水葫蘆胞質(zhì)型谷氨酰胺合成酶EcGS1全長(zhǎng)cDNA的克隆及序列分析

蔣麗花 傅明輝 李園枚 嚴(yán)國(guó)花 鄭李軍 陳肖麗 彭進(jìn)平

（廣東工業(yè)大學(xué)輕工化工學(xué)院，廣州 510006）

谷氨酰胺合成酶（Glutamine synthetase，GS）是植物將無(wú)機(jī)氮轉(zhuǎn)化為有機(jī)氮的第一個(gè)酶，與谷氨酸合成酶（Glutamate synthetase，GOGAT）聯(lián)合作用催化氨的同化，使其轉(zhuǎn)變成谷氨酰胺（Gln）和谷氨酸（Glu），Gln和Glu是高等植物體內(nèi)含氮有機(jī)物的生物合成最主要的供體［1]。因此GS是植物氮代謝中的關(guān)鍵酶，與植物對(duì)氮素的利用［2，3]，植物的產(chǎn)量和品質(zhì)［4]、植物的抗逆性密切相關(guān)［5-7]。高等植物中存在多種GS同工酶形式。根據(jù)亞細(xì)胞定位，植物的GS分為兩大類(lèi)，一類(lèi)是胞質(zhì)型或胞液型GS（GS1），一類(lèi)是質(zhì)體型或葉綠體型GS（GS2）。GS1為多基因編碼，目前發(fā)現(xiàn)在水稻中有3個(gè)［8]，擬南芥有5個(gè)［9]，玉米有5個(gè)［10]，土豆有2個(gè)［11]，楊樹(shù)有3個(gè)［12]。GS2一般為單基因編碼，僅在苜蓿種子的發(fā)育中發(fā)現(xiàn)了第二個(gè)GS2基因［13]。GS2的亞基的分子量為44-45 kD左右，而GS1的亞基的分子量小于38-40 kD。GS2亞基多肽的N端存在一個(gè)由50個(gè)左右的氨基酸組成的信號(hào)肽序列，起到指導(dǎo)其向質(zhì)體定位的作用，C端存在一個(gè)GS2亞基特有的由16個(gè)氨基酸組成的保守區(qū)。GS1和GS2在植物體內(nèi)起著不同的作用。GS1主要同化內(nèi)源性蛋白質(zhì)降解和氨基酸分解代謝產(chǎn)生的氨，并可能在氮素的轉(zhuǎn)運(yùn)中起作用，主要參與種子萌發(fā)時(shí)儲(chǔ)存氮源的轉(zhuǎn)運(yùn)及葉片衰老時(shí)氮源的轉(zhuǎn)移及再利用。GS2則同化經(jīng)硝酸鹽還原酶和亞硝酸鹽還原酶催化產(chǎn)生的氨，以及同化光呼吸作用產(chǎn)生的氨［14]。

水葫蘆（Eichhomia rassipes）學(xué)名鳳眼蓮，屬雨久花科鳳眼蓮屬植物，是亞熱帶和溫帶淡水水面廣泛生長(zhǎng)的一種水草。水葫蘆對(duì)水體中的氮素利用效率非常高，在富營(yíng)養(yǎng)化水體中泛濫生長(zhǎng)，破壞水體生態(tài)平衡，但適量的水葫蘆也可凈化水質(zhì)，用于富營(yíng)養(yǎng)化湖泊［15，16]及河道［17]、養(yǎng)殖廢水［18，19]、工業(yè)廢水［20，21]等方面的處理。水葫蘆為何能夠高效利用富營(yíng)養(yǎng)化水體中的氮素，目前所有的研究?jī)H在生理生化的水平上［22，23]，還未深入到分子水平。

本研究以水葫蘆谷氨酰胺合成酶cDNA為模板，克隆水葫蘆胞質(zhì)型谷氨酰胺合成酶（EcGS1）基因，推測(cè)其氨基酸序列，分析其中的保守片段，預(yù)測(cè)該序列編碼蛋白的亞細(xì)胞定位，比較該序列與其他植物中相關(guān)序列之間的相似性，并構(gòu)建分子進(jìn)化樹(shù)，旨在為進(jìn)一步深入研究EcGS1基因的功能，揭示水葫蘆高效利用氮素的分子機(jī)理奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)材料 水葫蘆采自廣州市安檢水庫(kù)。

