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    腺病毒介導(dǎo)的SOCS3對(duì)銀屑病小鼠模型治療的實(shí)驗(yàn)研究

    2014-07-09 00:54曾凡杞廖明張志云
    中國現(xiàn)代醫(yī)生 2014年13期
    關(guān)鍵詞:腺病毒銀屑病

    曾凡杞++++++廖明++++++張志云++++++李永雙++++++胡波+++++劉夢(mèng)瓊

    [摘要] 目的 研究腺病毒介導(dǎo)的SOCS3對(duì)銀屑病小鼠模型的治療作用。方法 獲得重組腺病毒Ad-SOCS3,用Western Blot分析Ad-SOCS3在TC-1細(xì)胞中的表達(dá),用流式細(xì)胞儀檢測(cè)對(duì)TC-1的細(xì)胞凋亡。腹腔注射Ad-SOCS3小鼠銀屑病模型,觀察小鼠陰道上皮有絲分裂,用ELISA檢測(cè)血清中IL-6和TNF-α濃度。 結(jié)果 SOCS3在TC-1能有效表達(dá),與Ad-SOCS3的感染復(fù)數(shù)相關(guān)。Ad-SOCS3能顯著抑制TNF-α介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡(P<0.01)。Ad-SOCS3能抑制雌激素期小鼠陰道上皮有絲分裂(P<0.01),較Ad-EGFP,Ad-SOCS3降低血清中IL-6和TNF-α濃度(P<0.01)。結(jié)論 Ad-SOCS3能抑制炎性因子誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡和炎癥,其對(duì)銀屑病具有潛在的治療價(jià)值。

    [關(guān)鍵詞] 腺病毒;細(xì)胞信號(hào)抑制因子3;銀屑病

    [中圖分類號(hào)] R275.9 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-9701(2014)13-0004-03

    銀屑病是一個(gè)免疫介導(dǎo)的常見紅斑鱗屑性疾病,發(fā)病率近1%~3%,表皮異常增殖和慢性炎癥為其主要特征[1]。臨床和實(shí)驗(yàn)證據(jù)表明前炎癥細(xì)胞因子IFN-α(Interferon-α,干擾素-α)、IL-6(Interleukin-6,白細(xì)胞介數(shù)-6)在銀屑病的發(fā)病過程中有重要作用[2]。細(xì)胞因子信號(hào)的抑制因子3(SOCS3)是重要的細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子活化的負(fù)調(diào)控因子,其機(jī)制是SOCS 蛋白直接結(jié)合細(xì)胞因子受體或JAKs的催化結(jié)構(gòu)域,抑制STAT蛋白的招募和磷酸化或靶向受體復(fù)合物的泛素化和蛋白酶介導(dǎo)的降解[3],這與銀屑病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。 2012年1月~2013年1月,我們采用Bonder和Van Scott[4]提出的雌激素期小鼠陰道上皮模型,模擬了銀屑病的主要病理生理特點(diǎn),復(fù)制缺陷型腺病毒SOCS3,觀察其對(duì)銀屑病模型雌激素期小鼠陰道上皮有絲分裂的影響,探討SOCS3在治療銀屑病中的潛在作用和機(jī)制。

    1 材料與方法

    1.1 動(dòng)物與細(xì)胞系

    C57BL/6 雌性小鼠,6~8周齡,購自廣東省省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。TC-1細(xì)胞系購自武漢大學(xué)典藏物種保存中心。TC-1用含10% 胎牛血清,100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基(Gibco 公司)培養(yǎng),細(xì)胞培養(yǎng)按常規(guī)方法進(jìn)行。

    1.2 腺病毒載體

    重組腺病毒Ad-SOCS3、Ad-EGFP均由清華大學(xué)深圳研究生院鄭義博士惠贈(zèng)。即從C57BL/6的小鼠肝組織用Trizol RNA提取試劑盒(Introgen Company)提取RNA,RT-PCR得到SOCS3的基因,將該基因克隆到pShuttle2 載體,測(cè)序正確后,用I-CeuI/PI-SceI-消化 pshuttle2-SOCS3,然后插入復(fù)制缺陷腺病毒載體pAdeno-X vector。為了產(chǎn)生病毒,用PacI消化pAd-SOCS1,對(duì)質(zhì)粒純化后用lipofectamine 2000(Invitrogen)轉(zhuǎn)染,在293T細(xì)胞收獲病毒。Ad-EGFP的克隆方法和病毒產(chǎn)生同Ad-SOCS3類似。病毒的純化用氯化銫梯度離心,純化的病毒用含10 mM Tris-HCl (pH 7.5),1 mM MgCl2,和 10% 甘油的透析液透析,保存在-80 °C。用Adeno-X Rapid Titer kit (BD Clontech)檢測(cè)病毒滴度(操作按試劑盒說明書進(jìn)行,BD Company)。

