不同濃度幽門螺桿菌對(duì)胃癌細(xì)胞增殖凋亡及FAF1 mRNA表達(dá)的影響

馮潔 劉愛群 袁燕玲 葛蓮英

作者單位：530021 南寧 廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院內(nèi)鏡室

臨床研究

不同濃度幽門螺桿菌對(duì)胃癌細(xì)胞增殖凋亡及FAF1 mRNA表達(dá)的影響

馮潔 劉愛群 袁燕玲 葛蓮英

作者單位：530021 南寧 廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院內(nèi)鏡室

目的 研究不同濃度幽門螺桿菌（helicobacter pylori，Hp）感染對(duì)人胃癌細(xì)胞HGC-27生長(zhǎng)及Fas相關(guān)因子1（fasassociated factor 1，F(xiàn)AF1）mRNA表達(dá)的影響，探討Hp致胃癌發(fā)生的分子機(jī)制。方法 人胃癌細(xì)胞HGC-27與不同濃度Hp標(biāo)準(zhǔn)菌株NCTC11637共培養(yǎng)24 h，根據(jù)感染復(fù)數(shù)（細(xì)胞/細(xì)菌比）分為1∶1共培養(yǎng)組、1∶50共培養(yǎng)組、1∶100共培養(yǎng)組、1∶200共培養(yǎng)組及對(duì)照組（未與Hp共培養(yǎng)），采用噻唑藍(lán)（MTT）比色法測(cè)定0 h、12 h、24 h、48 h的OD值，繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。共培養(yǎng)24 h后以流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率，實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）技術(shù)檢測(cè)HGC-27細(xì)胞FAF1 mRNA的相對(duì)表達(dá)量，比較不同濃度Hp感染前后FAF1 mRNA表達(dá)的變化。結(jié)果 經(jīng)革蘭氏染色及生化實(shí)驗(yàn)證實(shí)培養(yǎng)細(xì)菌為Hp。與對(duì)照組相比，共培養(yǎng)12 h時(shí)，1∶50共培養(yǎng)組細(xì)胞增殖活性升高（P＜0.05），1∶1共培養(yǎng)組、1∶100共培養(yǎng)組及1∶200共培養(yǎng)組細(xì)胞增殖活性低于對(duì)照組（P＜0.05）；共培養(yǎng)24 h、36 h、48 h時(shí)，各共培養(yǎng)組細(xì)胞增殖活性均低于對(duì)照組（P＜0.05）。共培養(yǎng)24 h時(shí)，1∶1共培養(yǎng)組及1∶50共培養(yǎng)組細(xì)胞凋亡率及FAF1 mRNA的相對(duì)表達(dá)量與對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＞0.05）；1∶100共培養(yǎng)組及1∶200共培養(yǎng)組細(xì)胞凋亡率明顯升高，F(xiàn)AF1 mRNA的相對(duì)表達(dá)量較對(duì)照組明顯降低（P＜0.05）。結(jié)論 Hp感染可導(dǎo)致胃癌細(xì)胞增殖凋亡失衡，下調(diào)胃癌細(xì)胞FAF1 mRNA的表達(dá)，F(xiàn)AF1 mRNA的表達(dá)量與Hp的感染濃度有關(guān)，F(xiàn)AF1 mRNA的表達(dá)下調(diào)可能是Hp致胃癌發(fā)生的機(jī)制之一。

胃腫瘤；Fas相關(guān)因子1；幽門螺桿菌；增殖；凋亡

Fas相關(guān)因子1（fas-associated factor 1，F(xiàn)AF1）是Fas死亡信號(hào)結(jié)合體的成員［1］，可以增強(qiáng)Fas介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡［2］，目前被認(rèn)為是一種腫瘤抑制基因［3］。有報(bào)道胃癌的發(fā)生與FAF1基因表達(dá)的下調(diào)有關(guān)［4］。幽門螺桿菌（helicobacter pylori，Hp）感染是胃癌發(fā)生的重要原因之一，其致胃癌發(fā)生的機(jī)制目前尚未明確。本課題組前期研究表明，Hp可能通過(guò)下調(diào)FAF1基因的表達(dá)而發(fā)揮致癌作用［5］。本研究通過(guò)在體外將人胃癌細(xì)胞HGC-27與不同濃度Hp共同培養(yǎng)，觀察Hp對(duì)FAF1基因mRNA表達(dá)的影響，為進(jìn)一步闡明Hp致胃癌發(fā)生的分子機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

