一株沙雷氏菌的分離及其群體感應(yīng)現(xiàn)象

張彩麗 朱素琴 汪映 孫秀嬌 曾名湧

（中國海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，青島 266003）

群體感應(yīng)（Quorum sensing，QS）［1]是細菌之間相互交流的一種方式，細菌通過產(chǎn)生一種自誘導(dǎo)物（Autoinduced，AI）而相互感知，自誘導(dǎo)物隨著細菌密度增加而增加，當達到一定閾值時，會誘導(dǎo)細菌某些特定基因的表達。自1970年首次發(fā)現(xiàn)費氏弧菌（V. fischei）的發(fā)光［2]與細菌密度有關(guān)以來，許多研究證明群體感應(yīng)可調(diào)控細菌的生理特性，如銅綠假單胞菌（P.aeruginosa）生物膜的形成［3]，副溶血弧菌（V. parahaemolyticus）胞外酶的分泌［4]及霍亂弧菌（V. cholerae）毒力因子［5]的表達等。革蘭氏陰性菌主要存在LuxI/LuxR系統(tǒng)并以N-?；呓z氨酸內(nèi)酯類（N-acyl-homoserine lactones，AHLs）［6]物質(zhì)作為信號分子，其中LuxI蛋白負責信號分子的合成，LuxR蛋白作為信號分子受體，通過形成受體-自誘導(dǎo)物復(fù)合體，啟動目的基因的轉(zhuǎn)錄表達。革蘭氏陽性菌［7]通過雙組分的群體感應(yīng)系統(tǒng)分泌寡肽類（Autoinducing peptides，AIPs）信號分子。Bassler［8]在哈維氏弧菌（V. harveyi）中發(fā)現(xiàn)了一種依賴于LuxS蛋白的細菌間交流的信號分子（Autoinducer-2，AI-2），并證明AI-2是一種呋喃酮硼酸二酯（Furanosyl borate diester）。

沙雷氏菌（Serratia marcescens）是腸桿菌科的一種條件致病菌［9]，存在于土壤、水、植物、動物以及人類的腸道和呼吸道中，在機體免疫力降低或環(huán)境污染時，可引起原發(fā)性和不同程度的繼發(fā)性感染。該菌屬能夠產(chǎn)生核酸酶、蛋白酶、脂肪酶等次級代謝產(chǎn)物對人類存在潛在危害。目前已有研究證明沙雷氏菌的生物膜形成、群集運動等性狀受群體感應(yīng)調(diào)控［10]。因此，研究水產(chǎn)品中沙雷氏菌的群體感應(yīng)，將為沙雷氏菌的防治和水產(chǎn)品的保鮮提供理論指導(dǎo)。

本試驗從腐敗凡納濱對蝦中分離出一株具有群體感應(yīng)現(xiàn)象的沙雷氏菌S.marcescensAK1，并對其群體感應(yīng)信號分子進行檢測，旨為沙雷氏菌群體感應(yīng)調(diào)控的致病性研究提供一定科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗菌株 菌株S. marcescensAK1分離于腐敗的凡納濱對蝦中，保存于本實驗室。群體感應(yīng)報告菌株紫色桿菌（Chromobacterium violaceum）CV026和根癌農(nóng)桿菌（Agrobacterium tumefaciens）A136（pCF218）（pCF372）均由美國德克薩斯州立大學(xué)McLean RJC教授惠贈。CV026可檢測碳鏈長度從C4到C8［11]的信號分子，而A136可檢測較寬范圍的信號分子［12]，從C4到C14，3-oxo-C4到3-oxo-C12均可檢測。CV026和A136本身均不產(chǎn)生AHLs，當存在外源AHLs時，紫色桿菌CV026將產(chǎn)生紫色桿菌素；根癌農(nóng)桿菌A136表達lacZ基因，分解X-gal產(chǎn)生藍色。

1.1.2 培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件 菌株S. marcescensAK1、CV026、A136在30℃下培養(yǎng)于LB肉湯或LB瓊脂培養(yǎng)基中［13]。CV026需添加50 μg/mL的卡那霉素，A136添加4.5 μg/mL四環(huán)素和50 μg/mL壯觀霉素。

