優(yōu)化米曲霉固體發(fā)酵生產輔酶Q10的研究

李 豪

(1.馬鞍山師范高等?？茖W校，安徽馬鞍山243041;2.西華大學生物工程學院，四川成都610039)

輔酶Q10［1］簡寫為CoQ10，又稱泛醌或癸烯醌，它的化學結構為6位碳上連有一個10單位異戊二烯側鏈的2，3－二甲氧基－5－甲基－1，4－苯醌衍生物，具體見圖1［2］.輔酶Q10是一種脂溶性天然維生素類物質，在生物體內起遞氫體的作用［3］，輔酶Q10是細胞代謝激活劑和天然抗氧化劑，能抑制線粒體的過氧化，在心血管疾病的治療中發(fā)揮著重要作用，可以提高人體免疫力，廣泛運用于保健和治療領域［2－4］.其作為醫(yī)藥、食品添加劑已被應用，但由于產量低，輔酶Ql0不僅在國際市場上供不應求，在國內的市場缺口也很大.對輔酶Q10的生產技術進行研究改進就非常必要.

米曲霉(Aspergillus oryzae)一種真菌，絲孢綱，絲孢目，從梗孢科，米曲霉是異養(yǎng)需氧微生物，輔酶Q10是呼吸鏈上的重要物質，米曲霉細胞內也應該存在輔酶Q10，基于此本項目探索利用米曲霉生產輔酶Q10.

對CoQ10的微生物發(fā)酵生產以液體培養(yǎng)方法為主，與液態(tài)培養(yǎng)相比固態(tài)培養(yǎng)具有生產本低、操作簡便等優(yōu)點，因此本試驗選用價格較為低廉的農副產品大豆、麥麩和谷糠為原料，對米曲霉進行固態(tài)發(fā)酵研究.微生物發(fā)酵法對菌種、發(fā)酵條件等技術要求較高，要使高產菌株的高產性能充分表現(xiàn)，必須保證菌體生長及產物生成所必需的最佳條件［5］.本研究應用配方均勻設計和正交設計分別對固體培養(yǎng)主要成分以及固體培養(yǎng)條件進行系統(tǒng)優(yōu)化分析，使米曲霉固體發(fā)酵生產輔酶Q10的后續(xù)研究及規(guī)?；l(fā)酵生產提供依據(jù).

圖1 輔酶Q10分子結構圖Fig.1 The structure of the coenzyme Q10 molecule

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

米曲霉(Aspergillus oryzae)2077，購于中國工業(yè)微生物菌種保藏中心;大豆，水分11%，購于馬鞍山市安民農副產品交易市場;斜面培養(yǎng)基馬鈴薯蔗糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)，0.1 MPa滅菌30 min;麩皮培養(yǎng)基:麩皮90 g，水100 mL，自然pH值，適量裝入500 mL三角瓶中，121℃滅菌30 min，溫度降低至室溫搖散備用.

標準樣品:輔酶Q10標準品購買自Sigma;青霉素鈉，石藥集團河北中潤制藥有限公司生產，配制成100 U/mL的青霉素鈉溶液后使用;石油醚、無水乙醇等試劑化學藥品均為國產分析純.

UV759型紫外－可見分光光度計:上海精密科學儀器有限公司制造;恒溫培養(yǎng)箱DNP－9022－1A，上海三發(fā)儀器有限公司制造.

1.2 試驗方法

1.2.1 孢子懸浮液制米曲霉孢子懸浮液制備

首先將米曲霉PDA斜面培養(yǎng)基上活化，然后分別挑取活化好的菌絲接種到裝有麩皮培養(yǎng)基的三角瓶上進行擴大培養(yǎng)，活化和擴大培養(yǎng)條件均為溫度30℃、時間3 d，向三角瓶加入適量的質量分數(shù)為0.9%生理鹽水，振蕩后，用無菌紗布過濾，濾液用0.9%的生理鹽水稀釋，制成1×107～5×107個/mL的孢子懸浮液備.

1.2.2 固體培養(yǎng)與輔酶Q10檢測

發(fā)酵培養(yǎng):在500 mL三角瓶中加入100 g設計好的培養(yǎng)基，加入一定比例水后，攪拌均勻后于121℃殺菌30 min，冷卻至室溫，按每瓶固體培養(yǎng)基5 mL孢子懸液接種，攪拌均勻后，于35℃培養(yǎng)48 h后，加入一定時間后加入一定體積100 U/mL的青霉素鈉溶液，混合均勻后繼續(xù)培養(yǎng)一定時間，按照王根華等［6］研究的輔酶Q10的提取及測定方法進行檢測.

2 結果與討論

2.1 培養(yǎng)基配方優(yōu)化設計

選取了大豆、麥麩和谷糠為培養(yǎng)基的主要成分，其含量分別記作x1、x2和x3，進行配方均勻設計［7］，選取UM15(153)表安排試驗.三種成分含量之和為1，在表1中只列出了x1和x2，則x3=1－x1－x2.研究方案和結果y(越大越好)見表1，指標y為輔酶Q10的產量，單位是mg·g－1干培養(yǎng)基.

表1 均勻配方設計方案與試驗結果表Table 1 Formula experiment results by Uniform design

應用Excel軟件進行回歸分析得二元二次方程為:

y=0.093+1.269x1+1.552x2 －1.706x1x2 －1.131x1x1 －1.111x2x2

復相關系數(shù)為0.96，回歸效果的方差分析見表2.

