甲狀旁腺素對(duì)人甲狀腺髓樣癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響

馬世紅+劉勤江+田尤新+陳瑞慧

[摘要] 目的 探討甲狀旁腺素對(duì)人甲狀腺髓樣癌細(xì)胞體外增殖抑制及凋亡作用。 方法 體外培養(yǎng)甲狀腺髓樣癌細(xì)胞株，經(jīng)甲狀旁腺素和甲狀旁腺素受體單抗干預(yù)處理后，倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞生長狀況，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡。結(jié)果 倒置相差顯微鏡下細(xì)胞變化明顯，各濃度的甲狀旁腺素和甲狀旁腺素受體單抗均分別能有效地抑制甲狀腺髓樣癌細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，凋亡作用呈時(shí)間和濃度依賴。當(dāng)甲狀旁腺素濃度為2.0μmol/L、甲狀旁腺素受體單抗?jié)舛葹?.0μmol/L時(shí)，對(duì)細(xì)胞凋亡作用顯著（P<0.05），凋亡率分別為13.24%及20.78%。 結(jié)論 甲狀旁腺素對(duì)人甲狀腺髓樣癌細(xì)胞增殖有抑制作用并能誘導(dǎo)其凋亡。

[關(guān)鍵詞] 甲狀旁腺素；甲狀腺髓樣癌；凋亡

[中圖分類號(hào)] R736.1 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 2095-0616（2014）05-29-04

甲狀旁腺素（parathyroid hormone，PTH）由甲狀旁腺分泌，它與降鈣素（calcitonin，CT）共同調(diào)節(jié)人體鈣磷代謝[1]。有報(bào)道甲狀旁腺素相關(guān)肽對(duì)腫瘤細(xì)胞有增殖作用[2-4]。本研究用人甲狀腺髓樣癌細(xì)胞株（TT細(xì)胞株）作為研究對(duì)象，分別給于PTH和甲狀旁腺素受體單抗（anti-parathyroid hormone receptor1 antibody，anti-PTHR1）干預(yù)處理，觀察TT細(xì)胞生長狀況，檢測(cè)細(xì)胞凋亡，研究PTH和anti-PTHR1對(duì)甲狀腺髓樣癌（medullary thyroid carcinoma ，MTC）細(xì)胞凋亡的影響作用，可望為MTC的治療提供新的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及設(shè)備

人甲狀腺髓樣癌TT細(xì)胞株（購于中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫），胎牛血清（購自美國Sigma公司），F(xiàn)12k培養(yǎng)基（購自美國Gibco公司）。胰蛋白酶、乙二胺四乙酸（EDTA）、四甲基耦氮唑鹽（MTT）、甲基亞砜（DMSO）及PTH均購自美國Sigma公司。anti-PTHR1（購自美國abcanm公司），流式細(xì)胞儀檢測(cè)盒（購自美國BD公司）。倒置相差顯微鏡（日本Olympas產(chǎn)品），流式細(xì)胞儀（美國BD公司產(chǎn)品）。其他常規(guī)設(shè)備由國內(nèi)生產(chǎn)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)和處理 人甲狀腺髓樣癌TT細(xì)胞株培養(yǎng)于37℃的F12K培養(yǎng)基中（含15%胎牛血清和500U/mL青霉素、100μg/mL鏈霉素），常規(guī)消化傳代。對(duì)數(shù)生長期的TT細(xì)胞，以1×106/mL細(xì)胞濃度接種于一批25mL培養(yǎng)瓶中（2mL/瓶），24h后分組加入PTH及anti-PTHR1。PTH濃度分別為0、0.5、1.0、1.5、2.0μmol/L；anti-PTHR1濃度分別為0、0.25、0.5、0.75、1.0μmol/L，24h后觀察細(xì)胞變化結(jié)果。

1.2.2 流式細(xì)胞儀檢測(cè)TT細(xì)胞凋亡 對(duì)數(shù)生長期的TT細(xì)胞消化傳代后設(shè)：（1）對(duì)照組（不加PTH及anti-PTHR1）；（2）PTH干預(yù)組；（3）anti-PTHR1干預(yù)組。PTH濃度分別為0、0.5、1.0、1.5、2.0μmol/L；anti-PTHR1濃度分別為0、0.25、0.5、0.75、1.0μmol/L。48h后用PBS離心洗滌，棄去上清液。由專人按照說明書操作，最后將樣品置于冰上輕輕混勻，流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較用單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1 PTH及anti-PTHR1對(duì)TT細(xì)胞生長影響

光學(xué)顯微鏡下見對(duì)照組細(xì)胞呈單層，生長狀態(tài)良好，細(xì)胞透明且界限清楚。用PTH和anti-PTHR1處理24h后，隨著濃度增加、作用時(shí)間延長，細(xì)胞數(shù)量減少，細(xì)胞形態(tài)逐漸皺縮變圓與周圍的細(xì)胞分離，細(xì)胞體積縮小，培養(yǎng)液中見到許多碎片及顆粒。部分細(xì)胞核開始濃縮，核膜逐漸崩解，染色質(zhì)分割成塊狀等呈現(xiàn)出細(xì)胞凋亡的變化。

2.2 PTH及anti-PTHR1對(duì)TT細(xì)胞的凋亡作用

流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示，照組細(xì)胞無明顯變化（圖1）。經(jīng)PTH及anti-PTHR1處理TT細(xì)胞后，各濃度的PTH和anti-PTHR1均可引起TT細(xì)胞的凋亡。凋亡作用隨藥物濃度增加而加強(qiáng)、在相同濃度下凋亡作用隨時(shí)間延長而上升，呈時(shí)間和濃度依賴。凋亡率與濃度和時(shí)間均呈正相關(guān)（P<0.05）。當(dāng)PTH濃度為2.0μmol/L時(shí)，對(duì)TT細(xì)胞的凋亡作用顯著，凋亡率13.24%（P<0.05）。見圖2；anti-PTHR1濃度為1.0μmol/L時(shí)，對(duì)TT細(xì)胞的凋亡作用顯著，凋亡率20.78%（P<0.05）。見圖3。