Hp標(biāo)準(zhǔn)菌株NCTC11637購(gòu)自美國(guó)標(biāo)準(zhǔn)生物品收藏中心（ATCC）。人胃癌細(xì)胞HGC-27購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心。SYBR Master Mixture購(gòu)自Takara公司，噻唑藍(lán)（MTT）購(gòu)自Amserco公司，哥倫比亞瓊脂購(gòu)自北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司，5%脫纖維綿羊血購(gòu)自大連友康生物科技有限公司。氧化酶試紙購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司，革蘭氏染色液試劑盒購(gòu)自北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司，尿素酶試紙購(gòu)自北京炳洋科技有限公司。RevertAid First Strand cDNA試劑盒購(gòu)自Fermentas公司。

1.2 方法

1.2.1 Hp菌株的培養(yǎng)與鑒定 將Hp接種于含5%脫纖維綿羊血的哥倫比亞瓊脂平板上，置于5%O2、10%CO2、85%N2、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，接種72 h后觀察分離效果和菌落形態(tài)，革蘭氏染色鑒定是否為革蘭氏陰性桿菌，尿素酶和氧化酶試紙檢測(cè)生化反應(yīng)。

1.2.2 細(xì)胞與細(xì)菌共培養(yǎng) 將Hp培養(yǎng)72 h后收集細(xì)菌，用PBS稀釋制成細(xì)菌懸液，并在紫外分光光度計(jì)上測(cè)定細(xì)菌濃度（optical delnsity，OD），1 OD660=1× 108CFU/ml。將HGC-27細(xì)胞以8×105的密度接種于25 cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，與不同濃度的Hp在 37℃、5%CO2的CO2培養(yǎng)箱中共培養(yǎng)，按照感染復(fù)數(shù)（細(xì)胞/細(xì)菌比）分為對(duì)照組（未與Hp共培養(yǎng)）、1∶1共培養(yǎng)組、1∶50共培養(yǎng)組、1∶100共培養(yǎng)組及1∶200共培養(yǎng)組，收集細(xì)胞備用。

1.2.3 細(xì)胞增殖活性測(cè)定 細(xì)胞以每孔5×103的密度接種到96孔板中，與不同濃度Hp共培養(yǎng)0 h、12 h、24 h、36 h、48 h后棄去培養(yǎng)液，每孔加入5 g/ml MTT 20 μl，繼續(xù)孵育4 h，棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液，每孔加入DMSO 150 μl，振蕩10 min后在酶標(biāo)儀490 nm波長(zhǎng)處測(cè)量吸光度值。每組均設(shè)3個(gè)復(fù)孔，重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。

1.2.4 細(xì)胞凋亡率測(cè)定 各組細(xì)胞經(jīng)PBS清洗后，用不含EDTA胰酶消化，1 000 r/min離心收集細(xì)胞，加入結(jié)合緩沖液100 μl、Annexin V 2 μl和PI 2 μl孵育15 min，隨機(jī)選取1×104個(gè)細(xì)胞以流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果以細(xì)胞凋亡率表示。每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。