1.1.3 主要試劑和儀器 X-gal（5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-吡喃半乳糖苷）、壯觀霉素、四環(huán)素、卡那霉素、N-?；呓z氨酸內(nèi)酯（C6-HSL、C8-HSL、3-oxo-C6-HSL）購自Sigma公司；RP-C18 F254反相薄層層析板購自德國Merck公司。

1.2 方法

1.2.1 分離純化菌株 從腐敗的蝦中利用平板稀釋法進行細菌的分離、純化。根據(jù)細菌菌落特征、革蘭氏染色、鏡檢、生理生化試驗對菌株AK1進行鑒定。

1.2.2 提取菌株16S rRNA 菌株AK1液體條件下培養(yǎng)至生長對數(shù)期（OD≈1.0），取2 mL新鮮菌液10 000 r/min離心2 min后棄去上清，利用EZ-10柱式細菌基因組DNA抽提試劑盒（上海生工生物工程股份有限公司）提取基因組DNA，所得DNA于-20℃保存。以提取DNA為模板擴增16S rRNA，PCR體系為50 μL：模板3 μL，dNTPs（2.5 mmol/L）5 μL，引物（1 mmol/L）各1 μL，10×Taq緩沖5 μL，MgCl23 μL，Taq酶1 μL，滅菌超純水31 μL。PCR引物序列為27F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'；1492R：5'-ACGGCTACCTTGTTACGACTT-3'。PCR反應(yīng)條件：95℃ 5 min，95℃ 30 s，56℃ 30 s，72℃1 min，共30個循環(huán)后，72℃10 min。將PCR產(chǎn)物利用0.6%瓊脂糖凝膠電泳。PCR產(chǎn)物送往上海生工生物工程股份有限公司測序。

1.2.3 檢測菌株群體感應(yīng)現(xiàn)象

1.2.3.1 報告菌株平板劃線法 根據(jù)文獻［14] 的方法，將被檢測菌株與報告菌株CV026在LB平板上平行劃線；用報告菌株A136時，需先在LB平板上涂布20 μL X-gal（20 mg/mL），無菌風(fēng)吹干后，28℃培養(yǎng)18-24 h觀察。分別以報告菌株自身作為陰性對照，以C6-HSL作為陽性對照。

1.2.3.2 制備粗提液 菌株AK1在LB肉湯中過夜培養(yǎng)至一定密度（OD≈1.0），10 000 r/min離心5 min，取上清，用等量乙酸乙酯提取3次，混合有機相，30℃水浴旋蒸至干，溶解于1 mL甲醇，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3.3 TLC-Biosensor檢測 分別將信號分子標準品與乙酸乙酯提取物2-5 μL點樣于C18反相薄層層析板，利用甲醇/水（6040，V/V）充分展開，取出后在常溫下?lián)]干溶劑，按制備報告平板方法制備含A136菌、抗生素、X-gal的瓊脂，傾到于薄層層析板上，凝固后，28℃培養(yǎng)18-24 h觀察。以不含A136菌的瓊脂覆蓋作對照。

1.2.4 測定不同時間信號分子含量 過夜活化的菌株AK1接種于液體LB培養(yǎng)基，每隔4 h取50 mL菌液，按照1.3.2方法提取信號分子。參照文獻［15] 略作修改，β-半乳糖苷酶法檢測信號分子活性，96孔板中依次加入100 μL生理鹽水、100 μL過夜培養(yǎng)A136（OD≈1.0），2.5 μL X-gal，2.5 μL提取物，以LB液體培養(yǎng)基提取物做對照，28℃搖床（150 r/min）培養(yǎng)8-12 h，測定A635。按照1.2.3.1方法制備含A136菌、抗生素、X-gal的報告平板，點樣2 μL提取物于滅菌圓紙片，無菌風(fēng)吹干，放置報告平板上，28℃培養(yǎng)18-24 h觀察。

