高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時測定食用油中的16種抗氧化劑*

朱臻怡，魏云計，馮民，王小晉，熊華萱，何健

（中華人民共和國淮安出入境檢驗檢疫局，江蘇淮安 223001）

高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時測定食用油中的16種抗氧化劑*

朱臻怡，魏云計，馮民，王小晉，熊華萱，何健

（中華人民共和國淮安出入境檢驗檢疫局，江蘇淮安 223001）

利用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（HPLC-MS／MS）同時測定食用油中16種抗氧化劑。食用油中的抗氧化劑經(jīng)正己烷溶解、含L-抗壞血酸棕櫚酸鹽的乙腈萃取后，經(jīng)C18柱分離，乙腈-0.1%甲酸溶液體系為流動相進行梯度洗脫，多反應(yīng)監(jiān)測模式（MRM）檢測，外標法定量。16種抗氧化劑呈良好的線性關(guān)系（r2=0.991 2～0.998 8），方法的測定低限為0.1～0.5 mg／kg，在測定低限濃度水平下的平均回收率為78.6%～101.2%，相對標準偏差為3.50%～13.19%（n=10）。該方法準確、靈敏、重現(xiàn)性好，可用于食用油中16種抗氧化劑的檢測。

高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（HPLC-MS／MS）；抗氧化劑；食用油

食品抗氧化劑是一類食品添加劑，為防止食用油脂酸敗而產(chǎn)生對人體有害的物質(zhì)，往往需要在其中添加抗氧化劑用于預(yù)防脂質(zhì)氧化。一些合成抗氧化劑不是食品的成分之一，相當多的動物實驗證明，抗氧化劑具有一定的毒性和致癌作用，會影響人體的健康［1］，而在食品工業(yè)領(lǐng)域存在著不少違規(guī)添加、過量添加的現(xiàn)象。隨著食品中化學(xué)品殘留問題的日趨嚴重和食品安全問題的國際化，許多國家對抗氧化劑的添加量進行嚴格的限制或明確規(guī)定其添加量，美國、日本、歐盟等國家和地區(qū)已禁止使用一些合成抗氧化劑［2］。針對目前這種狀況，有必要建立一種能同時測定多種抗氧化劑的分析方法，以適應(yīng)食用油檢驗的需要。

不少廠家常常在食品生產(chǎn)過程中同時添加幾種抗氧化劑以實現(xiàn)更好的抗氧化效果［3］。目前，抗氧化劑的檢測方法主要有比色法［4］、氣相色譜法［5］、高效液相色譜法［6］等。國家標準和行業(yè)標準［7-11］也有利用氣相色譜法和高效液相色譜法測定食用油中的抗氧化劑的方法。近年來一些文獻報道了液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS／MS）法［12-15］在測定調(diào)味料和飼料中多種抗氧化劑方面的應(yīng)用。上述測定方法或抗氧化劑種類涉及較少，不能滿足日益增多的抗氧化劑品種測定的需要；或是方法復(fù)雜耗時，不適用于大批量樣品的處理。食用油中16種抗氧化劑［丁基羥基茴香醚（BHA）、二丁基羥基甲苯（BHT）、特丁基對苯二酚（TBHQ）、沒食子酸丙酯（PG）、沒食子酸辛酯（OG）、沒食子酸十二酯（DG）、4-己基間苯二酚（HR）、乙氧基喹啉（EQ）、正二氫愈創(chuàng)酸（NDGA）、槲皮素（QR）、2，4，5-三羥基苯丁酮（THBP）、2，6-二叔丁基-4-羥甲基苯酚（HMBP）、蘆?。≧utin）、2，6-二叔丁基-4 -甲氧基苯酚（Ionox-100）、沒食子酸異戊酯（IAG）、2，5-二特丁基對苯二酚（BHQ）］的同時分離測定尚未見報道。

筆者在前人工作基礎(chǔ)上利用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（HPLC-MS／MS）技術(shù)對食用油中16種抗氧化劑同時測定進行研究，優(yōu)化了樣品前處理方法，建立了簡單、快速、準確測定食用油中16種抗氧化劑的方法。該方法靈敏度高，檢測效率高，檢測限低，線性范圍寬，為食用油中抗氧化劑的檢測提供了實用的技術(shù)手段，對監(jiān)測食用油中添加劑的使用情況具有重要意義。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與試劑

高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀：三重四級桿質(zhì)譜聯(lián)用儀，TSQ Quantum Ultra EMR型，配有電噴霧離子源（ESI），美國Thermof i sher公司；