表2 回歸效果的方差分析Tab.2 The analysis of variance table of the regression effect

由復相關系數(shù)和方差分析研究的結果表明所建立的回歸方程非常顯著，該數(shù)學模型能夠很好的反映配方中成分含量對指標輔酶Q10產量的影響.由于輔酶Q10產量的影響越大越好，運用Excel軟件，得到y(tǒng)最大值為0.638，培養(yǎng)基的最優(yōu)配方為x1=8.20%，x2=63.53%和 x3=28.27%，即大豆8.20%、麥麩63.53%和谷糠28.27%.回歸方程所得配方與第12號實驗配方非常接近，并且回歸值與實驗值也非常接近，說明所得最優(yōu)配方可行可靠，能夠進行實際應用.

2.2 固體發(fā)酵條件的優(yōu)化

2.2.1 因素水平的確定

在確定培養(yǎng)基的基礎上對固體發(fā)酵條件進行優(yōu)化，由于CoQ10是胞內產物，通過改變細胞壁或細胞膜的結構可以增大胞內物質的溶解速率和細胞壁的通透性［8］，進而提高其產量.本研究基于此嘗試在固體培養(yǎng)中加入適量青霉素鈉，探索其對CoQ10產量的影響.在預試驗的基礎上，確定了青霉素鈉加入量、發(fā)酵溫度、料水比和發(fā)酵時間為發(fā)酵過程中要重點考慮的四個因素進行正設計法優(yōu)化發(fā)酵工藝.具體因素水平見表3.

表3 正交實驗水平因素表Tab.3 Orthogonal experimental factors and levels

2.2.2 固體發(fā)酵影響因素正交實驗結果直觀分析

按照表3因素水平數(shù)據(jù)，選取L9(34)正交表設計試驗方案，得到試驗結果，并進行直觀分析，見表4.

表4 L9(34)正交設計方案及試驗結果直觀分析Tab.4 L9(34)orthogonal test result and visual analysis of table

由表4數(shù)據(jù)直觀分析可知，因素對發(fā)酵結果的影響大小為C﹥A﹥B﹥D，結合正交設計得到的因素與指標關系趨勢圖

圖2，可得優(yōu)方案為C2A1B2D2，即料水比為1、青霉素鈉加入量為3 mL、發(fā)酵溫度40℃、發(fā)酵時間96 h為較優(yōu)固體培養(yǎng)條件.按照2.1所優(yōu)化的培養(yǎng)基和該固體較優(yōu)發(fā)酵條件下，CoQ10的產量三次平均值為0.947/mg·g－1干培養(yǎng)基.

圖2 因素與指標關系圖Fig.2 the Relationship between Factors and Indicator

3 結論

利用配方均勻設計方法成功獲得固體培養(yǎng)基主要成分的較優(yōu)比例，表明配方均勻設計方法是確定培養(yǎng)基配方的高效快速方法，其高效快速性主要體現(xiàn)在不需要做單因素試驗，而且方案中的各試驗可同時平行進行，節(jié)約了時間，該方法可以作為優(yōu)化培養(yǎng)基配方的高效快速方法.

本實驗發(fā)酵過程分為兩個過程，第一個階段是菌種在適應的條件下快速生長繁殖，達到較高濃度的菌體量，發(fā)酵時間為48 h，第二階段是加入一定量的青霉素鈉的后發(fā)酵階段，該階段菌體的生長受到抑制，在青霉素鈉的作用下，細胞膜通透性增加，有利于胞內物向胞外擴散，從而誘導CoQ10的生產，第二階段是產CoQ10的主要階段.

以CoQ10的產量為指標，優(yōu)化后的固體培養(yǎng)基主要成分百分比為大豆8.20%、麥麩63.53%和谷糠28.27%.應用正交設計確定100 g培養(yǎng)基固體的較優(yōu)培養(yǎng)條件為:料水比為1、青霉素鈉加入量為3 mL、發(fā)酵溫度40℃、發(fā)酵時間96 h.通過對培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件的優(yōu)化得到米曲霉2077產輔酶Q10的最大值為0.947/mg·g－1干培養(yǎng)基.本結果與白娟［9］利用總狀毛霉生產固體發(fā)酵所得輔酶Q10產量0.65299/mg·g－1干培養(yǎng)基有所提高.

［1］ Littarru G P，Ho L.Folkers K.Deffieieney of Coenzyme Q10 inhuman heart disease［J］.PartⅠ and Ⅱ.Internat.J.Vit.Nutr.Res.，1972，42(2):413.

［2］ 吳祖芳，翁佩芳，陳堅.輔酶Q10的功能研究進展［J］.寧波大學學報 (理工版)，2001，14(2):85－88.

［3］ Beal M F，Matthews R T.Coenzyme Q10 in the central nervous system and its potential usefulness in the treatment of neurode generative diseases［J］.Mol Aspects Med，1997，18:169 －179.

［4］ Greenberg S，F(xiàn)rishman W H.Coenzyme Q10:A new drug for cardiovascular disease［J］.Clin Pharmacol，1990，30:596 －608.

［5］ 于子玲，袁亞宏，岳田利，等.響應曲面法優(yōu)化輔酶Q10產生菌發(fā)酵培養(yǎng)基［J］.食品工業(yè)科技，2012，33(18)186－189.

［6］ 王根華，錢和，肖剛.發(fā)酵菌體中輔酶Q10的提取及測定方法［J］.無錫輕工大學學報，2003，23(2):59－62.

［7］ 李云雁，胡傳榮.試驗設計與數(shù)據(jù)處理［M］.北京:科學出版社，2008.

［8］ 孫彥.生物分離工程［M］.北京:化學工業(yè)出版社，1998.16－22.

［9］ 白娟.總狀毛霉固體發(fā)酵產輔酶Q10的研究［D］.西安:西安建筑科學大學，2010.