2 結(jié)果

2.1 菌株生化試驗

將分離純化的細菌進行生理生化試驗，結(jié)果顯示，AK1革蘭氏染色陰性、氧化酶試驗陰性和葡萄糖酸鹽試驗陽性、苯丙氨酸脫氨酶試驗陰性；不能產(chǎn)H2S；能利用葡萄糖、乳糖、果糖、海藻糖、山梨醇發(fā)酵產(chǎn)酸；不能利用阿拉伯糖；賴氨酸脫羧酶陽性、DNA酶試驗陽性，β-半乳糖苷酶陽性。根據(jù)伯杰士手冊和腸桿菌科檢索系統(tǒng)［16]鑒定其為黏質(zhì)沙雷氏菌。

2.2 16S rRNA

將菌株AK1的16S rRNA（圖1）序列提交NCBI數(shù)據(jù)庫進行Blast比對，結(jié)果顯示該菌株與沙雷氏菌序列相似度超過99%。利用ClustalX1.8 軟件排序，MEGA4.1軟件按照Neighbour-Joining聚類，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹如圖2所示。

圖1 菌株AK1的16S rRNA PCR擴增產(chǎn)物電泳圖

圖2 沙雷氏菌AK1與其他沙雷氏菌之間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系

2.3 平板劃線法檢測群體感應(yīng)

報告菌株CV026和A136與待測菌株AK1平行劃線結(jié)果如圖3所示，菌株AK1可以誘導(dǎo)紫色桿菌CV026產(chǎn)生紫色色素，誘導(dǎo)A136水解X-gal產(chǎn)生藍色。陰性對照無顏色變化，陽性對照分別產(chǎn)生紫色和藍色。因菌株AK1具有β-半乳糖苷酶活性，所以在A136平板上可看到菌株AK1也變?yōu)樗{色。

2.4 TLC-Biosensor

反相薄層層析法分析結(jié)果顯示，對照不產(chǎn)生藍色，表明粗提物不是能水解X-gal的β-半乳糖苷酶。含A136的TLC板顯示烷酰基類型信號分子遷移良好，形成規(guī)整圓形，而氧代信號分子則具有拖尾現(xiàn)象。根據(jù)遷移值及形狀與標準品比對，菌株AK1可以產(chǎn)生兩種信號分子C6-HSL和3-oxo-C6-HSL。報告菌株A136對氧代信號分子較敏感，圖4顯示3-oxo-C6-HSL顯色范圍較大。該菌產(chǎn)生的信號分子類型可能還有其他種類，其含量可能因太低而無法利用TLCBiosensor方法檢測到，信號分子的進一步確定需依賴于HPLC/MS或GC/MS。

圖3 利用報告菌株CV026和A136分別平行劃線檢測菌株AK1信號分子

圖4 TLC檢測AHLs

2.5 不同時間信號分子含量

菌株AK1不同時間的信號分子分泌規(guī)律（圖5）顯示，菌株AK1在對數(shù)前期便開始產(chǎn)生信號分子且具有密度依賴性，對數(shù)后期（約16 h）達到最大值（約為對數(shù)前期的3.2倍），隨著細菌進入衰亡期，信號分子的含量也減少。報告平板法結(jié)果（圖6）與此一致。測定培養(yǎng)基的pH值，到達穩(wěn)定期后，由于次級代謝產(chǎn)物的積累，培養(yǎng)基pH值從開始的pH6.97（0 h）增加到pH7.40（16 h），并在穩(wěn)定期達到pH8.10（24 h）。N-?；呓z氨酸在堿性條件下不穩(wěn)定，信號分子的減少可能由于培養(yǎng)基pH值的改變。

