流體剪切應力對人骨肉瘤MG-63細胞周期相關基因表達的影響

張連昌，李東韜,，趙學武,，曹新生，張 舒第四軍醫(yī)大學航空航天生物動力學教研室，航空航天醫(yī)學教育部重點實驗室，陜西西安 700；海軍總醫(yī)院心臟中心，北京 00048；975部隊醫(yī)院，吉林長春 005

流體剪切應力對人骨肉瘤MG-63細胞周期相關基因表達的影響

張連昌1，李東韜1,2，趙學武1,3，曹新生1，張 舒1
1第四軍醫(yī)大學航空航天生物動力學教研室，航空航天醫(yī)學教育部重點實驗室，陜西西安 710032；2海軍總醫(yī)院心臟中心，北京 100048；393175部隊醫(yī)院，吉林長春 130051

目的觀察人骨肉瘤MG-63細胞在流體剪切應力作用后，MG-63細胞中細胞周期相關基因表達譜的變化特點。方法MG-63細胞常規(guī)培養(yǎng)72 h，隨機分成剪切應力作用組和無剪切應力作用對照組。將剪切應力作用組的細胞載玻片置于流體剪切系統(tǒng)中進行實驗，流體剪切應力設為1.5 Pa，作用時間為60 min。無剪切應力作用組的細胞靜置相同時間。之后分別提取兩組的RNA，用Affymetrix公司的全人類基因組芯片進行雜交，并對獲得的數(shù)據(jù)進行分析。結果MG-63細胞中細胞周期相關基因表達譜發(fā)生改變，247個與細胞周期相關的基因出現(xiàn)差異表達，130個基因表達上調(Fold Change＞2，P＜0.05)，117個基因表達下調(Fold Change＜-2，P＜0.05)。差異基因主要參與細胞周期多個生物學過程的調控，包括對細胞周期進程、周期阻滯、有絲分裂調控、G1/S轉變、有絲分裂間期等生物學過程的調控。結論流體剪切應力可以通過改變成骨細胞中細胞周期相關基因的表達，進而調控成骨細胞的增殖和分化等功能。

剪切應力；基因芯片；MG-63；細胞周期

當人進行日?；顒雍腕w育鍛煉時，在體質量和肌肉收縮的作用下，骨骼會發(fā)生形變，導致骨骼細胞周圍組織液發(fā)生位移，對骨骼細胞產生流體剪切應力刺激[1-2]。已有研究表明，這種流體剪切應力刺激可對骨骼細胞的細胞周期產生重要影響[3-5]。細胞周期是生命活動的基本過程，細胞伴隨著周期的變遷進入增殖、分化、衰老和死亡等生理狀態(tài)。成骨細胞是骨組織修復過程中的主要功能細胞，是力學刺激因素的最終感受和效應細胞，其增殖活性和功能狀態(tài)直接反應了骨生長重建的狀態(tài)[6-7]。因此，細胞周期的調控在骨的形成和吸收這一動態(tài)過程中起十分重要的作用。然而，在成骨細胞的周期調控中，流體剪切應力的作用及其特點尚不明確。本實驗旨在觀察人骨肉瘤MG-63細胞在流體剪切應力作用后，MG-63細胞中細胞周期相關基因表達譜的變化特點，探索流體剪切應力對細胞周期的調控特點及其機制。

材料和方法

1 材料和儀器 人骨肉瘤MG-63細胞系購買于ATCC。DMEM/F12混合培養(yǎng)液(Hyclone，美國)，新生牛血清(四季青，中國)，胰蛋白酶(Gibco，美國)，流體剪切系統(tǒng)為本實驗室自行研制。

2 流體剪切應力刺激實驗 MG-63細胞用含10% FBS的DMEM/F12培養(yǎng)液，在37℃、5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。將MG-63細胞以1×105個/孔的密度接種于預置2.55 cm×2.15 cm載玻片的六孔板中，培養(yǎng)72 h。隨機分為剪切應力作用組和無剪切應力作用對照組。剪切應力作用組置于流體剪切系統(tǒng)中給予剪切應力刺激，流體剪切應力設為1.5 Pa，作用時間為60 min。無剪切應力作用組的細胞在六孔板中靜置相同時間以作為對照。

