60Co-γ輻照對(duì)廣寧紅花油茶種子發(fā)芽及幼苗生長(zhǎng)的影響

易立颯，李文鋒，崔之益，奚如春

(華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 林學(xué)院/廣東省森林植物種質(zhì)創(chuàng)新與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州510642)

廣寧紅花油茶Camellia semiserrata．又名紅花油茶、南山茶，是山茶科Theaceae 山茶屬Camellia 常綠喬木，因其模式標(biāo)本采自廣東省廣寧縣，故名廣寧紅花油茶．該樹(shù)種樹(shù)形、花、果優(yōu)美，是優(yōu)良木本油料和觀賞景觀樹(shù)種，其經(jīng)濟(jì)、社會(huì)和生態(tài)效益較好，綜合開(kāi)發(fā)利用價(jià)值較高［1］．

輻射誘變育種技術(shù)對(duì)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)發(fā)展和現(xiàn)代化建設(shè)起到了重要推動(dòng)作用［2］，它可提高基因突變率、打破性狀連鎖和促進(jìn)基因重組，創(chuàng)造出自然界沒(méi)有或少有的類型或性狀，具有育種時(shí)間短并能在保持某個(gè)品種多數(shù)優(yōu)良性狀的基礎(chǔ)上改善一兩個(gè)不良性狀的特點(diǎn)［3-4］，輻射誘變育種技術(shù)在生產(chǎn)應(yīng)用中取得了可喜成就［5］．然而油茶輻射育種技術(shù)的應(yīng)用報(bào)道甚少，文獻(xiàn)多為油茶種子、插條以及花粉的60Co-γ 輻射育種試驗(yàn)［4-6］，以及以油茶干種子為輻照材料，探究了輻射對(duì)幼苗同工酶活性的影響［7］．而廣寧紅花油茶種質(zhì)創(chuàng)制技術(shù)研究鮮見(jiàn)報(bào)道．

廣寧紅花油茶自20 世紀(jì)80年代開(kāi)始得到了一定程度的應(yīng)用推廣．目前南方各省區(qū)營(yíng)建了近萬(wàn)畝推廣示范林．特別是近幾年來(lái)，該樹(shù)種的發(fā)展已引起華南區(qū)域內(nèi)的高度重視，已成為各地營(yíng)造經(jīng)濟(jì)林、風(fēng)景林和防護(hù)林的主要樹(shù)種之一．然而，由于廣寧紅花油茶幼齡期長(zhǎng)，樹(shù)體高大采果困難，果皮過(guò)厚，鮮果出籽率太低，主要經(jīng)濟(jì)性狀差異明顯，致使目前廣寧紅花油茶的經(jīng)營(yíng)保存面積驟減．本文采用60Co-γ 輻照技術(shù)，以其干種子為材料，測(cè)定分析經(jīng)輻照后其種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)等性狀指標(biāo)的變化，以期探索獲得最佳育種輻射劑量，并選擇輻射誘變的特異目標(biāo)個(gè)體，為廣寧紅花油茶更深入的種質(zhì)創(chuàng)制提供理論和技術(shù)指導(dǎo)．

1 材料與方法

1．1 鈷源

廣州華大生物科技有限公司的60Co-γ 射線源，輻照劑量率0.7 Gy/min．

1．2 預(yù)備試驗(yàn)

于2011年10月下旬采集廣東省廣寧縣的廣寧紅花油茶球果，在室內(nèi)經(jīng)自然風(fēng)干脫粒得其干種子．選用網(wǎng)袋分別盛裝標(biāo)記，0～5 ℃冰箱冷藏備用．2012年1月進(jìn)行預(yù)備輻照試驗(yàn)，設(shè)置0(空白對(duì)照)、10、20、30、40、50、60、70、80、90 Gy 等10 個(gè)輻照劑量，每個(gè)劑量設(shè)3 個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)輻照100 粒種子．輻射后種子按不同處理分別播于培養(yǎng)皿內(nèi)，底部加3 層濾紙，定時(shí)噴水保持濕潤(rùn)，置于恒溫培養(yǎng)箱中催芽，培養(yǎng)溫度設(shè)為(26 ±1)℃．種子開(kāi)始萌發(fā)時(shí)，每3 d記錄1 次萌發(fā)種子數(shù)，并將萌發(fā)種子種植入育苗容器袋(8 cm×12 cm)，置于溫室大棚培養(yǎng)，常規(guī)管理．2012年5月統(tǒng)計(jì)幼苗成活率．