圖5 β-半乳糖苷酶法檢測菌株AK1上清中AHLs變化

圖6 利用報告菌株A136檢測菌株AK1上清中AHLs變化

3 討論

革蘭氏陰性菌利用N-?；呓z氨酸內(nèi)酯類化合物作為相互交流的信號分子［17]早有報道，國內(nèi)外基于AHLs生物表達報告基因（如lacZ，gfp，luxCDABEG）已構(gòu)建多種不同特異性的基因工程菌株。本研究利用群體感應(yīng)報告菌株CV026和A136對腐敗凡納濱對蝦中分離的粘質(zhì)沙雷氏菌AK1的群體感應(yīng)進行檢測，均呈現(xiàn)陽性結(jié)果。利用TLCBiosensor法檢測信號分子類型，結(jié)果顯示菌株AK1能產(chǎn)生3-oxo-C6-HSL和C6-HSL信號分子，與Yu TzeHorng 報道的S. marcescensSS-1［18]產(chǎn)生的信號分子類型一致，S. marcescensSS-1可產(chǎn)生至少4種群體感應(yīng)信號分子3-oxo-C6-HSL、C6-HSL、C7-HSL和C8-HSL。S. marcescensMG1，S. plymuthicaRVH1和S. proteamaculansB5a均可產(chǎn)生C6-HSL?？梢姡珻6-HSL信號分子在沙雷氏菌屬中較為普遍。菌株AK1可能還產(chǎn)生其他類型信號分子，需借助更靈敏方法進行鑒定。AK1產(chǎn)生的兩種信號分子中，3-oxo-C6-HSL含量較為豐富，而C6-HSL相對較低。同時，利用β-半乳糖苷酶法和報告菌株法對菌株AK1產(chǎn)信號分子能力進行評價，結(jié)果顯示AK1具有較強的信號分子產(chǎn)生能力，進入對數(shù)初期（約4 h）便可產(chǎn)生信號分子，對數(shù)末期（約16 h）達到最大值，約為對數(shù)初期的3.2倍。由于堿性次級代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生或自身的利用，信號分子在穩(wěn)定期減少但仍能維持較長時間。

沙雷氏菌易于存活，生物膜形成能力強，使其對環(huán)境和抗生素有較強的抵抗力，由于它具有鞭毛調(diào)節(jié)的群集運動分化行為，因而加大了其對自然界的侵襲能力。群體感應(yīng)作為一種細菌相互交流的“語言”，當細菌釋放的信號分子達到一個臨界閾值時，會相互感知，協(xié)調(diào)它們之間的生理行為。群體感應(yīng)調(diào)控沙雷氏菌的多種生理行為［19]，包括S.plymuthicaRVH1 核酸酶、蛋白酶、幾丁質(zhì)酶的產(chǎn)生；Serratia spATCC 39006抗生素的產(chǎn)生；S. marcescensMG1生物膜的形成等。生物膜和群集運動增強了沙雷氏菌對環(huán)境和抗生素的抵抗力，對人類造成潛在危害，然而受群體感應(yīng)調(diào)控的沙雷氏菌產(chǎn)生的某些抗生素和靈紅素［20]，具有抗菌、抗瘧原微生物活性。因此，探究沙雷氏菌的群體感應(yīng)現(xiàn)象，可以為沙雷氏菌的防治和利用提供依據(jù)。

本試驗從腐敗的凡納濱對蝦中分離的沙雷氏菌AK1與大部分沙雷氏菌一樣能產(chǎn)生群體感應(yīng)信號分子，但較于其他黏質(zhì)沙雷氏菌，AK1顯示出的易于生存和極強的群體感應(yīng)信號分子分泌能力，可能因為其分離環(huán)境不同，從水生環(huán)境分離后，通過迅速產(chǎn)生群體感應(yīng)信號分子應(yīng)對外界條件的改變。這些信號分子對水產(chǎn)品食源性疾病的爆發(fā)存在怎樣的威脅，沙雷氏菌與食品體系中的腐敗菌間存在怎樣的關(guān)系都有待進一步研究。通過對水產(chǎn)品中沙雷氏菌群體感應(yīng)的研究，可以為條件致病菌沙雷氏菌的防治和水產(chǎn)品的保鮮提供一定的理論依據(jù)，為食品保鮮劑和殺菌劑的研究指出新方向。

4 結(jié)論

腐敗凡納濱對蝦中分離的黏質(zhì)沙雷氏菌AK1具有極強的環(huán)境適應(yīng)能力，能產(chǎn)生兩種類型信號分子，C6-HSL和3-oxo-C6-HSL，且氧代類型較為豐富。信號分子在對數(shù)初期即可產(chǎn)生，對數(shù)末期達到最大值，并能在穩(wěn)定期維持較長時間。

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