烏頭提取物對心衰大鼠抗氧化能力的研究

劉 穎，譚波宇

(湖南省人民醫(yī)院藥學(xué)部，湖南長沙 410005)

心力衰竭(HF)是一種由于心肌受損、心臟的持久過負(fù)壓引發(fā)的疾病，嚴(yán)重時導(dǎo)致心臟失代償，血液不能運(yùn)達(dá)供給全身，以心功能不全為主要表現(xiàn)。本病歸屬于中醫(yī)學(xué)“心悸”、“喘證”、“水腫”、“痰飲”等范疇［1］。超氧化物歧化酶(SOD)是人體內(nèi)的一種抗氧化酶，它的主要作用在于其特異性能夠清除超氧陰離子，同時催化超氧化自由基(ROS)分解，并在過氧化酶的作用下發(fā)生氧化反應(yīng)［2］。丙二醛(MDA)是過氧化脂質(zhì)的分解產(chǎn)物，它可引起蛋白質(zhì)變性，酶及激素失活等。研究發(fā)現(xiàn)心衰時，機(jī)體內(nèi)氧化能力降低，SOD、MDA與還原型谷胱甘肽(GSH)的水平則呈現(xiàn)一個較低的狀態(tài)，進(jìn)行抗心衰治療后，機(jī)體抗氧化能力有所恢復(fù)，SOD、MDA 與 GSH 的水平也有所上升［3-5］。烏頭作為祖國醫(yī)學(xué)中的溫補(bǔ)藥物，在記載中對于心衰的治療往往具有較好的療效，筆者通過觀察在烏頭提取物作用下Wistar大鼠體內(nèi)SOD、MDA、GSH指標(biāo)，來探究烏頭提取物對心力衰竭的治療效果，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 動物實(shí)驗(yàn) 選取心衰Wistar大鼠90只，由中山醫(yī)科大學(xué)動物中心提供(動物合格證號SCXK 2004-0011)，采用隨機(jī)數(shù)字表分為實(shí)驗(yàn)組、對照組及空白組，每組30只，依據(jù)遵循中國科學(xué)技術(shù)委員會制定的《實(shí)驗(yàn)動物管理?xiàng)l例》進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作。各組實(shí)驗(yàn)動物的體重、飼養(yǎng)方式差異無顯著性。

1.2 主要試劑及儀器 烏頭(湖南省人民醫(yī)院藥劑科);SOD分析試劑盒(南京建成生物工程研究所);MDA分析試劑盒(南京建成生物工程研究所);GSH試劑盒(南京建成生物工程研究所);立式壓力蒸汽滅菌器(西安中諾爾儀器有限公司)、電子天平(賽多利斯分析天平)、低溫高速離心機(jī)(湖南湘儀離心機(jī)有限公司)、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器)、旋渦混勻器(合肥艾本森科學(xué)儀器有限公司)、流式細(xì)胞分析儀、分光光度計(jì)(上海圣科儀器設(shè)備有限公司)以及共聚焦顯微鏡(奧林巴斯中國有限公司)等。

1.3 制備烏頭提取物 取干燥的烏頭根300 g粉碎，過30目篩。以乙醇為溶劑，索氏提取器回流提取，過濾并用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀回收溶劑得乙醇提取物浸膏。加入少量水使混懸，而后依次用石油醚、乙酸乙酯、氯仿、正丁醇依次萃取，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀回收溶劑，最終制取3 g·mL-1藥物濃度的烏頭提取物。

1.4 制備模型 實(shí)驗(yàn)組與對照組采用腹主動脈縮窄法制作慢性心衰大鼠模型［6］。大鼠用1%戊巴比妥鈉溶液0.35 mL/100 g腹腔注射麻醉后，綁于鼠臺上，用碘酒擦拭待剪開的皮膚，在劍突下腹正中開2～3 cm口，分層打開腹腔，將臟器擠壓在大鼠的右側(cè)以便找尋腹主動脈，在腎動脈分支以上鈍性游離腹主動脈，穿過4號手術(shù)線并系一活扣，將7號注射器針頭平行置于腹主動脈上，用4號手術(shù)絲線將腹主動脈和注射器一同結(jié)扎，松緊適中，然后緩慢將注射器撤出，給青霉素1支(8萬單位)，關(guān)腹，分層縫合。

1.5 治療方法 造模成功后，實(shí)驗(yàn)組與對照組以地高辛20 mg·kg-1尾靜脈注射，每日一次，連續(xù)干預(yù)28 d，空白組以等體積生理鹽水尾靜脈注射0.04 g·kg-1，共28 d。實(shí)驗(yàn)組給予上述烏頭提取物溶液灌胃0.04 mg·kg-1，共28 d。成功建模后選取第0天，第7天和第28天，每組分別選取10只動物，采取腹腔注射麻醉后，腹主動脈并取血，檢測SOD、MDA與GSH水平。