1.2.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè) 所有共培養(yǎng)的細(xì)胞用PBS洗滌3次，Trizol提取細(xì)胞總RNA。取總RNA 1 μg按照Fermentas試劑說(shuō)明書的方法逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。PCR引物設(shè)計(jì)：FAF1上游引物為 5′-CTTGCTGAATCAGGGCTCTC-3′，下游引物為5′-TCCACCCCAAATTCTGTAGC-3′，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為164 bp。β-actin上游引物為5′-ACCGAGCGCGGCTACAGC-3′，下游引物為5′-CTCATTGCCAATGGTGAT-3′，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為180 bp。PCR反應(yīng)體系如下：cDNA 1 μl，SYBR Master Mixture 12.5 μl，上下游引物各0.75 μl，水9 μl。以β-actin作為內(nèi)參。PCR反應(yīng)條件：95℃30 s預(yù)變性，95℃5 s變性，58℃30 s退火及延伸，循環(huán)35次。每份樣本均根據(jù)β-actin的拷貝數(shù)進(jìn)行校正并計(jì)算FAF1 mRNA相對(duì)表達(dá)量。FAF1 mRNA相對(duì)表達(dá)量=2-△△Ct，△△Ct值=（樣品Ct值-樣品內(nèi)參照Ct值）-（對(duì)照樣品Ct值-對(duì)照樣品內(nèi)參照Ct值）。每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（s）表示。多個(gè)樣本組間的比較采用方差分析，方差齊用LSD-t檢驗(yàn)，方差不齊用Dunnett方法。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Hp鑒定結(jié)果

結(jié)果觀察到劃線接種的Hp呈透明針尖樣透明菌落，接種菌較多時(shí)可見菌苔；革蘭氏染色見革蘭氏陰性海鷗狀、S狀彎曲菌和短桿菌；尿素酶試驗(yàn)（尿素酶試紙由黃色轉(zhuǎn)為紅色）和氧化酶試驗(yàn)（氧化酶試紙由無(wú)色變?yōu)樗{(lán)黑色）陽(yáng)性即鑒定為Hp。見圖1。

2.2 HGC-27細(xì)胞與不同濃度Hp共培養(yǎng)后的細(xì)胞增殖活性

HGC-27細(xì)胞與Hp共培養(yǎng)0 h時(shí)，各培養(yǎng)組細(xì)胞增殖活性與對(duì)照組相同，各組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=6.012，P＞0.05）。共培養(yǎng)12 h時(shí)，1∶50共培養(yǎng)組細(xì)胞增殖活性高于對(duì)照組（P＜0.05），其余各組細(xì)胞增殖活性低于對(duì)照組（F=759.642，P＞0.05）。共培養(yǎng)24 h、36 h、48 h時(shí)，各共培養(yǎng)組細(xì)胞增殖活性均低于對(duì)照組（F=6181.255、3362.000、600.686，P均＜0.05）。見表1、圖2。

圖1 Hp培養(yǎng)及其鑒定結(jié)果

圖2 HGC-27細(xì)胞與不同濃度Hp共培養(yǎng)后的生長(zhǎng)曲線變化

表1 HGC-27細(xì)胞與不同濃度Hp共培養(yǎng)后不同時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞增殖活性（s）

表1 HGC-27細(xì)胞與不同濃度Hp共培養(yǎng)后不同時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞增殖活性（s）

與對(duì)照組相比，*P＜0.05。

組別 0 h 12 h 24 h 36 h 48 h 1:1共培養(yǎng)組 0.185±0.003 0.283±0.005*0.390±0.018*0.421±0.009*0.656±0.011*1:50共培養(yǎng)組 0.189±0.019 0.395±0.004*0.419±0.003*0.453±0.008*0.630±0.020*1:100共培養(yǎng)組 0.184±0.006 0.218±0.004*0.239±0.006*0.292±0.012*0.389±0.006*1:200共培養(yǎng)組 0.156±0.008 0.161±0.011*0.186±0.015*0.196±0.002*0.231±0.005*對(duì)照組 0.168±0.006 0.345±0.004 0.647±0.046 0.888±0.004 0.933±0.035

2.3 HGC-27細(xì)胞與不同濃度Hp共培養(yǎng)24 h后細(xì)胞凋亡率情況

HGC-27細(xì)胞與Hp共培養(yǎng)24 h時(shí)，1∶1共培養(yǎng)組及1∶50共培養(yǎng)組細(xì)胞凋亡率分別為（2.667±1.518）%和（7.300±1.664）%，與對(duì)照組的（1.867±0.577）%比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=32.141，P均＞0.05）；1∶100共培養(yǎng)組和1∶200共培養(yǎng)組細(xì)胞凋亡率分別為（11.267±4.671）%和（30.067±5.907）%，均高于對(duì)照組（P均＜0.05）。見圖3。

