杭白菊黃酮對(duì)高糖誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的影響

劉穎慧 周旦陽(yáng) 壽成珉 牟 新 浙江省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院內(nèi)分泌科 杭州 310003

·論 著·

杭白菊黃酮對(duì)高糖誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的影響

劉穎慧 周旦陽(yáng) 壽成珉 牟 新 浙江省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院內(nèi)分泌科 杭州 310003

目的探討杭白菊黃酮對(duì)高糖誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC）凋亡的影響，分析杭白菊黃酮對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的保護(hù)作用。方法HUVEC分正常對(duì)照組、高糖組（22mol/L）及低、中、高濃度杭白菊黃酮組（100、200、400mg/mL），作用24～72h后，顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)改變，MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力。結(jié)果不同濃度杭白菊黃酮組細(xì)胞存活率均顯著高于高糖組（P＜0.05，P＜0.01），尤以400mg/mL高濃度杭白菊黃酮組作用最為顯著（P＜0.01）。結(jié)論杭白菊黃酮對(duì)高糖誘導(dǎo)的HUVEC細(xì)胞凋亡有明顯的抑制作用，且存在劑量依賴(lài)性，對(duì)血管內(nèi)皮具有保護(hù)作用。

糖尿?。粌?nèi)皮細(xì)胞；杭白菊黃酮；細(xì)胞存活率

糖尿病是一種由復(fù)合病因引起的以高血糖為特征的代謝綜合征，發(fā)病機(jī)制尚未闡明。目前認(rèn)為與遺傳、環(huán)境及自身免疫等因素相關(guān)。糖尿病患者心血管并發(fā)癥的幾率是非糖尿病患者的2～4倍，而內(nèi)皮細(xì)胞凋亡是早期血管病變過(guò)程中重要的啟動(dòng)環(huán)節(jié)[1]。

糖尿病血管并發(fā)癥是患者致殘、致死的主要原因。目前已有實(shí)驗(yàn)證實(shí)血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷是形成糖尿病及其血管并發(fā)癥的基礎(chǔ)，保護(hù)血管內(nèi)皮成為預(yù)防并發(fā)癥的一個(gè)關(guān)鍵因素，深入認(rèn)識(shí)高糖在糖尿病血管病變中的作用，成為防治糖尿病血管病變的前提。研究藥物對(duì)血管內(nèi)皮的保護(hù)作用，對(duì)于防治糖尿病血管并發(fā)癥有著更積極的意義，本實(shí)驗(yàn)初步研究了杭白菊黃酮對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的作用，為杭白菊活性成分的開(kāi)發(fā)應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)與參考。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1主要試劑 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC）購(gòu)自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司；3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴鹽（MTT）、1640培養(yǎng)基、胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）和0.25%的胰蛋白酶含EGTA消化液購(gòu)自GIBCO公司；葡萄糖注射液購(gòu)自杭州市紅十字會(huì)醫(yī)院。

1.2藥 物 杭白菊水提取物（主要含黃酮）由浙江中醫(yī)藥大學(xué)發(fā)酵工程實(shí)驗(yàn)室提取。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（human umbilical vein endothelial cell，HUVEC）的培養(yǎng) HUVEC用含10%胎牛血清（FBS）1640培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每2天用含EDTA的胰蛋白酶消化傳代取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

2.2分 組 正常對(duì)照組：含10%胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）的1640培養(yǎng)基；高糖組：加入葡萄糖溶液使其在上述培養(yǎng)液中的終濃度為22mmol/L；低、中、高濃度黃酮組：在高糖組培養(yǎng)液基礎(chǔ)上分別加入100、200、400mg/mL濃度的杭白菊水提物。三組作用細(xì)胞24、48和72h后顯微鏡（200×）觀察細(xì)胞形態(tài)。

2.3MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HUVEC細(xì)胞按0.5×104/mL接種于96孔板內(nèi)，培養(yǎng)4h后，參照分組方案給藥。每24、48、72h，拍照并加MTT20μL/孔，10min后于570nm處，用酶標(biāo)儀測(cè)定OD值，存活率按照公式計(jì)算：存活率=給藥組OD值/正常值OD值

