黃 蕊,吳光斌,陳發(fā)河
(集美大學(xué)生物工程學(xué)院,福建 廈門 361021)
果實(shí)內(nèi)可溶性糖的種類與含量是影響果實(shí)品質(zhì)的重要因素.這些可溶性糖不僅是影響果實(shí)甜度的物質(zhì),同時(shí)也是酸、類胡蘿卜素、維生素C等營(yíng)養(yǎng)成分及芳香物質(zhì)等合成的基礎(chǔ)原料[1].果實(shí)中的常見的可溶性糖主要包括蔗糖、果糖、葡萄糖和山梨醇等[2-4],其中山梨醇屬于糖醇類,是山梨糖的還原產(chǎn)物.它本身是一種小分子滲透物質(zhì),在改變細(xì)胞滲透壓[5]、提高植物抗寒力[6]、清除活性氧[7]等方面起著重要的作用.因此,準(zhǔn)確測(cè)定山梨醇含量對(duì)于農(nóng)產(chǎn)品采后貯藏保鮮機(jī)理的研究十分重要.
通常糖的測(cè)定方法有比色法 蒽酮-硫酸法 硫酸-咔唑法 氣相色譜法 等.一般的化學(xué)方法只能測(cè)定總糖的含量,不能測(cè)定糖的組成.氣相色譜法雖然可以測(cè)定糖的組成,但必須對(duì)糖進(jìn)行衍生化才可以檢測(cè),檢測(cè)步驟繁瑣,且不可避免地會(huì)產(chǎn)生誤差[11].而高效液相色譜法卻可以彌補(bǔ)這一缺點(diǎn),從而在糖類化合物的測(cè)定中得到了廣泛的應(yīng)用[2-3].然而目前,關(guān)于果品中蔗糖、果糖、葡萄糖和山梨醇這4種糖的分離及含量的測(cè)定方法鮮有報(bào)道,而實(shí)際中將這4種糖和糖醇完全分離并實(shí)現(xiàn)同時(shí)一次檢測(cè)也較為困難.本文建立了利用高效液相色譜法分離并同時(shí)測(cè)定水果中葡萄糖、果糖、蔗糖及山梨醇含量的技術(shù)方法.
蓮霧 (黑珍珠),購(gòu)自廈門臺(tái)灣水果集散中心;枇杷 (早鐘6號(hào)),福建省莆田縣;柚子 (琯溪蜜柚),福建省平和縣.
果糖、葡萄糖、山梨醇和蔗糖標(biāo)準(zhǔn)品,美國(guó)Sigma公司;乙腈,色譜純,美國(guó)天地公司;無(wú)水乙醇,分析純,中國(guó)國(guó)藥集團(tuán);實(shí)驗(yàn)用水 (18.2 MΩ·cm)由本實(shí)驗(yàn)室用Millipore Milli Q RG超純水系統(tǒng)制備.
1525型高效液相色譜儀,美國(guó)Waters公司.
1.2.1 樣品處理
稱取一定量的果肉,置于研缽中,向其中加入20 mL體積分?jǐn)?shù)為50%乙腈水溶液,研磨勻漿,定容至25 mL,常溫離心 (4000 r/min,30 min),取上清液,進(jìn)樣前通過(guò)0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾.
1.2.2 HPLC測(cè)定條件
XBridge Amide Column(3.5 μm,4.6 mm ×250 mm,Waters);流動(dòng)相為 V(乙腈)∶V(水)=85∶15,并含體積分?jǐn)?shù)0.1%氨水;流速1.5 mL/min;柱溫45℃;進(jìn)樣量20 μL;Waters 1525泵;Waters 2414折光指數(shù)檢測(cè)器.以保留時(shí)間定性,峰面積定量.
1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備
準(zhǔn)確稱取0.5 g(精確至0.0001 g)經(jīng)干燥恒重的果糖、山梨醇、葡萄糖和蔗糖,轉(zhuǎn)移至25 mL容量瓶中,用超純水定容至刻度,得質(zhì)量濃度為20 mg/mL的混標(biāo)母液,逐級(jí)稀釋至0.2、0.4、1、5、10、20 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液.進(jìn)樣前通過(guò)0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾.
2.1.1 流動(dòng)相的選擇
首先采用Waters XBridge Amide Column以不同體積比的流動(dòng)相 (V(乙腈)∶V(水)=75∶25、80∶20、85∶15、90∶10)來(lái)測(cè)定混標(biāo)液和樣品提取液中果糖、山梨醇、葡萄糖和蔗糖的分離情況.結(jié)果表明,增加水相比例可以縮短分析時(shí)間,但會(huì)降低分離度,造成果糖、山梨醇和葡萄糖色譜峰的重疊;隨著乙腈比例的增加,4種糖的分離度提高,但相應(yīng)的分析時(shí)間會(huì)延長(zhǎng).當(dāng)流動(dòng)相中V(乙腈)∶V(水)=85∶15時(shí),4種糖的分離效果較好.但是,流動(dòng)相僅為乙腈水溶液時(shí),果糖峰形不佳,葡萄糖存在旋光異構(gòu)體,因此,分別嘗試在流動(dòng)相中添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.2%乙酸銨和體積分?jǐn)?shù)0.1%氨水以改善峰形.結(jié)果表明,在流動(dòng)相添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.2%乙酸銨時(shí),測(cè)定結(jié)果會(huì)在果糖色譜峰附近出現(xiàn)溶劑倒峰,無(wú)法準(zhǔn)確定量;而添加體積分?jǐn)?shù)0.1%氨水時(shí),4種糖的色譜峰峰形得到改善,分離度均大于1.5.因此,在兼顧分離度、峰形及分析時(shí)間的基礎(chǔ)上,本試驗(yàn)采用的流動(dòng)相為V(乙腈)∶V(水)=85∶15,并含有體積分?jǐn)?shù)0.1%氨水.