1．3 輻照試驗(yàn)

于2012年10月下旬按照預(yù)備試驗(yàn)的方法進(jìn)行種子采集與處理，并根據(jù)2011年預(yù)備輻照的試驗(yàn)結(jié)果，設(shè)置0(對(duì)照)、10、20、30、40、50 Gy 6 個(gè)輻照劑量，每個(gè)劑量設(shè)3 個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)輻照100 粒種子．輻照后種子采用溫水浸種4 h，然后按不同輻照劑量分別播于沙床中催芽(沙床上加蓋拱膜保持水分和溫度)，經(jīng)常檢查水分及種子情況．種子經(jīng)1 個(gè)月的沙床催芽，具有活力的種子種胚基本破殼，觀察記載種子胚根和胚芽特征后，將萌發(fā)種子植入容器袋(8 cm×12 cm)，置于溫室大棚培養(yǎng)，常規(guī)管理．每5 d 統(tǒng)計(jì)1 次萌發(fā)種子數(shù)直至齊苗．

1．4 幼苗生長(zhǎng)指標(biāo)及測(cè)定方法

每月按時(shí)觀察記錄各處理所有幼苗的分枝數(shù)等形態(tài)指標(biāo)，并從每個(gè)輻照劑量處理中隨機(jī)選取15 株幼苗，測(cè)定苗高、地徑．3月末，幼苗第1、2 片真葉完全展開(kāi)時(shí)，從每個(gè)輻照劑量處理中隨機(jī)選取30 片葉測(cè)定葉長(zhǎng)、葉寬．

1．5 數(shù)據(jù)分析與處理

采用Microsoft Excel 2003 整理數(shù)據(jù)和制圖;以SPSS 17.0 軟件進(jìn)行方差分析，多重比較采用Duncan’s 檢驗(yàn)法．

2 結(jié)果與分析

2．1 輻照對(duì)種胚形態(tài)的影響

圖1 不同輻照劑量下的種胚形態(tài)Fig．1 Effects of irradiation doses on the shape of seed embryo

輻照后萌發(fā)種子的種胚形態(tài)見(jiàn)圖1．由圖1 可看到，在經(jīng)10～90 Gy 輻照劑量處理后，種胚形態(tài)特征表現(xiàn)出差異性，30 Gy 以下低劑量輻照后的幼胚形態(tài)與對(duì)照基本相似，其胚根長(zhǎng)出后，根毛區(qū)較長(zhǎng)，幼胚表面有絨毛，種胚活性良好;經(jīng)40 Gy 劑量輻照后，種子部分幼胚已變粗變短;到50 Gy 輻照劑量時(shí)，種胚出現(xiàn)鈍化，胚根伸長(zhǎng)量總體變小，根毛區(qū)變短，幼胚明顯變得肥大且表面絨毛減少，種子萌發(fā)數(shù)量顯著減少，種胚死亡數(shù)量增多．在60 Gy 以上劑量后，只有少量種子露出胚點(diǎn)，但基本沒(méi)有生活力．說(shuō)明廣寧紅花油茶種子在經(jīng)40 Gy 以上的劑量輻照后，其種胚已受損并可能導(dǎo)致胚根畸形．

2．2 半致死輻照劑量確定

本文采用的半致死輻照劑量(LD50)為輻射后種子成苗率為50%時(shí)的輻照劑量．以對(duì)照組的苗木死亡率標(biāo)定為0，其他處理的苗木死亡率折合為相對(duì)死亡率進(jìn)行比較，相對(duì)死亡率=(對(duì)照處理成苗數(shù)－各處理劑量的成苗數(shù))/對(duì)照處理成苗數(shù)，分析結(jié)果見(jiàn)表1，輻射劑量與致死率的擬合結(jié)果見(jiàn)圖2．由圖2 可看出，其死亡率和輻照劑量間表現(xiàn)極顯著的正相關(guān)性，擬合方程為Y=0.000 3 X3－0.044 7 X2+2.35 X+3.825 7(Y 為輻射劑量，X 為相對(duì)死亡率;R2=0.983 2)．從擬合方程中可求得，當(dāng)X=50(即幼苗相對(duì)死亡率為50%)時(shí)，Y=47.07，即LD50約為47 Gy．