    1.3 重組腺病毒感染TC-1

    將1×106 個(gè) TC-1細(xì)胞接種到6孔細(xì)胞培養(yǎng)板,分別用PBS、Ad-EGFP、感染復(fù)數(shù)(MOI)為25和50的重組腺病毒Ad-SOCS3感染,用Western Blot檢測(cè)SOCS3的表達(dá),細(xì)胞用細(xì)胞裂解液(0.3% NP40,1 mM EDTA,50 mM Tris-Cl(pH 7.4),2 mM EGTA,1% Triton X-100,150 mM NaCl,25 mM NaF,1 mM Na3VO3,10 μg/mL PMSF)裂解細(xì)胞,按常規(guī)的Western blot操作方法進(jìn)行,SOCS3和β-actin的一抗為鼠單抗(購自Santa Cruz公司,美國),TBS液洗滌后加入標(biāo)記辣根過氧化物酶(HRP)的二抗孵育,再用TBS洗3次,用ECL顯色液(深圳市納諾美生物科技有限公司)顯影、曝光、分析。

    1.4 細(xì)胞凋亡的檢測(cè)

    TC-1細(xì)胞以每孔2×105個(gè)細(xì)胞接種于12孔細(xì)胞培養(yǎng)板孵育過夜,然后分別以PBS、Ad-SOCS3和Ad-EGFP感染細(xì)胞,病毒的感染復(fù)數(shù)為50,24 h后,再加入TNF-α(10 ng/mL),再培養(yǎng)24 h進(jìn)行檢測(cè),采用流式細(xì)胞術(shù),應(yīng)用Annexin V-FITC/PI 凋亡檢測(cè)試劑(南京凱基生物科技發(fā)展有限公司提供)檢測(cè)細(xì)胞凋亡。

    1.5 重組腺病毒對(duì)雌激素期小鼠陰道上皮有絲分裂模型的影響

    取雌性小鼠30只,腹腔注射己烯雌酚(廣州白云山明興制藥有限公司,批號(hào)051001,規(guī)格2 mg/mL)0.2 mg/只,每日1次,連續(xù)3 d,使小鼠處于雌激素期。第4天將小鼠隨機(jī)分為Ad-SOCS3組、Ad-EGFP組和生理鹽水組,分別經(jīng)腹腔注射200 μL的病毒滴度為109 Pfu/mL的重組Ad-SCOS3、Ad- EGFP和生理鹽水注入小鼠,2 d后再腹腔注射一次,3 d后,各組小鼠腹腔注射秋水仙堿 (秋水仙堿原粉,國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司,批號(hào)WS20060329)15 mg/kg,使細(xì)胞有絲分裂周期停滯于有絲分裂中期,便于計(jì)數(shù)。5 h后取陰道標(biāo)本,應(yīng)用10%甲醛固定,石蠟包埋,HE染色,用光學(xué)顯微鏡觀察有絲分裂情況,計(jì)數(shù)300個(gè)基底細(xì)胞中的有絲分裂數(shù),計(jì)數(shù)有絲分裂指數(shù)(每100個(gè)基底細(xì)胞中的有絲分裂數(shù))。

    1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

    計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,采用SPSS17.0軟件包分析處理,計(jì)數(shù)資料采用卡方檢驗(yàn),計(jì)量資料采用t檢驗(yàn),多組間進(jìn)行方差分析,采用F檢驗(yàn), P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,P<0.01為差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 腺病毒對(duì)TC-1表達(dá)SOCS3的影響