2.1.2 流速的選擇
比較流速在1.0、1.2、1.3、1.4、1.5 mL/min條件下4種糖的分離情況,發(fā)現(xiàn)在流速為1.5 mL/min時(shí),4種糖的出峰時(shí)間較快,分離度均達(dá)1.5以上,峰形較好.
2.1.3 色譜柱溫度的選擇
在30、35、40、45、50℃條件下進(jìn)行混標(biāo)液和樣品提取液中可溶性糖的分析,發(fā)現(xiàn)隨著溫度的升高,4種糖的保留時(shí)間有所縮短,但分離度降低.兼顧分離度和保留時(shí)間,本實(shí)驗(yàn)采用色譜柱柱溫為45℃.
按1.2.2中的分析條件進(jìn)行測(cè)定,以不同糖濃度混標(biāo)峰面積y為縱坐標(biāo),標(biāo)樣質(zhì)量濃度x為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,以信噪比S/N=3計(jì)算果糖、山梨醇、葡萄糖、蔗糖的檢出限,以信噪比S/N=10計(jì)算它們的定量限,標(biāo)準(zhǔn)曲線、回歸方程、相關(guān)系數(shù)及檢出限、定量限見表1.試驗(yàn)結(jié)果表明,果糖、山梨醇、葡萄糖和蔗糖在0.2~20 mg/mL范圍內(nèi),濃度與峰面積有良好的線性關(guān)系,相關(guān)系數(shù)達(dá)到了0.9999.
表1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍和檢出限、定量限Tab.1 Regression equations,correlation coefficients,linear ranges and detection limit,quantification limit for fructose,sorbitol,glucose and sucrose
在1.3.2色譜條件下,得到果糖、山梨醇、葡萄糖和蔗糖標(biāo)樣的色譜圖,相鄰峰均能達(dá)到完全分離 (見圖1).
圖1 果糖、山梨醇、葡萄糖和蔗糖的混標(biāo)色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram of the standard of mixed fructose,sorbitol,glucose and sucrose
取適量的樣品,按線性檢測(cè)范圍加入一定量的標(biāo)準(zhǔn)品,然后進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)[13],平行測(cè)定6次,結(jié)果如表2所示.結(jié)果表明,果糖、山梨醇、葡萄糖和蔗糖的回收率在97.07% ~100.11%,說(shuō)明該方法具有較高的準(zhǔn)確度.
平行測(cè)定6次,測(cè)定峰面積,通過(guò)計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差 (RSD)考察此方法的精密度,經(jīng)測(cè)定,果糖、山梨醇、葡萄糖、蔗糖峰面積的RSD分別為1.34%、1.26%、1.07%、0.79%,結(jié)果表明該方法的精密度良好.
按照1.2.2色譜條件分別對(duì)蓮霧果實(shí)、枇杷果實(shí)及柚子果實(shí)樣品進(jìn)行分析,測(cè)得采后蓮霧果實(shí)中的可溶性糖主要為果糖、葡萄糖和蔗糖,采后枇杷果實(shí)中的可溶性糖主要為果糖、山梨醇、葡萄糖和蔗糖,采后柚子果實(shí)中的可溶性糖主要為果糖、葡萄糖和蔗糖,樣品色譜圖見圖2—圖4,樣品中可溶性糖含量結(jié)果見表3.
表2 加標(biāo)回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差Tab.2 Spike recoveries and relative standard deviations in a real sample(n=6)
圖2 蓮霧果實(shí)樣品色譜圖Fig.2 HPLC chromatogram of Syzygium samarangense
圖3 枇杷果實(shí)樣品色譜圖Fig.3 HPLC chromatogram of Eriobotrya japonica(Thumb.)Lindl.
圖4 柚子果實(shí)樣品色譜圖Fig.4 HPLC chromatogram of Citrus grandis Osbeck
表3 果品中可溶性糖的含量Tab.3 The concentration of soluble sugar in fruits
葡萄糖、果糖、蔗糖、山梨醇在大部分果實(shí)所含的糖類組分中均占有較高的比例,它們直接影響到果實(shí)的感官品質(zhì).目前同時(shí)測(cè)定葡萄糖、果糖、蔗糖的方法報(bào)道較多,但利用HPLC-示差檢測(cè)器同時(shí)分離測(cè)定水果中葡萄糖、果糖、蔗糖和山梨醇的研究報(bào)道很少,本實(shí)驗(yàn)利用高效液相色譜-示差檢測(cè)器和酰胺柱成功地分離了水果中這4種糖和糖醇.與Kelebek Hasim等[14]、劉勝輝等[15]、孟伊娜等[16]的研究對(duì)比,這一方法簡(jiǎn)化了樣品前處理步驟,實(shí)現(xiàn)了4種糖和糖醇的同時(shí)分離測(cè)定.該方法的建立,不僅提高了檢測(cè)效率,也節(jié)省了分析時(shí)間.本方法可廣泛應(yīng)用于各類水果、蔬菜等所含的葡萄糖、果糖、蔗糖和山梨醇的同時(shí)分離測(cè)定.
本研究建立了用高效液相色譜法分離并測(cè)定果品中葡萄糖、果糖、蔗糖及山梨醇含量的方法體系,結(jié)果表明,該方法中4種糖的分離度均達(dá)到1.5以上,保留時(shí)間重現(xiàn)性較好,加標(biāo)回收率準(zhǔn)確性高,并且由于本研究中樣品前處理方法簡(jiǎn)便、快速,因此可作為分析檢測(cè)水果中可溶性糖組分和含量的一種簡(jiǎn)捷、準(zhǔn)確的方法.
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