3 討論

甲狀腺癌目前的治療方法主要是外科手術(shù)、甲狀腺素內(nèi)分泌治療及131碘核素內(nèi)照射治療。甲狀腺髓樣癌（MTC）起源于濾泡旁細(xì)胞（C細(xì)胞），具有神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)惡性腫瘤的特性，降鈣素是其特殊的標(biāo)志物[5-6]，手術(shù)切除仍是其首選的根治方式。

MTC與分化型甲狀腺癌不同，因起源于C細(xì)胞，不受促甲狀腺激素（thyroid stimulating hormone，TSH）的影響，不表達(dá)鈉/碘轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（sodium/iodide symporter，NIS）、也不攝碘，TSH抑制治療和I131核素內(nèi)照射治療無效[7]。MTC具有早期轉(zhuǎn)移的特性，約10%～15%的患者在初診時(shí)已有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，很難通過手術(shù)而達(dá)到根治，手術(shù)治療后10年生存率遠(yuǎn)低于分化型甲狀腺癌[8]。有關(guān)人甲狀腺髓樣癌細(xì)胞體外生長增值的研究報(bào)道較多[9-11]。各種生物免疫治療、分子靶向藥物、腫瘤疫苗、單克隆抗體、免疫基因等已經(jīng)在臨床前試驗(yàn)中取得了一定的療效，部分藥物已經(jīng)開始臨床使用，但療效不理想[12-15]。因此，研究MTC的發(fā)生發(fā)展機(jī)制，闡明其發(fā)病機(jī)理并探索MTC新的治療途徑，尋找新的有效分子治療靶點(diǎn)，針對(duì)腫瘤細(xì)胞生長的某些主要環(huán)節(jié)，開發(fā)新的治療藥物，是目前甲狀腺癌研究領(lǐng)域的難點(diǎn)和熱點(diǎn)問題之一。endprint

甲狀旁腺素作為一種調(diào)節(jié)人體鈣磷代謝的內(nèi)分泌激素，是否參與MTC的發(fā)生發(fā)展及對(duì)MTC細(xì)胞生長和增殖存在影響，目前國內(nèi)外尚未見報(bào)道。有研究表明地塞米松能抑制甲狀腺髓樣癌TT細(xì)胞的增值，主要通過抑制細(xì)胞G1期而誘導(dǎo)凋亡[16]，另有報(bào)道蛋白激酶C在體外通過增加細(xì)胞凋亡而抑制甲狀腺髓樣癌細(xì)胞的擴(kuò)散[17]。本研究對(duì)甲狀腺髓樣癌TT細(xì)胞給予PTH和anti-PTHR1兩種藥物干預(yù)，光鏡觀察結(jié)果顯示對(duì)照組TT細(xì)胞呈單層，梭形或多邊形貼壁生長，從細(xì)胞形態(tài)觀察，其生長狀態(tài)良好。TT細(xì)胞經(jīng)PTH和anti-PTHR1干預(yù)后，細(xì)胞變圓且比較凌亂，細(xì)胞質(zhì)固縮，細(xì)胞核質(zhì)比減小，顯示TT細(xì)胞生長及增殖活性均受到顯著抑制作用，部分細(xì)胞核開始濃縮、邊緣化，核膜逐漸崩解，染色質(zhì)分割成塊狀等變化，該變化反映了細(xì)胞的凋亡。其作用強(qiáng)度隨藥物濃度增加和作用時(shí)間延長而增加。流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示，不同濃度的PTH和anti-PTHR1均可引起TT細(xì)胞凋亡，差異有顯著性（P<0.05），凋亡率與濃度和時(shí)間均呈正相關(guān)（P<0.05）。當(dāng)PTH濃度為2.0μmol/L、anti-PTHR1濃度為1.0μmol/L時(shí)，對(duì)TT細(xì)胞的凋亡作用最為顯著（P<0.05）。提示PTH和anti-PTHR1不但具有抑制TT細(xì)胞增值的作用，同時(shí)還可誘導(dǎo)其凋亡?？梢?，PTH對(duì)人甲狀腺髓樣癌TT細(xì)胞形態(tài)和結(jié)構(gòu)的作用與對(duì)細(xì)胞誘導(dǎo)凋亡作用是一致的，說明PTH和anti-PTHR1具有抑制人甲狀腺髓樣癌TT細(xì)胞生長和誘導(dǎo)TT細(xì)胞凋亡雙重的生物學(xué)效應(yīng)。這將為今后進(jìn)一步研究PTH對(duì)MTC的作用機(jī)制提供了理論依據(jù)和重要的參考。

綜上所述，本研究初步證實(shí)了PTH和anti-PTHR1對(duì)人甲狀腺髓樣癌細(xì)胞的抑制作用，能有效誘導(dǎo)人甲狀腺髓樣癌TT細(xì)胞的凋亡。深入探索其誘導(dǎo)凋亡機(jī)制，對(duì)于進(jìn)一步研究PTH對(duì)人甲狀腺髓樣癌TT細(xì)胞的作用機(jī)制，具有非常重要的指導(dǎo)意義和實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。隨著對(duì)PTH研究及認(rèn)識(shí)的不斷深入，PTH和anti-PTHR1可能成為一種新的抗腫瘤治療靶點(diǎn)，為甲狀腺髓樣癌早期診斷及治療提供新的途徑。

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（收稿日期：2013-12-14）endprint

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