3 總RNA提取與檢測 用Trizol分別提取剪切應力作用組和對照組的總RNA，用分光光度計檢測RNA樣本濃度和純度，經(jīng)過檢測樣品的濃度和純度符合基因芯片的實驗要求，樣品于-80℃冰箱凍存。4 基因芯片雜交和掃描分析 基因芯片采用Affymetrix公司的Affymetrix Human U133plus 2.0芯片。實驗步驟如下：1)進行RNA抽提和純化。采用TRIZOL Reagent進行樣品的總RNA抽提，所得總RNA經(jīng)電泳質檢合格后使用RNeasy micro kit和RNase-Free DNase Set純化。2)進行樣品RNA的放大和標記。樣品RNA采用Affymetrix表達譜芯片配套試劑盒對樣品總RNA中的mRNA進行放大、標記和純化，獲得帶有生物素標記的cRNA。3)進行芯片雜交。在滾動雜交爐中45℃，16 h滾動雜交，雜交完成后在洗滌工作站進行芯片洗滌。4)進行芯片掃描。芯片結果采用GeneChip?Scanner 3000 (Cat#00-00212，Affymetrix，Santa Clara，CA，US)進行掃描，Command Console Software 3.1 (Affymetrix，Santa Clara，CA，US)讀取原始數(shù)據(jù)，質控合格的數(shù)據(jù)采用Gene Spring Software 11.0 (Agilent technologies，Santa Clara，CA，US)進行歸一化處理，所用的算法為MAS5。

5 數(shù)據(jù)分析 用One-Step Tukey's Biweight Algorithm對獲得的獲得的數(shù)據(jù)進行分析，F(xiàn)old Change (linear)＜-2或者Fold Change(linear)＞2，P＜0.05的基因認為其表達差異是有統(tǒng)計學意義的。通過美國國家生物技術信息中心(NCBI)公共數(shù)據(jù)庫查詢基因功能，用Gene Ontology功能分類標注對差異基因進行功能分類和生物信息學分析。

結 果

流體剪切應力作用后，MG-63細胞中有247個與細胞周期相關基因的表達發(fā)生改變，其中130個基因表達上調，117個基因表達下調(圖1)。12個表達顯著下調的基因(Fold Change＜-4)(表1)。13個表達顯著上調的基因(Fold Change＞5)(表2)。通過GO分析，差異基因主要參與細胞周期多個生物學過程的調控，包括對細胞周期進程、周期阻滯、有絲分裂調控、G1/S轉變、有絲分裂間期等生物學過程的調控(表3)。

圖 1 剪切應力作用組與對照組的細胞周期相關基因差異表達散點圖Fig. 1 Scatter plots of differentially expressed genes related to cell cycle in FSS group and control group

討 論

流體剪切應力在骨的生長和維持骨正常功能狀態(tài)中起著重要作用[8-10]。骨骼細胞特別是成骨細胞可感受流體剪切應力，并通過多種信號通路對流體剪切應力發(fā)生響應，表現(xiàn)為細胞的增殖、分化和凋亡等改變[11-12]。適當增加力學刺激可引起骨形成增多、重吸收減少和骨量增加[13]。

細胞周期蛋白和細胞周期蛋白依賴性激酶在細胞的周期調控中發(fā)揮著重要的作用[14]。本研究中發(fā)現(xiàn)，流體剪切應力作用之后，MG-63細胞中的細胞周期蛋白和細胞周期蛋白依賴性激酶的表達也發(fā)生了顯著性變化，細胞周期蛋白(Cyclin D1，Cyclin E1，Cyclin E2，Cyclin T2)、細胞周期蛋白依賴性激酶CDK6、細胞轉錄激活因子E2F2和E2F3的基因表達均顯著下降，細胞周期蛋白(Cyclin B1，Cyclin G1，Cyclin G2)和細胞周期蛋白依賴性激酶(CDK2，CDK3，CDK4，CDK10)的基因表達均顯著上升。以往研究已證明Cyclin D1主要在G1早期表達，并與CDK2/CDK4結合成為始動細胞周期的

啟動子。Cyclin E主要在G1晚期和S早期表達增加，細胞進入S期后Cyclin D1和Cyclin E將會被降解，S期晚期和G2早期Cyclin A和Cyclin B表達，促進細胞進入M期。細胞增殖能力增加一個重要的表現(xiàn)即為S期細胞比例增加，本實驗中Cyclin D1、Cyclin E表達下降，Cyclin B1表達上升，與此符合。由此證明，流體剪切應力可以通過這些基因調控成骨細胞周期，對成骨細胞的增殖產生影響。

表1 與細胞周期相關的表達下調部分基因Tab. 1 Down-regulated genes related to cell cycle

表2 與細胞周期相關的表達上調部分基因Tab. 2 Up-regulated genes related to cell cycle

表3 差異表達基因的GO分析部分結果Tab. 3 GO analysis results of differentially expressed genes

除了傳統(tǒng)與細胞周期調控有關的基因表達會發(fā)生變化之外，我們還發(fā)現(xiàn)了其他一些與細胞周期相關基因的表達也出現(xiàn)顯著性變化，這些基因包括核自身抗原精子蛋白(nuclear autoantigenic sperm protein，NASP)、MDM2結合蛋白(MDM2 binding protein，MTBP)和S激酶相關蛋白2(S-phase kinaseassociated protein 2，SKP2)等，這些基因主要參與了對細胞周期的精細調控。Richardson等[15]研究表明，在體外培養(yǎng)的細胞中，NASP的蛋白表達水平在S期顯著增加，但是在G2期卻又下降，其變化的同時還伴隨mRNA表達的變化。NASP是組蛋白連接蛋白，在細胞分裂周期中具有重要的作用，參與組蛋白的核膜轉運功能，將組蛋白快速有效地運至細胞核內，加快細胞有絲分裂進程。本研究發(fā)現(xiàn)，剪切應力作用60 min后，MG-63細胞內NASP的基因表達水平下調，這種變化的生物學意義值得我們在下一步的實驗中進行深入研究。