表1 幼苗死亡率統(tǒng)計(jì)Tab．1 Seedling mortality statistics

圖2 輻照劑量與幼苗死亡率的相關(guān)性Fig．2 The correlation between irradiation dose and seedling mortality

2．3 輻照對(duì)種子發(fā)芽率的影響

不同劑量輻照后種子發(fā)芽進(jìn)程分析結(jié)果見(jiàn)圖3．在0～50 Gy 劑量間，經(jīng)不同劑量輻射后，種胚萌發(fā)的開(kāi)始時(shí)間和發(fā)芽進(jìn)程基本一致，供試種子于2013年1月開(kāi)始萌發(fā)，4月上旬種子萌發(fā)趨于穩(wěn)定或停止．但輻照組種子發(fā)芽時(shí)間不如對(duì)照組集中，部分種子在隨后30～60 d 內(nèi)還有萌發(fā)出土．

4月份種子萌發(fā)趨于穩(wěn)定或停止時(shí)，統(tǒng)計(jì)得到0、10、20、30、40 和50 Gy 處理的種子發(fā)芽率分別為24.00%、22.33%、21.33%、22.33%、22.00% 和10.67%，可見(jiàn)，隨輻照劑量增加，發(fā)芽率出現(xiàn)下降趨勢(shì)，說(shuō)明輻照會(huì)影響種胚活力和發(fā)芽率．但在40 Gy以下的各輻照劑量?jī)?nèi)，種子發(fā)芽率雖比對(duì)照組低，但變化不大，說(shuō)明在40 Gy 以下的輻照劑量還未影響到種子胚性的改變．然而當(dāng)輻照劑量增大到50 Gy 時(shí)，輻照種子的發(fā)芽率急劇下降，其下降幅度已達(dá)50%以上，說(shuō)明50 Gy 以上的輻照劑量已導(dǎo)致其胚性的改變，從而降低了種子的發(fā)芽率．如果按種子發(fā)芽率的50%來(lái)確定其半致死劑量，與“2.2”中根據(jù)種子成苗率確定的半致死劑量相吻合，因此廣寧紅花油茶的輻射半致死劑量可確定為47 Gy．

圖3 不同輻照處理的種子發(fā)芽進(jìn)程Fig．3 Seed germination with different irradiation doses

2．4 輻照對(duì)幼苗成活率的影響

圖4 為經(jīng)不同輻照劑量處理后的幼苗成活率．由圖4 可看到，0、10、20、30、40 和50 Gy 輻照劑量的幼苗成活率分別為18.33%、16.00%、17.33%、18.00%、17.00%和7.00%．由此可見(jiàn)，0、10、20、30和40 Gy 輻照劑量處理的種子，其幼苗成活率差別不大;但50 Gy 輻照劑量處理的種子，其幼苗成活率急劇下降，不及其他處理劑量的50%．

幼苗成活率與種子發(fā)芽率在不同輻照劑量下的變化趨勢(shì)基本一致，在0、10、20、30、40、50 Gy 輻照劑量下，兩者之比分別為76.39%、71.64%、81.25%、80.60%、77.27%和65.63%．說(shuō)明幼苗成活率與種子發(fā)芽率之比受輻照處理的影響不大，20、30 和40 Gy 3 個(gè)處理甚至稍大于對(duì)照，表明廣寧紅花油茶種子自然成苗率較低，輻照對(duì)發(fā)芽種子胚芽的繼續(xù)發(fā)育沒(méi)有明顯的抑制作用．但觀察發(fā)現(xiàn)輻照后有個(gè)別弱小幼苗會(huì)自然枯死，枯死主要發(fā)生在兩片真葉伸展后不久，幼苗弱小且生長(zhǎng)緩慢，然后枯萎死亡．

圖4 輻照對(duì)幼苗成活率的影響Fig．4 Effects of irradiation doses on the seedling survival rate