    從圖1可以看出腺病毒Ad-SOCS3能夠在TC-1細(xì)胞中表達(dá),且與感染復(fù)數(shù)有關(guān),感染復(fù)數(shù)越大,SOCS3的表達(dá)越強(qiáng)。 另外,腺病毒Ad-EGFP也能誘導(dǎo)SOCS3的表達(dá),可能是Ad-EGFP感染細(xì)胞后反饋引起SOCS3的增加。

    圖1 Western Blot分析腺病毒感染TC-1后SOCS3的表達(dá)。Ad-S3(25)表示Ad-SOCS3,括號(hào)中的25表示MOI為25,Ad-S3(50)表示MOI為50的腺病毒Ad-SOCS3

    2.2重組腺病毒Ad-SOCS3對(duì)TNF-α誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的影響

    流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示,PBS處理組的TC-1細(xì)胞凋亡率為13.7%,Ad-EFGP組在TNF-α誘導(dǎo)下,細(xì)胞凋亡率為19.2%,而Ad-SOCS3組細(xì)胞凋亡率為6.5%。與PBS組、Ad-EFGP組比較,Ad-SOCS3組TNF-α誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡明顯降低(χ2=13.25、19.47,P<0.01),而Ad-EFGP 組和PBS組的細(xì)胞凋亡率無顯著性差異(χ2=1.24,P>0.05)(圖2),表明Ad-SOCS3可明顯抑制TNF-α誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。

    [參考文獻(xiàn)]

    [1] Boyman O,Conrad C,Tonel G,et al. The pathogenic role of tissue resident immune cells in psoriasis[J]. Trends Immunol,2007,28(2):51-57.

    [2] Ueyama A,Yamamoto M,Tsujii K,et al. Mechanism of pathogenesis of imiquimod-induced skin inflammation in the mouse:A role for interferon-alpha in dendritic cell activation by imiquimod[J]. J Dermatol, 2014,41(2):135-143.

    [3] Baker BJ,Akhtar LN,Benveniste EN. SOCS1 and SOCS3 in the control of CNS immunity[J]. Trends in Immunology,2009,30(8):392-400.

    [4] Bonder RH,Van Scott EJ. Use of mouse vaginal and rect al epithelium to screen ant imitot ic ef fect of systemically administered dreg[J]. Cancer Res,1971,31(6): 851- 853.

    [5] Stahl A,Joyal JS,Chen J,et al. SOCS3 is an endogenous inhibitor of pathologic angiogenesis[J]. Blood,2012,120(14):2925-2929.

    [6] Joao Antonio Chaves de Souza,Andressa Vilas Boas Nogueira,Pedro Paulo Chaves de Souza,et al. SOCS3 expression correlates with severity of inflammation,expression of proinflammatory cytokines,and activation of STAT3 and p38 MAPK in LPS-induced inflammation in vivo[J]. Mediators of Inlammation,2013,10:1155.

    [7] S Madonna S,Scarponi C,Pallotta s,et al. Anti-apoptotic effects of suppressor of cytokine signaling 3 and 1 in psoriasis[J]. Cell Death and Disease,2012,28(3),e334.

    [8] Karsten KW,Woetmann A,Skov L,et al. Deficient SOCS3 and SHP-1 expression in psoriatic T cells[J]. J Invest Dermatol,2010,130(6):1590-1597.

    [9] Koppikar P,Bhagwat N,Kilpivaara O,et al. Heterodimeric JAK-STAT activation as a mechanism of persistence to JAK2 inhibitor therapy[J]. Nature,2012,489(7414):155-159.

    [10] Boyle K,Zhang JG,Nicholson SE,et al. Deletion of the SOCS box of suppressor of cytokine signaling 3(SOCS3) in embryonic stem cells reveals SOCS box-dependent regulation of JAK but not STAT phosphorylation[J]. Cell Signal 2009,21(3):394-404.

    [11] Inagaki-Ohara K, Kondo T,Ito M,et al. SOCS, inflammation, and cancer[J]. JAK-STAT,2013,2(3):e24053.