2.4 HGC-27細(xì)胞與不同濃度Hp共培養(yǎng) 24 h后FAF1 mRNA的表達(dá)

Hp感染濃度為1∶1時(shí)，F(xiàn)AF1 mRNA的相對(duì)表達(dá)量為0.63±0.41，與對(duì)照組的表達(dá)量0.97±0.19比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。感染濃度為1∶50時(shí)，F(xiàn)AF1 mRNA的相對(duì)表達(dá)量為2.39±1.61，較對(duì)照組有所上調(diào)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。當(dāng)Hp感染濃度為1∶100及1∶200時(shí)，F(xiàn)AF1 mRNA的相對(duì)表達(dá)量分別為0.50±0.20和0.17±0.14，均較對(duì)照組降低（P均＜0.05）。見圖4。

圖3 HGC-27細(xì)胞與不同濃度Hp共培養(yǎng)24 h后的細(xì)胞凋亡率

圖4 HGC-27細(xì)胞與不同濃度Hp共培養(yǎng)24 h后FAF1 mRNA的相對(duì)表達(dá)量

3 討論

Hp感染與胃癌的發(fā)生有關(guān)，是胃癌發(fā)生的一類致癌原［6］，這一結(jié)論已被公認(rèn)，然而目前對(duì)Hp致癌的具體機(jī)制仍未闡明。在胃黏膜的癌變過(guò)程中，凋亡和增殖調(diào)控紊亂起重要作用［7，8］，因此凋亡相關(guān)基因在胃癌發(fā)生中的作用日益受到重視。

FAF1是Fas死亡信號(hào)結(jié)合體的成員之一［1］，大量的研究表明FAF1是一種促細(xì)胞凋亡的基因。其促細(xì)胞凋亡的機(jī)制包括FAF1序列本身含有類似泛素的序列結(jié)構(gòu)，F(xiàn)AF1的過(guò)度表達(dá)可以抑制泛素蛋白降解和細(xì)胞死亡增加［9］；FAF1可以與蛋白激酶CK2組成復(fù)合物影響細(xì)胞凋亡［10，11］；負(fù)調(diào)節(jié)NF-κB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑［12，13］、上調(diào) caspase-8［14］可促進(jìn)細(xì)胞凋亡。Bj?rling-Poulsen等［4］對(duì)各種不同腫瘤組織用Western blot法檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)FAF1在胃癌組織中特異性低表達(dá)，提示FAF1可作為胃癌特殊的診斷標(biāo)志物。Hyland等［15］研究中國(guó)中北部人群中Fas途徑相關(guān)基因的SNPs時(shí)發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)AF1的表達(dá)與胃賁門腺癌和非賁門腺癌的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)。但目前FAF1與胃癌及胃癌常見病因Hp感染的關(guān)系國(guó)內(nèi)外鮮有報(bào)道。

本課題組的前期組織學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，Hp感染胃黏膜FAF1 mRNA的表達(dá)明顯低于無(wú)Hp感染的胃黏膜［16］，提示Hp感染與胃組織FAF1 mRNA的表達(dá)水平有關(guān)。本研究進(jìn)一步在細(xì)胞水平上研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)Hp感染胃癌細(xì)胞時(shí)，低濃度菌液對(duì)胃癌細(xì)胞的增殖凋亡或無(wú)影響（感染復(fù)數(shù)為1∶1），或促進(jìn)胃癌細(xì)胞增殖（感染復(fù)數(shù)為1∶50）。隨著Hp感染濃度升高和時(shí)間延長(zhǎng)，細(xì)胞增殖受到抑制，細(xì)胞凋亡增加，與王芬等［17］的研究結(jié)果一致。此外，隨著Hp感染濃度的變化，F(xiàn)AF1 mRNA的表達(dá)也呈不同的變化，提示Hp對(duì)FAF1 mRNA表達(dá)的調(diào)節(jié)與其濃度有關(guān)。極低濃度時(shí)FAF1 mRNA的表達(dá)量與對(duì)照組無(wú)差異，低濃度時(shí)由于刺激細(xì)胞增殖，反應(yīng)性FAF1 mRNA的表達(dá)升高。隨著Hp感染濃度的升高，細(xì)胞凋亡增加，最終表現(xiàn)為對(duì)FAF1 mRNA表達(dá)的下調(diào)。提示Hp感染可能是引起胃癌細(xì)胞FAF1 mRNA表達(dá)下調(diào)的原因。推測(cè)體內(nèi)的Hp感染是一個(gè)慢性過(guò)程，隨著Hp感染時(shí)間的延長(zhǎng)，促凋亡基因FAF1 mRNA的表達(dá)逐漸下調(diào)，細(xì)胞凋亡受到抑制；另一方面細(xì)胞代償性增殖，當(dāng)代償性增殖的細(xì)胞數(shù)量超過(guò)凋亡的細(xì)胞數(shù)量后，過(guò)度增殖的胃黏膜上皮細(xì)胞可以逃逸Fas途徑的凋亡，最終可能導(dǎo)致癌癥的發(fā)生。