2．5 輻照對(duì)幼苗生長(zhǎng)性狀指標(biāo)的影響

2．5．1 對(duì)苗高的影響 圖5 為2013年3—5月平均苗高的變化特征．由圖5 可看出，3月份0、10、20、30、40 和50 Gy 輻照劑量下的平均苗高分別為6.42、7.21、6.97、7.05、8.15 和7.74 cm，輻照組苗高較對(duì)照組均有增加，且40 和50 Gy 處理組的苗高最大;4月份0、10、20、30、40 和50 Gy 處理組的平均苗高分別為8.05、8.27、8.20、7.69、9.32 和8.32 cm，其中30 Gy 處理組比對(duì)照小，其他處理組的苗高仍大于對(duì)照，40 Gy 處理組的苗高仍最大;5月份0、10、20、30、40 和50 Gy 處理組的平均苗高分別為9.25、9.39、9.32、9.19、10.82 和9.13 cm，其中10、20 和40 Gy處理組的苗高比對(duì)照增加了1.5%、0.7%和17.0%，30 和50 Gy 處理組的苗高比對(duì)照減少了0.6% 和1.3%，40 Gy 處理組苗高仍最大．說(shuō)明輻照可一定程度上促進(jìn)苗木的高生長(zhǎng)．

圖5 輻照對(duì)苗高的影響Fig．5 Effects of irradiation doses on the seedling height

方差分析表明:3月份不同劑量處理的苗高差異不顯著(F=1.33，P＞0.05)，4月份40 Gy 劑量處理組的苗高與其他處理組差異顯著(F=4.21，P＜0.05)，5月份40 Gy 劑量處理組的苗高也與其他處理組差異顯著(F=4.62，P＜0.05)．

2．5．2 對(duì)幼苗地徑的影響 圖6 為2013年3—5月幼苗平均地徑的變化特征．由圖6 可看出，3月份0、10、20、30、40 和50 Gy 輻照劑量下的平均地徑分別為2.23、2.26、2.20、2.10、2.24 和2.03 mm，10 和40 Gy 處理組的地徑比對(duì)照大，20、30 和50 Gy 處理組比對(duì)照小，且地徑隨輻照劑量的增加而減小(40 Gy除外);4月份0、10、20、30、40 和50 Gy 處理組的平均地徑分別為2.27、2.29、2.21、2.14、2.35 和2.18 mm，同樣是10 和40 Gy 處理組的地徑比對(duì)照大，20、30 和50 Gy 處理組比對(duì)照小，不同劑量之間地徑的差異變小，40 Gy 處理組的地徑最大;5月份0、10、20、30、40 和50 Gy 處理組的平均地徑分別為2.55、2.55、2.54、2.44、2.70 和2.55 mm，不同劑量之間地徑的差異進(jìn)一步變小，但10～30 Gy 處理組的地徑仍隨劑量的增加而減小，40 Gy 處理組的地徑仍然最大，50 Gy 處理組的地徑生長(zhǎng)變快．

方差分析表明，每個(gè)處理劑量之間每月地徑生長(zhǎng)差異均不顯著．

圖6 輻照對(duì)幼苗地徑的影響Fig．6 Effects of irradiation doses on the seedling ground diameter

2．5．3 對(duì)幼苗形態(tài)特征的影響 表2 為幼苗完全展開(kāi)的成熟真葉的平均葉長(zhǎng)、葉寬及長(zhǎng)寬比例．由表2 可看出，隨著輻照劑量的增加，葉片長(zhǎng)、寬及葉片長(zhǎng)寬比例均有變大的趨勢(shì)，說(shuō)明輻照組幼苗葉片變大，形狀變狹長(zhǎng)，但變幅不大，葉片外部形態(tài)觀察不到顯著的變化．葉片形狀、葉色、葉緣鋸齒形狀、葉脈形態(tài)等沒(méi)有明顯的變化，也沒(méi)有出現(xiàn)葉片畸形等常見(jiàn)的輻照反應(yīng)，說(shuō)明本試驗(yàn)的輻照劑量對(duì)葉片沒(méi)有致畸作用．

調(diào)查發(fā)現(xiàn)，輻照處理的幼苗在根頸部位會(huì)萌生分枝，通常1～3 根不等，試驗(yàn)中經(jīng)輻射處理的少量幼苗植株基部有1～4 枝萌條，但由于幼苗生長(zhǎng)時(shí)間短，輻照對(duì)幼苗萌條的影響還有待觀察．另外，輻照組幼苗與對(duì)照相比，幼苗分枝形態(tài)、芽形態(tài)、莖顏色等外部形態(tài)，均未觀察到顯著的變化．

表2 輻照對(duì)葉長(zhǎng)、葉寬和長(zhǎng)寬比的影響1)Tab．2 Effects of irradiation doses on the leaf shape