    (收稿日期:2013-11-20)

    1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

    計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,采用SPSS17.0軟件包分析處理,計(jì)數(shù)資料采用卡方檢驗(yàn),計(jì)量資料采用t檢驗(yàn),多組間進(jìn)行方差分析,采用F檢驗(yàn), P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,P<0.01為差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 腺病毒對(duì)TC-1表達(dá)SOCS3的影響

    從圖1可以看出腺病毒Ad-SOCS3能夠在TC-1細(xì)胞中表達(dá),且與感染復(fù)數(shù)有關(guān),感染復(fù)數(shù)越大,SOCS3的表達(dá)越強(qiáng)。 另外,腺病毒Ad-EGFP也能誘導(dǎo)SOCS3的表達(dá),可能是Ad-EGFP感染細(xì)胞后反饋引起SOCS3的增加。

    圖1 Western Blot分析腺病毒感染TC-1后SOCS3的表達(dá)。Ad-S3(25)表示Ad-SOCS3,括號(hào)中的25表示MOI為25,Ad-S3(50)表示MOI為50的腺病毒Ad-SOCS3

    2.2重組腺病毒Ad-SOCS3對(duì)TNF-α誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的影響

    流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示,PBS處理組的TC-1細(xì)胞凋亡率為13.7%,Ad-EFGP組在TNF-α誘導(dǎo)下,細(xì)胞凋亡率為19.2%,而Ad-SOCS3組細(xì)胞凋亡率為6.5%。與PBS組、Ad-EFGP組比較,Ad-SOCS3組TNF-α誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡明顯降低(χ2=13.25、19.47,P<0.01),而Ad-EFGP 組和PBS組的細(xì)胞凋亡率無顯著性差異(χ2=1.24,P>0.05)(圖2),表明Ad-SOCS3可明顯抑制TNF-α誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。

    [參考文獻(xiàn)]

    [1] Boyman O,Conrad C,Tonel G,et al. The pathogenic role of tissue resident immune cells in psoriasis[J]. Trends Immunol,2007,28(2):51-57.

    [2] Ueyama A,Yamamoto M,Tsujii K,et al. Mechanism of pathogenesis of imiquimod-induced skin inflammation in the mouse:A role for interferon-alpha in dendritic cell activation by imiquimod[J]. J Dermatol, 2014,41(2):135-143.

    [3] Baker BJ,Akhtar LN,Benveniste EN. SOCS1 and SOCS3 in the control of CNS immunity[J]. Trends in Immunology,2009,30(8):392-400.

    [4] Bonder RH,Van Scott EJ. Use of mouse vaginal and rect al epithelium to screen ant imitot ic ef fect of systemically administered dreg[J]. Cancer Res,1971,31(6): 851- 853.

    [5] Stahl A,Joyal JS,Chen J,et al. SOCS3 is an endogenous inhibitor of pathologic angiogenesis[J]. Blood,2012,120(14):2925-2929.

    [6] Joao Antonio Chaves de Souza,Andressa Vilas Boas Nogueira,Pedro Paulo Chaves de Souza,et al. SOCS3 expression correlates with severity of inflammation,expression of proinflammatory cytokines,and activation of STAT3 and p38 MAPK in LPS-induced inflammation in vivo[J]. Mediators of Inlammation,2013,10:1155.

    [7] S Madonna S,Scarponi C,Pallotta s,et al. Anti-apoptotic effects of suppressor of cytokine signaling 3 and 1 in psoriasis[J]. Cell Death and Disease,2012,28(3),e334.

    [8] Karsten KW,Woetmann A,Skov L,et al. Deficient SOCS3 and SHP-1 expression in psoriatic T cells[J]. J Invest Dermatol,2010,130(6):1590-1597.

    [9] Koppikar P,Bhagwat N,Kilpivaara O,et al. Heterodimeric JAK-STAT activation as a mechanism of persistence to JAK2 inhibitor therapy[J]. Nature,2012,489(7414):155-159.

    [10] Boyle K,Zhang JG,Nicholson SE,et al. Deletion of the SOCS box of suppressor of cytokine signaling 3(SOCS3) in embryonic stem cells reveals SOCS box-dependent regulation of JAK but not STAT phosphorylation[J]. Cell Signal 2009,21(3):394-404.

    [11] Inagaki-Ohara K, Kondo T,Ito M,et al. SOCS, inflammation, and cancer[J]. JAK-STAT,2013,2(3):e24053.