1.6 觀察指標(biāo)及檢測方法

1.6.1 觀察檢測SOD、GSH活性 應(yīng)用黃嘌呤氧化酶法:血液離心(3 500 r·min-1)處理10 min，留取上清液檢測SOD、GSH活性。測定管及對照管分別加入試劑或樣品，充分混勻后放置在37℃水浴箱中作用40 min，加入顯色劑后混勻，靜置10 min倒入光徑比色杯中，在波長550 nm處用蒸餾水調(diào)零，比色測定各樣本A值，依據(jù)按公式計(jì)算SOD活性。

1.6.2 檢測MDA含量 檢測MDA含量應(yīng)用TBA比色法:離心(3 500 r·min-1)處理心肌組織10 min，取上清液待測。標(biāo)準(zhǔn)管、標(biāo)準(zhǔn)空白管以及測定管中分別加入烏頭提取物，旋渦混勻器混勻后，用保鮮膜扎緊試管口，刺一小孔，放置在水浴箱中(95℃)作用40 min后取出，流水冷卻，離心(3 500 r·min-1)處理10 min，取上清液置入光徑比色杯，在波長532 nm處采取蒸餾水調(diào)零處理，比色測定A值，按公式計(jì)算MDA含量。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS19.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，三組計(jì)量資料采用單因素方差分析的方法，三組之間兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有顯著性。

2 結(jié)果

2.1 各組SOD活性比較 對照組與實(shí)驗(yàn)組的心衰大鼠體內(nèi)SOD值明顯低于空白組，實(shí)驗(yàn)組的變化小于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見表1。

表1 治療前后心衰大鼠體內(nèi)SOD活性比較情況(±s)

表1 治療前后心衰大鼠體內(nèi)SOD活性比較情況(±s)

注:與空白組比較，#P ＜0.05，與實(shí)驗(yàn)組相比，*P ＜0.05。

組別氧化物歧化酶SOD/U·mL-1 0 d 7 d 28 d實(shí)驗(yàn)組 126.9 ±26.3# 168.4 ±16.5# 193.5 ±12.5#對照組 131.4 ±18.5# 864.3 ±25.4#* 839.1 ±28.6#*空白組215.2 ±13.3 213.8 ±11.6 202.7 ±10.4

2.2 各組MDA含量比較 對照組與實(shí)驗(yàn)組的心衰大鼠體內(nèi)MDA值明顯高于空白組，實(shí)驗(yàn)組的變化小于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見表2。

表2 治療前后心衰大鼠體內(nèi)MDA含量比較情況(±s)

表2 治療前后心衰大鼠體內(nèi)MDA含量比較情況(±s)

注:治療后，與空白組比較，#P＜0.05，與實(shí)驗(yàn)組相比，*P＜0.05。

組別丙二醛MDA/mmol·L-1 0 d 7 d 28 d實(shí)驗(yàn)組 3.69 ±0.75 14.43 ±8.32# 26.48 ±4.64#對照組 4.01 ±1.35 10.25 ±5.62#* 17.67 ±4.36#*空白組6.69 ±0.75 6.78 ±0.65 6.85 ±0.38

2.3 各組GSH含量比較 對照組與實(shí)驗(yàn)組的心衰大鼠體內(nèi)MDA值明顯高于空白組，實(shí)驗(yàn)組的變化小于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見表3。

表3 治療前后心衰大鼠體內(nèi)GSH含量比較情況(±s)

表3 治療前后心衰大鼠體內(nèi)GSH含量比較情況(±s)

注:治療后，與空白組比較，#P＜0.05，與實(shí)驗(yàn)組相比，*P＜0.05。

組別還原性谷胱甘肽GSH/μmol·L-1 0 d 7 d 28 d實(shí)驗(yàn)組 16.43 ±6.54 26.23 ±5.64# 40.24 ±7.26#對照組 15.25 ±1.35 22.87 ±7.28#* 28.46 ±5.46#*空白組41.12 ±5.78 42.10 ±6.25 44.86 ±7.81