2.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（） 表示，應(yīng)用SPSS15.0統(tǒng)計(jì)軟件，兩兩比較采用配對(duì)樣本t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1形態(tài)學(xué)觀察 正常對(duì)照組細(xì)胞邊緣光滑、胞質(zhì)豐富、胞漿透亮；高糖組細(xì)胞數(shù)量減少，細(xì)胞出現(xiàn)明顯的皺縮、空泡等凋亡的典型表現(xiàn)。不同濃度黃硐組細(xì)胞數(shù)量恢復(fù)，細(xì)胞形態(tài)表現(xiàn)出明顯的好轉(zhuǎn)，高濃度黃酮組較正常組細(xì)胞數(shù)量增多，見(jiàn)圖1（插頁(yè)）。

3.2不同濃度杭白菊黃酮對(duì)細(xì)胞活力影響 高糖組HUVEC細(xì)胞存活率明顯低于正常對(duì)照組（P＜0.05），且隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)，存活率逐漸下降。黃酮組細(xì)胞存活率較高糖組明顯升高，且隨著杭白菊黃酮藥物濃度升高，各組細(xì)胞存活率也隨之逐漸升高，尤以400mg/mL濃度黃酮組作用最為顯著（P＜0.01），見(jiàn)表1。

4 討論

早在1997年就有學(xué)者提出內(nèi)皮不僅是屏障，更是一個(gè)具有代謝、分泌及免疫功能散布的異質(zhì)性動(dòng)力學(xué)器官。內(nèi)皮細(xì)胞損傷在心血管疾病的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用，血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡是許多心血管疾病的病理機(jī)制[2-3]。高糖可促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，而細(xì)胞凋亡在動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展中起著重要作用。

在糖尿病血管并發(fā)癥的病理過(guò)程中伴有氧化應(yīng)激。氧化應(yīng)激狀態(tài)是細(xì)胞凋亡發(fā)生的一個(gè)重要媒介[4]。許多凋亡刺激可使細(xì)胞內(nèi)活性氧基團(tuán)ROS產(chǎn)生或伴有氧化應(yīng)激。氧自由基直接參與細(xì)胞凋亡已在不同種類(lèi)的細(xì)胞中得到證實(shí)[5]，高糖環(huán)境下，增強(qiáng)的氧化應(yīng)激反應(yīng)被視為糖尿病血管并發(fā)癥的基礎(chǔ)。糖尿病患者的機(jī)體氧化應(yīng)激程度增強(qiáng)，抗氧化能力減弱[6]。許多凋亡的抑制劑具有抗氧化活性或加強(qiáng)細(xì)胞抗氧化能力。

菊花具有散風(fēng)清熱，平肝明目，清熱解毒功效，用于風(fēng)熱感冒、頭痛眩暈、目赤腫痛、眼目昏花、瘡癰腫毒等證[7]。杭白菊是浙江省馳名中外的地道藥材，是“浙八味”之一。研究證明[8]，杭白菊中含有多種黃酮類(lèi)化合物，主要成分有芹菜素、木犀草素、金合歡素、橙皮素、芹菜素-7-葡萄糖苷、木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖苷、金合歡素-7-葡萄糖苷、橙皮苷、棉花皮素五甲醚、5-羥-3′-4′-6，7-四甲氧黃酮等。進(jìn)一步研究表明，菊花的功效與其所含黃酮類(lèi)化合物密切相關(guān)。而木犀草素（Luteolin）7-O-β-D-葡萄糖苷和芹菜素（Apigenin），7-O-β-D-葡萄糖苷為菊花中主要的黃酮類(lèi)化合物，可在體內(nèi)水解生成效應(yīng)成分木犀草素和芹菜素。黃酮類(lèi)化合物是與人體密切相關(guān)的生理活性物質(zhì)，是許多藥用植物的主要活性成分[9]，具有抗氧化、抗腫瘤、抗病毒、抗心血管疾病和免疫調(diào)節(jié)等藥理作用。杭白菊提取物對(duì)血管平滑肌細(xì)胞有抑制凋亡、抗氧化作用，且隨著杭白菊提取液濃度的不斷增加，對(duì)血管平滑肌細(xì)胞凋亡的抑制作用及抗氧化作用也逐漸增強(qiáng)，呈濃度依賴(lài)性[10]。另有研究表明，杭白菊提取液可能在增強(qiáng)TRAIL誘導(dǎo)的大腸癌細(xì)胞凋亡作用中起著重要作用[11]。

