--300600 TNF-α 25.7±4.2154.8±8.6**105.3±4.9##60.8±9.7##IL-659.8±6.3148.8±6.6**110.6±8.3##89.8±9.7##

2.4 黃芪多糖對心肌組織IκBα、p65蛋白表達的影響 缺血再灌注損傷時，IκBα表達降低，而p65表達增加，提示缺血再灌注損傷時有NF-κB通路激活。黃芪多糖預處理可降低p65表達而增加IκBα表達，表明黃芪多糖對心肌缺血再灌注損傷激活的NF-κB有一定的抑制作用。見圖2。

圖2 IκBα、p65蛋白表達Fig.2 Protein expression of IκBα and p65

3 討論

心肌缺血再灌注損傷是導致心肌急慢性損傷的重要病理生理過程，雖然這一復雜病理生理過程的機制還不是很明確，但大量研究顯示炎癥反應在這一過程中發(fā)揮了重要作用。核轉錄因子-κB（NF-κB）是一種具有基因轉錄多向調控作用的核轉錄因子。NF-κB最常見的是由p65與p50或p52組成的同源或異源二聚體，生理條件下，IкBα通過其特征性錨定蛋白與NF-кB二聚體結合，掩蓋其核定位信號，從而抑制NF-кB活性[12]。缺血再灌注損傷時IкBα蛋白降解，與NF-кB解離，使其活化。NF-кB的活性增加可使炎癥因子如TNF-α，IL-6等釋放[13]。TNF-α的釋放增加可降低心肌收縮性，降低血壓，促進中性粒細胞黏附等，加重炎癥反應發(fā)生，使缺血的心肌損傷進一步惡化[14]，因此抑制NF-кB活化，抑制炎癥反應對心肌缺血在灌注損傷具有重要意義。

本研究發(fā)現(xiàn)在缺血再灌注損傷發(fā)生后，炎癥因子表達增加，p65表達增加，而IкBα表達降低，證實了上述說法。黃芪多糖預處理后改善了心肌組織的形態(tài)學變化，降低心肌梗死面積，提示黃芪多糖對缺血再灌注損傷的心肌有一定的保護作用。進一步研究顯示黃芪多糖在改善缺血再灌注損傷的同時，降低了缺血再灌注損傷所致的TNF-α，IL-6含量增加，抑制了p65蛋白表達增加，增加了IкBα蛋白表達，提示黃芪多糖對缺血再灌注損傷的保護作用可能是通過抑制NF-кB，進而抑制炎癥反應相關。本研究結果進一步證實了黃芪多糖對缺血再灌注心肌的保護作用，為中藥黃芪的開發(fā)提供了參考。

[1] Huang WM,Liang YQ,Tang LJ,et al.Antioxidant and anti-inflammatory effects of Astragalus polysaccharide on EA.hy926 cells[J].Exp Ther Med，2013,6(1):199-203.

[2] 趙美蓉，周 潔.黃芪多糖對惡性腫瘤化療后骨髓抑制的影響[J].天津中醫(yī)藥，2007,24(2):114-115.

[3] Chen W,Xia Y,Zhao X,et al.The critical role of Astragalus polysaccharides for the improvement of PPARα [correction of PPRAα]-mediated lipotoxicity in diabetic cardiomyopathy[J].Plos One，2012,7(10):e45541.

[4] 孫雪芳，王洪新，梁靈君，等.何海洋黃芪多糖通過TLR4/NF-KB信號通路抑制脂多糖誘導的大鼠心肌細胞肥大[J].中國藥理學通報,2013,29(2):208-212.

[5] 張 灼，陳立新，宋崇順，等.黃芪多糖對大鼠心肌缺血-再灌注損傷后的保護作用[J].中國中醫(yī)藥信息雜志,2007,14(2):33-34

[6] Liang X,Huang J,Lin X,et al.The Effect of 17-Methoxyl-7-Hydroxy-Benzene-Furanchalcone on NF-κB and the Inflammatory Response During Myocardial Ischemia Reperfusion Injury in Rats[J].J Cardiovasc Pharmacol,2014,63(1):68-75.

[7] Zou F,Mao XQ,Wang N,et al.Astragalus polysaccharides alleviates glucose toxicity and restores glucose homeostasis in diabetic states via activation of AMPK[J].Acta Pharmacol Sin,2009,30(12):1607-1615.

[8] 宋 瑩,王洪新,張 晶,等.黃芪多糖對腹主動脈縮窄致大鼠心肌肥厚能量代謝紊亂的抑制作用[J].中國藥理學與毒理學雜志,2012,26(2):177-182.

[9] 王 怡，王少峽，任 明，等.首烏丹參方預處理對缺血再灌注損傷大鼠心肌保護作用研究[J].天津中醫(yī)藥，2006,23（5）：413-416.

[10] Lin J,Wang H,Li J,et al.κ-Opioid receptor stimulation modulates TLR4/NF-κB signaling in the rat heart subjected to ischemiareperfusion[J].Cytokine,2013,61(3):842-848.

[11] 趙海濱，張秀靜,王帥,等.BMSCs“歸巢”在AMI后心肌重塑中的作用及活血化瘀藥的干預研究 [J].天津中醫(yī)藥大學學報,2013,32（1）：29-31.

[12] 張 蕊，馬 璇，劉 琳，等.藻藍蛋白對2型糖尿病大鼠胰島細胞NF-κB和IκB表達的影響[J].天津中醫(yī)藥大學學報,2010,29（1）：27-29.

[13] Wu Y,Liu Y,Huang H,et al.Dexmedetomidine inhibits inflammatory reaction in lung tissues of septic rats by suppressing TLR4/NF-κB pathway[J].Mediators Inflamm,2013,562154:1-9.

[14] Shimamoto A,Chong AJ,Yada M,et al.Inhibition of Toll-like receptor 4 with eritoran attenuates myocardial ischemia–reperfusion injury[J].Circulation,2006,114(1 Suppl):1270–1274.