1.1.2 主要試劑 RNAiso plus 總RNA提取試劑盒、Prime ScriptTMRT-PCR Kit、Agarose Gel DNA Purification Kit 試劑、pMD19-T vector、RACE 試劑盒均購(gòu)于TaKaRa；E. coliDH5α、DNA Marker、Taq酶、dNTP均購(gòu)自鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)（北京）有限公司。其他生化試劑和常規(guī)試劑均為超純或分析純。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)及合成 根據(jù)已公布的其他植物GS1氨基酸保守序列，用在線軟件ICODEHOP設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物，結(jié)合5'-Full RACE Kit，3'-Full RACE Core Set Ver.2.0試劑盒中的克隆方法設(shè)計(jì)進(jìn)行RACE PCR，所用引物由Invitrogen廣州公司合成，序列信息詳見(jiàn)表1。

1.2.2 總RNA的提取及cDNA第一鏈的合成 取適量幼嫩的水葫蘆根，洗凈，用液氮充分研磨粉末，總RNA的提取方法按照RNAiso plus說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。以提取的總RNA為模板，用Prime ScriptTMRTPCR Kit試劑盒方法進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，產(chǎn)物置于-20℃保存。

表 1 引物序列

1.2.3 EcGS1基因中間片段的擴(kuò)增及克隆 以cDNA第一鏈為模板，采用簡(jiǎn)并引物GS1F/GS1R，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系為：ddH2O 17 μL，Taq酶0.5 μL，buffer 2.5 μL，dNTP 1 μL，模板 2 μL，上下游引物各1 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性 5 min；94℃30 s，53℃ 30 s，72℃ 1 min，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物電泳鑒定，回收，轉(zhuǎn)入T載體，用菌落PCR篩選陽(yáng)性克隆測(cè)序。

1.2.4 5' RACE擴(kuò)增及克隆 引物采用Primer 5軟件設(shè)計(jì)，根據(jù)EcGS1基因中間片段設(shè)計(jì)其5'端擴(kuò)增的特異引物，聯(lián)合5' race outer primer/5' race inner primer，進(jìn)行5'端的巢式PCR，反應(yīng)體系同1.2.3，反應(yīng)程序?yàn)椋旱?輪（5O聯(lián)合5' race outer primer），94℃預(yù)變性 5min；94℃ 30 s，40℃ 30 s（每循環(huán)升1℃），72℃ 1 min，20個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。第2輪（5I聯(lián)合5' race inner primer），94℃ 5 min；94℃ 30 s，40℃/44℃/48℃/52℃/56℃ 30 s，72℃ 1 min，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物電泳鑒定，回收，轉(zhuǎn)入T載體，用菌落PCR篩選陽(yáng)性克隆測(cè)序。

1.2.5 3' RACE擴(kuò)增及克隆 根據(jù)根據(jù)EcGS1基因中間片段和5'端片段的序列設(shè)計(jì)其3'端的特異引物（3O/3I1/3I2），聯(lián)合3' race outer primer/3' race inner primer 對(duì)EcGS1基因3'端進(jìn)行巢式PCR，反應(yīng)體系同1.2.3，第1輪（3O聯(lián)合3' race outer primer），擴(kuò)增程序同5' RACE的第1輪反應(yīng)，第2輪（3I1聯(lián)合3' race inner primer）和第3輪（3I2聯(lián)合3' race inner primer）擴(kuò)增程序同5' RACE的第2輪反應(yīng)，PCR產(chǎn)物的電泳鑒定，回收，轉(zhuǎn)入T載體，用菌落PCR篩選陽(yáng)性克隆測(cè)序。

1.2.6 EcGS1基因全長(zhǎng)獲得 根據(jù)EcGS1基因中間片段，5'端及3'端測(cè)序結(jié)果，拼接獲得全基因序列，對(duì)序列進(jìn)行開(kāi)放閱讀框的分析，設(shè)計(jì)引物（11/12），進(jìn)行PCR。擴(kuò)增程序：94℃預(yù)變性5 min；94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 1 min，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物電泳鑒定，回收，轉(zhuǎn)入T載體，用菌落PCR篩選陽(yáng)性克隆測(cè)序。

1.2.7 EcGS1基因序列分析 用ProtParam工具分析EcGS1蛋白的理化性質(zhì)（http：//web.expasy.org/protparam/）。用PROSITE和SMART數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)EcGS1蛋白保守結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分析（http：//www.expasy.Org/prosite，http：//smart.Embl-heidelberg.De/）。利用TargetP程序預(yù)測(cè)EcGS1蛋白的細(xì)胞亞定位（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/）。利用NCBI中BLASTX對(duì)NCBI蛋白質(zhì)全庫(kù)進(jìn)行相似性搜索（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）。利用ClustalW2進(jìn)行多序列比對(duì)，用Mega4.1采用鄰接法構(gòu)建分子進(jìn)化樹(shù)。