電子天平：PB-203E型，瑞士梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；

恒 溫 氮 吹 裝 置：N-EVAP14165型，美 國Organomation聯(lián)合公司；

數(shù)控超聲清洗器：KH-800KDB型，昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司；

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：Buchi Rotavapor R-215型，瑞士Buchi公司；

正己烷、甲醇、乙腈、甲酸：色譜純，德國Merck公司；

BHA標準品：純度為100%，美國AccuStandard公司；

BHT，EQ，PG，Rutin，TBHQ標準品：純度分別為99.5%，96.5%，99.0%，96.6%，99.8%，德國Dr. Ehrenstorfer GmbH公司；

BHQ，DG，IAG，HMBP，HR標準品：純度分別為99.4%，99.5%，99.9%，＞97.0%，＞98.0%，日本TCI公司；

THBP標準品：美國APOLLO公司；

NDGA，Ionox-100，OG標準品：純度分別為97%，99.9%，99.6%，英國Alfa Aesar公司；

QR標準品：純度為93.4%，美國ChromDex公司；

L-抗壞血酸棕櫚酸鹽（AP）：純度為99.0%，美國Sigma公司；

1.2 儀器工作條件

1.2.1 色譜條件

色譜柱：Theomo Hypersil GOLD柱（100 mm× 2.1 mm，5 μm）；流動相：乙腈-0.1%甲酸溶液；梯度洗脫程序：流量為0.25 mL／min，乙腈體積分數(shù)30%保持2 min，以1.5%／s增加到90%，保持3.7 min，再以-2%／s降至30%，保持3 min；柱溫：30℃；進樣體積：25μL。

1.2.2 質(zhì)譜條件

離子化模式：電噴霧電離正離子模式（ESI+）和電噴霧電離負離子模式（ESI-）；質(zhì)譜掃描方式：多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）；各氧化劑對應(yīng)的監(jiān)測離子及其碰撞能量見表1。

表1 多反應(yīng)監(jiān)測方法測定的質(zhì)譜條件參數(shù)

1.3 樣品預(yù)處理

含AP的正己烷飽和的乙腈溶液配制：將正己烷和乙腈混合，在分液漏斗中充分振搖，使其相互飽和。靜置分層，收集下層溶液，并于每升溶液中溶解0.1 g AP。

1.3.1 提取

準確稱取混合均勻的樣品2.00 g（精確到0.01 g）于250 mL磨口錐形瓶中，加入10 mL乙腈飽和的正己烷稀釋樣品，再加入10 mL飽和氯化鈉溶液，在旋渦混合器上渦旋振蕩2 min以充分溶解。用30mL含AP的正己烷飽和的乙腈溶液（每次10 mL，分3次）提取，每次振蕩并超聲各10 min，合并乙腈提取液于250 mL分液漏斗中。

1.3.2 凈化定容

用10 mL飽和氯化鈉溶液洗滌乙腈提取液一次，棄去下層。乙腈層用無水硫酸鈉脫水后，在低溫旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中濃縮至近干，殘液用氮氣吹干并用1 mL乙腈-水溶液（體積比為1∶1）充分溶解后過0.22 μm濾膜，用高效液相色譜-質(zhì)譜／質(zhì)譜儀測定。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜流動相的選擇

根據(jù)固定相的適用范圍和擬分析抗氧化劑的結(jié)構(gòu)特性，采用Thermo Hypersil GOLD反相C18柱（100 mm×2.1 mm，5μm）進行樣品分析，柱效高，分離效果好。由于采用電噴霧（ESI）模式，首先比較甲醇、乙腈作流動相時各目標物的響應(yīng)值和峰形，選擇乙腈作為有機流動相；其次，由于目標分析物大多數(shù)是極性比較強的酚類化合物，易分解，因而常出現(xiàn)色譜峰拖尾、變寬和不對稱等現(xiàn)象，在流動相中加入適量的酸性抑制劑（如甲酸）改善峰形。實驗比較了水相中甲酸體積分數(shù)（0.05%，0.1%，0.2%）對目標物離子化效率的影響，最終確定0.1%甲酸水溶液-乙腈作為流動相。

2.2 梯度洗脫程序

試驗表明，采用等度洗脫不能將多種抗氧化劑完全分離，為了保證這些物質(zhì)在較短的時間內(nèi)獲得較好的分離和較高的靈敏度，需采用梯度洗脫程序。由于測定的目標分析物種類較多，部分在譜圖上的保留時間接近，因此流動相梯度的選擇對分離很重要。在優(yōu)化的流動相條件下，反復(fù)試驗并確定了梯度洗脫程序。