    (收稿日期:2013-11-20)

    1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

    計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,采用SPSS17.0軟件包分析處理,計(jì)數(shù)資料采用卡方檢驗(yàn),計(jì)量資料采用t檢驗(yàn),多組間進(jìn)行方差分析,采用F檢驗(yàn), P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,P<0.01為差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 腺病毒對(duì)TC-1表達(dá)SOCS3的影響

    從圖1可以看出腺病毒Ad-SOCS3能夠在TC-1細(xì)胞中表達(dá),且與感染復(fù)數(shù)有關(guān),感染復(fù)數(shù)越大,SOCS3的表達(dá)越強(qiáng)。 另外,腺病毒Ad-EGFP也能誘導(dǎo)SOCS3的表達(dá),可能是Ad-EGFP感染細(xì)胞后反饋引起SOCS3的增加。

    圖1 Western Blot分析腺病毒感染TC-1后SOCS3的表達(dá)。Ad-S3(25)表示Ad-SOCS3,括號(hào)中的25表示MOI為25,Ad-S3(50)表示MOI為50的腺病毒Ad-SOCS3

    2.2重組腺病毒Ad-SOCS3對(duì)TNF-α誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的影響

    流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示,PBS處理組的TC-1細(xì)胞凋亡率為13.7%,Ad-EFGP組在TNF-α誘導(dǎo)下,細(xì)胞凋亡率為19.2%,而Ad-SOCS3組細(xì)胞凋亡率為6.5%。與PBS組、Ad-EFGP組比較,Ad-SOCS3組TNF-α誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡明顯降低(χ2=13.25、19.47,P<0.01),而Ad-EFGP 組和PBS組的細(xì)胞凋亡率無顯著性差異(χ2=1.24,P>0.05)(圖2),表明Ad-SOCS3可明顯抑制TNF-α誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。

    [參考文獻(xiàn)]

    [1] Boyman O,Conrad C,Tonel G,et al. The pathogenic role of tissue resident immune cells in psoriasis[J]. Trends Immunol,2007,28(2):51-57.

    [2] Ueyama A,Yamamoto M,Tsujii K,et al. Mechanism of pathogenesis of imiquimod-induced skin inflammation in the mouse:A role for interferon-alpha in dendritic cell activation by imiquimod[J]. J Dermatol, 2014,41(2):135-143.

    [3] Baker BJ,Akhtar LN,Benveniste EN. SOCS1 and SOCS3 in the control of CNS immunity[J]. Trends in Immunology,2009,30(8):392-400.

    [4] Bonder RH,Van Scott EJ. Use of mouse vaginal and rect al epithelium to screen ant imitot ic ef fect of systemically administered dreg[J]. Cancer Res,1971,31(6): 851- 853.

    [5] Stahl A,Joyal JS,Chen J,et al. SOCS3 is an endogenous inhibitor of pathologic angiogenesis[J]. Blood,2012,120(14):2925-2929.

    [6] Joao Antonio Chaves de Souza,Andressa Vilas Boas Nogueira,Pedro Paulo Chaves de Souza,et al. SOCS3 expression correlates with severity of inflammation,expression of proinflammatory cytokines,and activation of STAT3 and p38 MAPK in LPS-induced inflammation in vivo[J]. Mediators of Inlammation,2013,10:1155.

    [7] S Madonna S,Scarponi C,Pallotta s,et al. Anti-apoptotic effects of suppressor of cytokine signaling 3 and 1 in psoriasis[J]. Cell Death and Disease,2012,28(3),e334.

    [8] Karsten KW,Woetmann A,Skov L,et al. Deficient SOCS3 and SHP-1 expression in psoriatic T cells[J]. J Invest Dermatol,2010,130(6):1590-1597.

    [9] Koppikar P,Bhagwat N,Kilpivaara O,et al. Heterodimeric JAK-STAT activation as a mechanism of persistence to JAK2 inhibitor therapy[J]. Nature,2012,489(7414):155-159.

    [10] Boyle K,Zhang JG,Nicholson SE,et al. Deletion of the SOCS box of suppressor of cytokine signaling 3(SOCS3) in embryonic stem cells reveals SOCS box-dependent regulation of JAK but not STAT phosphorylation[J]. Cell Signal 2009,21(3):394-404.

    [11] Inagaki-Ohara K, Kondo T,Ito M,et al. SOCS, inflammation, and cancer[J]. JAK-STAT,2013,2(3):e24053.

    (收稿日期:2013-11-20)

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