Agarwal等[16]的研究表明，MTBP在細胞有絲分裂和染色體分離過程中有著十分重要的作用，其過表達可延緩細胞有絲分裂過程，明顯延長細胞核膜分解的過程，滯留在有絲分裂前中期和中期相的細胞增多。他們還發(fā)現(xiàn)在有絲分裂后期MTBP表達增多還可能導致染色體分離異常，如形成染色體橋、多極染色體等。我們的研究證實，流體剪切應力作用后MTBP的表達顯著降低，這有助于細胞的增殖。Hu等[17]在膽囊癌細胞上的研究表明，沉默了SKP2的表達之后，細胞增殖受到了明顯的抑制，被阻滯在S期的細胞增多，G2期和M期細胞減少。由此可見SKP2在細胞有絲分裂過程中起著重要作用。本研究發(fā)現(xiàn)，流體剪切應力作用后SKP2表達顯著增加，其表達增強是否可以促進S期細胞進入G2期還有待進一步的研究。

綜上，細胞周期蛋白和細胞周期蛋白依賴性激酶在細胞周期中的作用已有較多的研究，本次實驗發(fā)現(xiàn)的細胞調控相關基因如NASP、MTBP、SKP2等在力學刺激導致的細胞周期改變中所起作用還有待進一步研究。適當?shù)牧黧w剪切應力可以促進成骨細胞的增殖、分化和礦化[18]。航天飛行所導致的失重性骨質丟失和臨床上常見的廢用性骨質丟失，其發(fā)生發(fā)展都與骨骼的力學刺激減弱和力學信號調控機制的變化相關。通過本研究，我們觀察到流體剪切應力作用后，與細胞周期相關的基因表達譜發(fā)生了改變，這為我們開展成骨細胞力學信號的調控機制研究提供了參考靶點，進一步的研究將為開發(fā)適當?shù)牧W相關骨質丟失防護措施提供參考依據(jù)。

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Effect of flow shear stress on the expression of genes related to cell cycle in human osteosarcoma MG-63 cells

ZHANG Lian-chang1, LI Dong-tao1,2, ZHAO Xue-wu1,3, CAO Xin-sheng1, ZHANG Shu1
1Department of Aerospace Biodynamics, The Key Laboratory of Aerospace Medicine, Chinese Ministry of Education, Xi'an 710032, Shaanxi Province, China;2Center of Cardiology, Navy General Hospital, Beijing 100048, China;3Chinese PLA 93175 Hospital, Changchun 130051, Jilin Province, China

ZHANG Shu. Email: shuzhang@fmmu.edu.cn

ObjectiveTo observe the expression changes of genes related to cell cycle after exposing to fluid shear stress (FSS) in human osteosarcoma MG-63 cells.MethodsMG-63 cells were cultured for 72 h, and then they were randomly divided into the fluid shear stress group and the control group. The fluid shear stress group was exposed to 1.5 Pa FSS for 60 min, while the control group was treated with no FSS. Then RNA was extracted from the two groups, and the chip was scanned with Affymetrix gene chip and analyzed for differentially expressed genes.ResultsThe expression of genes related to cell cycle in MG-63 cells was changed. Compared with the control group, 247 genes related to cell cycle showed different expression in the FSS group. Of the 247 genes, 130 genes showed up-regulated (Fold Change＞2, P＜0.05), while the rest of them showed down-regulated (Fold Change＜-2, P＜0.05). These differential genes participated in many cell biological progresses, such as cell cycle process, cell cycle arrest, negative regulation of mitotic cell cycle, G1/S transition of mitotic cell cycle, interphase of mitotic cell cycle.ConclusionFSS can stimulate the proliferation and differentiation of MG-63 cells via regulating the expression of genes related to cell cycle.

shear stress; gene chip; MG-63; cell cycle

R 852.22

A

2095-5227(2014)11-1137-04

10.3969/j.issn.2095-5227.2014.11.016

時間：2014-08-08 09:32 網(wǎng)絡出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/11.3275.R.20140808.0932.002.html

2014-05-08

國家自然科學基金項目(31170889；30870595)；教育部留學回國啟動基金(HG4406)

Supported by the National Natural Science Foundation of China(31170889; 30870595); The Project-sponsored by SRF for ROCS, SEM(HG4406)

張連昌，男，在讀碩士。研究方向：航空航天醫(yī)學。Email: zhanglian_chang@163.com

張舒，男，博士，教授，博士生導師。Email: shuzhang @fmmu.edu.cn