2 結(jié)果

2.1 水葫蘆總RNA的提取

用紫外分光光度儀測(cè)定提取的水葫蘆總RNA，其OD260/280=2.0，OD260/230=2.5，說(shuō)明所提取的總蛋白質(zhì)和雜質(zhì)污染較少，純度較高。總RNA經(jīng)由1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)（圖1）。

2.2 EcGS1基因中間片段克隆及測(cè)序

PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測(cè)到一條單一條帶（圖 2），位于500 bp左右，進(jìn)行克隆及測(cè)序，得到467 bp片段，通過(guò)BLAST分析，證實(shí)為GS相似序列。

2.3 5' RACE產(chǎn)物克隆及測(cè)序

圖 1 水葫蘆總RNA電泳圖

圖 2 EcGS1基因中間片段

經(jīng)電泳檢測(cè)5' RACE第2輪擴(kuò)增產(chǎn)物（圖 3），得到一條約400 bp片段，克隆測(cè)序后發(fā)現(xiàn)，去5'race inner 引物后367 bp，其84-86位為起始密碼子ATG，與EcGS1基因中間片段有140 bp重疊序列。

圖 3 EcGS1基因5'RACE擴(kuò)增產(chǎn)物

2.4 3' RACE產(chǎn)物克隆及測(cè)序

經(jīng)電泳檢測(cè)3' RACE第3輪擴(kuò)增產(chǎn)物（圖 4），得到一條約900 bp條帶，進(jìn)行克隆測(cè)序，去3' race inner primer 后序列為883 bp，內(nèi)含mRNA 3'末端polyA，與EcGS1基因中間片段有143 bp重疊序列。

2.5 EcGS1基因cDNA全長(zhǎng)獲得

將上述3條序列拼接，得到EcGS1基因的cDNA序列，共1 434 bp，提交NCBI，獲得序列登錄號(hào)為KF683089，采用ORF分析序列，表明其中含有1個(gè)1 071 bp完整開(kāi)放閱讀框序列，編碼356個(gè)氨基酸殘基，ATG為起始密碼子，TGA為終止密碼子。根據(jù)EcGS1基因的cDNA序列設(shè)計(jì)引物，用引物11/12從水葫蘆基因組DNA中擴(kuò)增到約1 200 bp DNA片段，將其克隆測(cè)序后得到1 183 bp片段（圖5）。該測(cè)序結(jié)果與拼接結(jié)果及開(kāi)放閱讀框分析結(jié)果完全一致，證實(shí)了試驗(yàn)設(shè)計(jì)的正確性。

圖 4 EcGS1基因3'RACE擴(kuò)增產(chǎn)物

圖 5 EcGS1基因全長(zhǎng)片段

2.6 EcGS1基因編碼蛋白的氨基酸序列、保守結(jié)構(gòu)域及亞細(xì)胞定位

用ProtParam分析EcGS1基因所編碼蛋白的氨基酸序列（圖6）顯示，該蛋白分子量為39.3 kD，等電點(diǎn)為5.52。用PROSITE數(shù)據(jù)庫(kù)分析該蛋白237-253氨基酸殘基為ATP結(jié)合區(qū)域（putative ATP-binding region）{K-P-［LIVMFYA] -x（3，5）-［NPAT] -［GA] -［GSTAN] -［GA] -x-H-x（3）-S}，11-14、185-188、251-254氨基酸殘基為N-糖基化序列（N-glycosylations）N-{P}-［ST] -{P}。用SMART分析，顯示EcGS1蛋白包含了一個(gè)GS beta-Grasp domain（17-97 AA）和一個(gè)GS catalytic domain（103-351 AA）。利用TargetP程序預(yù)測(cè)EcGS1蛋白序列不存在信號(hào)肽，為胞質(zhì)蛋白。

2.7 EcGS1基因編碼的氨基酸序列與其他植物GS1相似性比對(duì)

運(yùn)用NCBI的BLASTX對(duì)蛋白質(zhì)序列全庫(kù)進(jìn)行相似性搜索，選擇其中的13條序列相似性較高的不同植物的GS1氨基酸序列，利用ClustalW2，進(jìn)行多序列比對(duì)，結(jié)果（表2）顯示，與其他物種的GS1氨基酸序列相似性在82%以上，其中與橡膠樹(shù)的相似性最高。說(shuō)明了不同植物種間GS1在氨基酸序列上保守性較高。根據(jù)水葫蘆及其他植物的GS1氨基酸序列，用Mega4.1軟件構(gòu)建GS1氨基酸序列的分子進(jìn)化樹(shù)（圖7）。