3 討論

心力衰竭是世界范圍內(nèi)引發(fā)嚴(yán)重病癥甚至死亡的疾病之一，各種心臟病發(fā)展到嚴(yán)重階段都會引發(fā)心衰，心臟失代償導(dǎo)致供血不足，是一種高發(fā)病率的臨床病癥狀群。是指在致病性因素的作用下，心收縮功能與舒張功能所發(fā)生的障礙，心泵血功能發(fā)生降低，使得心輸出量出現(xiàn)下降，以至于無法滿足機(jī)體正常的代謝需要進(jìn)而出現(xiàn)的一種病理過程。在疾病發(fā)生發(fā)展的早期，交感神經(jīng)系統(tǒng)和腎素—血管緊張素—酸固酮系統(tǒng)被激活，心肌出現(xiàn)增生和肥厚，這在一定程度上是發(fā)揮了代償性作用，但是這一類的代償性機(jī)制卻會導(dǎo)致心功能的進(jìn)一步損傷，其最終結(jié)果是加速了疾病的發(fā)生發(fā)展。當(dāng)心衰發(fā)生時，可以通過監(jiān)測SOD、MDA與GSH這些指標(biāo)來觀察心肌抗氧化能力并由此來監(jiān)測疾病發(fā)展［7-10］。SOD是細(xì)胞內(nèi)所含有的一種抗氧化酶，它通過清除超氧陰離子，減弱氧自由基對細(xì)胞的損傷，從而起到保護(hù)機(jī)體的作用，SOD含量的多少能夠間接的反映機(jī)體對氧自由基的清除能力。本實(shí)驗(yàn)通過測定SOD來觀察烏頭提取物是否能對抗自由基的損傷［11-13］。MDA是指在氧自由基的攻擊下，生物膜中的不飽和脂肪酸發(fā)生了脂質(zhì)過氧化性反應(yīng)，其最終產(chǎn)物即為MDA，因?yàn)槠漭^強(qiáng)的細(xì)胞毒作用可造成細(xì)胞的損傷和組織功能的損傷，又因其能夠促進(jìn)氧自由基的產(chǎn)生，細(xì)胞毒作用會得到進(jìn)一步的擴(kuò)大。含量的多少亦可間接反映體內(nèi)細(xì)胞所承受的自由基損傷強(qiáng)度。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示烏頭提取物可能通過調(diào)節(jié)MDA含量來發(fā)揮心血管保護(hù)及抗心衰作用［14-16］。GSH則是一類通過催化過氧化物反應(yīng)，減少氧自由基的生成，從而能夠保持細(xì)胞完整的結(jié)構(gòu)及功能。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果亦可提示，烏頭提取物組GSH水平升高，其可能的途徑是通過抑制氧自由基途徑從而來發(fā)揮對心肌的保護(hù)作用［17-18］。GSH是細(xì)胞內(nèi)重要的抗氧化物質(zhì)，因此若抗氧化能力增強(qiáng)，則由心衰引起的心功能不全等一系列病癥將減輕。在以往的心衰治療中主要以利尿劑，血管擴(kuò)張劑等以軟血管為主的藥劑進(jìn)行治療，雖效果明顯但副作用大，預(yù)后不好易復(fù)發(fā)。根據(jù)文獻(xiàn)記載烏頭堿是川烏、草烏等中藥的主要有毒成分，可以刺激迷走神經(jīng)，使心率失常，當(dāng)心衰發(fā)生時，在烏頭堿的毒性刺激下可以加強(qiáng)脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，MDA含量增加，SOD活力降低，GSH升高，抗氧化能力加強(qiáng)［19］。

本次試驗(yàn)中，造模成功后大鼠血清SOD、GSH與MDA水平明顯低于空白組，提示心衰大鼠體內(nèi)抗氧化能力減低;干預(yù)28 d后，大鼠血清SOD、GSH與MDA水平上升，體內(nèi)抗氧化能力有所提高，與對照組相比，實(shí)驗(yàn)組提高明顯，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，由此可發(fā)現(xiàn)烏頭提取物能夠增強(qiáng)抗氧化能力從而使的抗心衰效果明顯高于地高辛的應(yīng)用效果。實(shí)驗(yàn)研究表明烏頭提取物通過刺激心肌活性，可增強(qiáng)心率，進(jìn)而增強(qiáng)心肌抗氧化能力。烏頭作為中草藥其藥理作用包括驅(qū)風(fēng)活血，散痙止痛、麻醉敗毒、免疫調(diào)節(jié)、心血管作用和抗腫瘤作用［20-22］。從中醫(yī)角度心衰是由于心腎陽虛，瘀血、水停等引起，古代醫(yī)家應(yīng)用烏頭等中藥進(jìn)行治療，如今隨著醫(yī)療事業(yè)的發(fā)展中西結(jié)合治療對疾病的防治更為有效，研究人員對烏頭的有效成分進(jìn)行提取，并利用烏頭提取物對心衰患者進(jìn)行更有效的治療［23-24］。在心衰疾病過程中抗氧化能力的提升能夠使心衰機(jī)體維生素E增加，血液抗氧化活性加強(qiáng)，降低脂過氧化引發(fā)速度，能有效的保護(hù)心肌細(xì)胞，從而明顯改善心功能。由于本實(shí)驗(yàn)中僅對烏頭提取物的作用做了初步研究，由于受到實(shí)驗(yàn)研究條件的限制，因此對于本次實(shí)驗(yàn)中所獲得的關(guān)于大鼠的研究結(jié)果是否具有代表性，有無種屬差異，其抗心衰效應(yīng)與臨床作用是否能得到統(tǒng)一，以使烏頭提取物更好地服務(wù)于臨床，仍有待下一步的研究。

綜合本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果，我們相信烏頭提取物能夠有效的改善心肌抗氧化能力從而達(dá)到治療心衰的目的，臨床有較好療效值得推廣。

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