綜上所述，Hp感染可導(dǎo)致胃癌細(xì)胞增殖、凋亡失衡，下調(diào)胃癌細(xì)胞FAF1 mRNA的表達(dá)。FAF1 mRNA的表達(dá)量與Hp感染的濃度有關(guān)，其下調(diào)可能是Hp致胃癌發(fā)生的機(jī)制之一。未來(lái)進(jìn)一步研究FAF1基因的功能和作用機(jī)制，明確Hp感染下調(diào)FAF1基因的表達(dá)對(duì)相關(guān)下游通路的影響，或許有助于更進(jìn)一步闡明Hp的致癌機(jī)制，為胃癌的治療提供新的方向。

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［2014-02-28收稿］［2014-08-20修回］［編輯 羅惠予］

Effects of different Helicobacter pylori loads on proliferation，apoptosis and FAF1 mRNA expression in gastric cancer cells

FENG Jie，LIU Ai-qun，YUAN Yan-ling，GE Lian-ying（Department of Endoscopy，Affiliated Tumor Hospital of Guangxi Medical University，Nanning 530021，P.R.China）

GE Lian-ying.E-mail：gelianying2008@163.com

Objective To explore the molecular involvement of Helicobacter pylori in gastric cancer by examining the effects of different H.pylori loads on proliferation，apoptosis and FAF1 mRNA expression in gastric cancer cells.Method Human gastric carcinoma HGC-27 cells were co-cultured with different amounts of standard H.pylori strain NCTC11637；multiplicities of infection（MOIs，bacteria/cells）were 0，1，50，100 and 200.H.pylori was identified based on Gram staining and biochemical tests.Cancer cell proliferation was measured using the thiazolyl blue（MTT）assay after 0，12，24，36 and 48 h of co-culture.After 24 h co-culture，apoptosis in the cancer cells was measured using flow cytometry，and FAF1 mRNA expression was quantitated using fluorescent real-time quantitative RT-PCR.Expression of the β-actin gene was used as a reference for normalizing FAF1 mRNA expression levels.Results After 12 hco-culture，cancer cell proliferation at MOI 50 was significantly greater than at MOI 0（P＜0.05），whereas proliferation at other MOIs was lower than at MOI 0（P＜0.05）.After co-culture for 24，36 and 48 h，cancer cell proliferation at all MOIs was significantly lower than at MOI 0（P＜0.05）.After 24 h co-culture，apoptosis levels and relative FAF1 mRNA expression were similar at MOIs 0，1，and 50（P＞0.05）.In contrast，apoptosis levels were significantly higher and relative FAF1 mRNA expression significantly lower at MOIs 100 and 200 than at MOI 0（P＜0.05）.Conclusion H.pylori infection can suppress proliferation，promote apoptosis and down-regulate FAF1 mRNA expression in gastric cancer cells.Down-regulation of FAF1 mRNA by H.pylori may lead to gastric cancer.

Gastric neoplasm；Fas-associated factor 1；Helicobacter pylori；Proliferation；Apoptosis

R735.2

A

1674-5671（2014）04-05

10.3969/j.issn.1674-5671.2014.04.10

廣西自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（2012GXNSFDA053021）

葛蓮英。E-mail：gelianying2008@163.com