表 2 水葫蘆與其他植物的GS1氨基酸序列相似性比較

3 討論

GS1蛋白和GS2蛋白都在細(xì)胞質(zhì)中合成，GS1蛋白為胞質(zhì)型蛋白，GS2蛋白像多數(shù)質(zhì)體型的蛋白一樣，最初在細(xì)胞質(zhì)中合成前體多肽，被基質(zhì)內(nèi)的有關(guān)酶切去N端的一段肽段后，被運(yùn)輸?shù)饺~綠體內(nèi)［24]。本試驗(yàn)克隆了EcGS1基因cDNA序列，該序列編碼356個(gè)氨基酸的多肽鏈，通過(guò)BLAST相似性分析，證實(shí)EcGS1為GS1蛋白，通過(guò)TargetP程序預(yù)測(cè)，該序列沒(méi)有信號(hào)肽，為胞質(zhì)型蛋白。EcGS1分子量大小為39.3 kD，與其他GS1分子量（38-40 kD）大小一致，而與GS2分子量（44-45 kD）明顯不同。

圖 6 EcGS1基因核苷酸序列和推導(dǎo)的氨基酸序列

圖 7 水葫蘆與其他物種GS1氨基酸序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)

EcGS1與其他13種不同類(lèi)植物的GS1氨基酸序列相似性比較結(jié)果顯示，EcGS1氨基酸序列與橡膠樹(shù)的相似性最高，為93.0%，EcGS1氨基酸序列與歐洲赤松的相似性較高，為82.6%，說(shuō)明了不同植物間的GS1在氨基酸序列上保守性較高。GS是植物利用環(huán)境中氮素的關(guān)鍵酶，在植物生理過(guò)程中占有重要地位，因此，在進(jìn)化過(guò)程中承受了較大的選擇壓力，所以序列的保守性較高。通過(guò)EcGS1基因編碼的氨基酸序列保守結(jié)構(gòu)域的分析，發(fā)現(xiàn)該酶含有ATP結(jié)合序列。Llorca等［25]采用電鏡和圖像技術(shù)結(jié)合生化數(shù)據(jù)也證實(shí)了植物谷氨酰胺合成酶分子中存在ATP結(jié)合位點(diǎn)。這點(diǎn)是與其功能相一致的，谷氨酰胺合成酶在催化谷氨酸與NH4+合成谷氨酰胺時(shí)，需要消耗ATP［14]。生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)該酶還含有多個(gè)保守的N-糖基化序列，在已報(bào)道的水稻［26]、油菜［27]、茶樹(shù)［28]等植物的GS1蛋白序列也存在這些保守序列。

從分子進(jìn)化樹(shù)圖看，植物GS1的分子進(jìn)化樹(shù)與物種進(jìn)化樹(shù)并不一致。王小純等［29]報(bào)道，GS2分子進(jìn)化樹(shù)與物種進(jìn)化樹(shù)一致，而GS1的分子進(jìn)化樹(shù)與物種進(jìn)化樹(shù)并不一致，這點(diǎn)與本試驗(yàn)結(jié)果相符合，王江和張景六［30]的分析亦得出同樣結(jié)論。一個(gè)可能的原因是GS1在進(jìn)化中的分歧可能早于單子葉和雙子葉植物的分歧，但這點(diǎn)仍需要進(jìn)一步數(shù)據(jù)證實(shí)。目前，與水葫蘆在進(jìn)化上親緣關(guān)系較近的物種的GS1基因序列被測(cè)定的并不多，隨著今后更多的GS1基因序列被測(cè)定，GS1的分子進(jìn)化歷程將會(huì)被更好地揭示。

有關(guān)水葫蘆分子生物學(xué)的研究有助于揭示水葫蘆高效利用富營(yíng)養(yǎng)化水體中氮素的分子機(jī)理，為水葫蘆的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)和利用提供理論基礎(chǔ)，能夠從分子水平上揭示水葫蘆這種外來(lái)入侵植物快速入侵的機(jī)理，探討從營(yíng)養(yǎng)代謝角度調(diào)控其生長(zhǎng)的可能性。

4 結(jié)論

利用RACE技術(shù)克隆得到水葫蘆胞質(zhì)型谷氨酰胺合成酶EcGS1基因cDNA序列，序列登錄號(hào)為KF683089，序列長(zhǎng)1 534 bp，開(kāi)放閱讀框?yàn)? 071 bp，編碼356個(gè)氨基酸的多肽鏈，分子量為39.3 kD，等電點(diǎn)為5.52。EcGS1編碼的蛋白包含了ATP結(jié)合區(qū)域、N-糖基化位點(diǎn)、GS beta-Grasp功能區(qū)，GS催化功能區(qū)。EcGS1氨基酸序列與橡膠樹(shù)的GS1相似性最高，為93.0%。

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