2.3 提取過程

研究的抗氧化劑大多為極性物質(zhì)，易溶于極性較強的油脂及有機溶劑，如乙醇、甲醇、乙腈等。實驗選擇不同的溶劑來提取，由添加回收試驗比較發(fā)現(xiàn)，乙腈的提取回收率較高，且測定干擾較少，因此選擇乙腈為提取液。提取前用正己烷溶解油脂以降低溶液黏度，可進一步提高提取效果；然后加入飽和氯化鈉溶液將不溶于正己烷的樣品在水相中充分分散，使目標分析物不被樣品顆粒包裹，進一步提高了乙腈的提取效果。提取時在乙腈中加入保護劑AP，AP對金屬離子有螯合作用，能促進氧化的微量金屬離子鈍化，降低目標分析物在提取和濃縮過程中被氧化的程度，提高方法的回收率與靈敏度。由于正己烷和乙腈之間有一定的互溶性，所以實驗采用的正己烷和乙腈分別為經(jīng)乙腈飽和的正己烷和經(jīng)正己烷飽和的乙腈。

2.4 樣品色譜圖

在1.2儀器工作條件下，以食用油樣品為基質(zhì)，添加各測定低限濃度水平的抗氧化劑混合標準溶液，添加樣品的監(jiān)測離子色譜圖如圖1所示。由圖1可知，16種抗氧化劑與食用油基質(zhì)成分分離良好。

圖1 16種抗氧化劑測定低限添加水平的樣品監(jiān)測離子色譜圖

2.5 線性范圍與測定低限

在確定的實驗條件下，以信噪比（S／N）=10時的檢測濃度作為測定低限，用乙腈-水溶液（體積比為1∶1）將配制的混合標準溶液稀釋成1，2，5，10，20，50倍測定低限濃度的系列標準溶液，然后進行測定。以峰面積Y對相應(yīng)抗氧化劑的質(zhì)量濃度X（mg／L）進行線性回歸，結(jié)果表明待測化合物的質(zhì)量濃度與對應(yīng)的峰面積呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系（見表2），測定低限均不大于0.5 mg／kg。

表2 抗氧化劑測定低限和線性范圍

2.6 方法精密度與回收率

以盡量不含或含少量以上各抗氧化劑的食用油為空白樣品基質(zhì)，進行1倍測定低限濃度水平的添加回收試驗，平行測定10次，測定結(jié)果見表3。

表3 樣品中添加抗氧化劑的回收率及變異系數(shù)（n=10）

由表3可知，以高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定16種抗氧化劑的平均回收率在78.6%～101.2%之間，測定結(jié)果的相對標準偏差為3.50%～13.19%。測量精密度與回收率符合國家關(guān)于殘留分析對準確度與精密度的要求［16］。

3 結(jié)語

以高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時檢測食用油中的BHA，BHT，TBHQ，PG，OG，DG，HR，EQ，NDGA，QR，THBP，HMBP，Rutin，Ionox-100，IAG，BHQ等16種抗氧化劑，方法靈敏、準確，測定低限值低于國內(nèi)、國際對上述抗氧化劑的最大允許水平，能夠滿足實際應(yīng)用的需要。

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Simultaneous Determination of 16 Antioxidants in Edible Oil Using High Performance Liquid Chromatography-Electrospray Ionization Tandem Mass Spectrometry

Zhu Zhenyi, Wei Yunji, Feng Min, Wang Xiaojin, Xiong Huaxuan, He Jian
（Huaian Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Huaian 223001, China）

A method was developed for the simultaneous determination of 16 antioxidants in edible oil using high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry. The antioxidants in the sample were dissolved with hexane, extracted with acetonitrile containing ascorbyl palpitate, separated on a reversed-phase C18column with a mobile phase of acetonitrile-water containing 0.1% formic acid by gradient elution. The detection was performed by MS／MS under multiple reaction monitoring （MRM）mode, and the quantitation was carried out by the external standard method. The calibration curves showed good linearities for 16 antioxidants with correlation coeff i cients of 0.991 2-0.998 8. The determination limits of 16 antioxidants were between 0.1 mg／kg and 0.5 mg／kg. Sample were fortif i d at the level of the limit of determination with the antioxidants mixed standard solution. The recoveries were between 78.6% and 101.2%, and the relative standard deviations of repeatability were between 3.50% and 13.19%（n=10）. The method is reliable, sensitive and reproducible, and can be applied in the determination of 16 antioxidants in edible oil.

high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry; antioxidants; edible oil

O657.6

A

1008-6145（2014）02-0023-04

10.3969／j.issn.1008-6145.2014.02.007

*江蘇出入境檢驗檢疫局科技項目（2012KJ30）

聯(lián)系人：朱臻怡；E-mail: zhuzhenyi1976@sina.com

2014-01-06