3 討論與結(jié)論

輻照能改變種胚形態(tài)，過(guò)高的輻照劑量(40 Gy以上)會(huì)損傷種胚導(dǎo)致種胚畸形，表現(xiàn)為胚根變粗變短，種胚表面變光滑，根毛分布區(qū)變短．浙江省林業(yè)科學(xué)研究所營(yíng)林室油茶組［6］以及黃永芳等［7］研究發(fā)現(xiàn)，較高劑量的輻照會(huì)導(dǎo)致胚根肥大無(wú)毛，失去發(fā)芽能力，稱為“肥根”現(xiàn)象．這是由于過(guò)高劑量的輻照抑制了種胚分生細(xì)胞的有絲分裂，細(xì)胞分裂受阻僅發(fā)生分生細(xì)胞液泡化和伸長(zhǎng)，胚突破種皮造成假萌發(fā)現(xiàn)象［6-7］．

不同劑量輻射后，種子萌發(fā)的開(kāi)始時(shí)間和發(fā)芽進(jìn)程基本一致．但輻照降低了種子發(fā)芽率，10～40 Gy 處理的種子發(fā)芽率降幅不大，50 Gy 處理的發(fā)芽率則不及其他處理的50%．另外，輻照可推延種子的發(fā)芽時(shí)間，受輻照的部分種子在正常發(fā)芽高峰期過(guò)后還陸續(xù)發(fā)芽，但個(gè)別弱小的幼苗隨后會(huì)自然枯死．這與曹達(dá)人［8］、周巨根［9］的研究結(jié)論一致，在10～40 Gy 劑量范圍內(nèi)，其成苗率并沒(méi)有隨輻照劑量的增大而減?。?/p>

小于40 Gy 的輻照劑量能促進(jìn)幼苗生長(zhǎng)，但50 Gy 的劑量則起抑制作用．張悅等［10］研究指出，輻射對(duì)五味子幼苗生長(zhǎng)初期的抑制作用并不明顯，但二三個(gè)月后的幼苗生長(zhǎng)受阻現(xiàn)象才突現(xiàn)，而李志軍［11］認(rèn)為，輻照對(duì)紫薇幼苗初期生長(zhǎng)表現(xiàn)出明顯的抑制作用．一般認(rèn)為輻照對(duì)植物生長(zhǎng)普遍有抑制作用，但抑制效應(yīng)會(huì)因植物種類的不同而異，抑制作用的表現(xiàn)時(shí)間或影響部位也不同．本研究表明，輻照處理對(duì)幼苗初期生長(zhǎng)的抑制作用也并不明顯，輻照常見(jiàn)的致畸作用在廣寧紅花油茶幼苗形態(tài)上沒(méi)有明顯出現(xiàn)．這可能因?yàn)橛酌缟L(zhǎng)期較短，輻照效應(yīng)未能表達(dá)．相關(guān)研究也有指出，某一高劑量可輕微促進(jìn)幼苗初期生長(zhǎng)，并認(rèn)為這是因?yàn)檩椪帐辜?xì)胞分裂受到抑制，但細(xì)胞死亡率反而較低劑量為少［12］．至于40 Gy的輻照劑量對(duì)廣寧紅花油茶幼苗初期生長(zhǎng)始終表現(xiàn)出較強(qiáng)的促進(jìn)作用，還有待進(jìn)一步研究．

有研究認(rèn)為輻射劑量和生長(zhǎng)量成負(fù)相關(guān)，一般可采用生長(zhǎng)量為對(duì)照的70 %，或采用植株成活率50%的劑量來(lái)確定其半致死劑量［12］．本文依據(jù)植株成活率的50%來(lái)判斷，得出廣寧紅花油茶種子的60Co-γ射線輻照半致死劑量為47 Gy．但實(shí)際操作中種子含水量、輻射材料生理狀態(tài)、輻照條件、劑量率、輻照前后處理、種植條件等都會(huì)影響誘變效果．鄒德炎［13］提出，茶樹(shù)種子的適宜輻射劑量，應(yīng)當(dāng)依據(jù)其萌動(dòng)狀態(tài)、照射后第1年的茶苗突變頻率和二三年內(nèi)茶樹(shù)生長(zhǎng)表現(xiàn)來(lái)確定，且茶樹(shù)是多年生植物，照射的作用不會(huì)在1年內(nèi)充分表現(xiàn)出來(lái)，而是在二三年內(nèi)才能看出輻照效果．因此，廣寧紅花油茶的輻射育種技術(shù)有待進(jìn)一步研究．

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