本研究結(jié)果顯示，杭白菊黃酮或可通過(guò)抑制血

表1 杭白菊黃酮對(duì)高糖誘導(dǎo)的HUVEC細(xì)胞活力的影響（）

表1 杭白菊黃酮對(duì)高糖誘導(dǎo)的HUVEC細(xì)胞活力的影響（）

注：與正常對(duì)照組比較，*P＜0.05，與高糖組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01

管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，達(dá)到防治糖尿病血管病變的作用，為杭白菊的開(kāi)發(fā)和臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

［1］邱雅慧.血管內(nèi)皮細(xì)胞的功能以及損傷修復(fù)與動(dòng)脈粥樣硬化［J］.中國(guó)組織工程研究與臨床康復(fù)，2007，11（10）：1927-1929.

［2］Park S，Kim JA，Choi S，et al.Superoxide is a potential culprit of caspase-3 dependent endothelial cell death induced by lysophosphatidylcholine［J］.Physiol Pharmacol，2010，61（4）：375-381.

［3］Maceneaney OJ，Desouza CA，Weil BR，et al.Prehypertension and endothelial progenitor cell function［J］.Hum Hypertens，2010，25（1）：57-62

［4］Shen HM，Liu ZG.JNK signaling pathway si a key modulator in cell death mediated by reactive oxygen and nitrogen species［J］.Free Radical Biology&Medicine，2006，40（6）：928-939.

［5］Hwang HH，Moon PG，Lee JE，et al.Identification of the target proteina of rosiglitazone in 3T3-L1 adipocytes through proteomic analysis of cytosolic and secreted proteins［J］. Molcells，2011，31（3）：239-246.

［6］Pan HZ，Zhang H，Chang D，et al.The change of oxidative stress products in diabetes mellitus and diabetic retinopathy［J］.Br JO phthalmol，2008，2（4）：548-551.

［7］中華人民共和國(guó)藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典（一部）［S］.北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010：292.

［8］沈偉橋，孫海燕，汪俏梅，等.杭白菊生物活性成分及藥理研究進(jìn)［J］.茶葉，2006，32（3）：142-144.

［9］Anso E，Zuazo A，Irigoyen M，et al.Flavonoids inhibit hypoxia-induced vascular endothelial growth factor expression by a HIF-1 independent mechanism［J］.Biochemical Pharmacology，2010，79（11）：1600-1609.

［10］方雪玲，王錫田，黃淑如，等.杭白菊對(duì)小牛血管平滑肌細(xì)胞凋亡及其抗氧化性研究［J］.浙江大學(xué)學(xué)報(bào)（醫(yī)學(xué)版），2002，31（50）：346-350.

［11］胡文獻(xiàn)，毛偉芳，何超，等.杭白菊增強(qiáng)TRAIL基因誘導(dǎo)大腸癌細(xì)胞凋亡及機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究［J］.中國(guó)病理生理雜志，2006，22（4）：742-747.

Influence of Flavon from Chrysanthemum Morifolium on Apoptosis of HUVECs

LIU Yinghui，ZHOU Danyang，SHOU Chengmin，MOU Xin. Department of Endocrinology，Integrated Chinese and Western Medicine Hospital of Zhejiang Province，Hangzhou(310003)，China

ObjectiveTo investigate the influence of flavon from Chrysanthemum morifolium on the apoptosis of human umbilical vein endothelial cells（HUVECs）.MethodsHUVECs were treated with high glucose（22mol/L）and then with flavone from Chrysanthemum morifolium of different concentrations（100，200，and 400mg/mL）for 72h.The cell morphological changes were observed by microscope and cell proliferation was determined by MTT chromatometry.ResultsThe cell viability in flavon groups with different concentrations were higher than that in high glucose group（P＜0.05 or P＜0.01），with the most increase in 400mg/mL flavon group（P＜0.01）.ConclusionFlavonoids from Chrysanthemum morifolium can inhibit the high-glucose-induced apoptosis of HUVECs in a dosedependent manner.This indicated that flavon from Chrysanthemum morifolium have protective effects on HUVECs.

diabetic mellitus；endothelial cells；Chrysanthemum；cell viability

2013-11-20

修回日期：2014-04-10

浙江省醫(yī)藥衛(wèi)生科技計(jì)劃項(xiàng)目（No.2008A136）

劉穎慧，Tel：13116747582